乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究现状

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)DNA疫苗是指通过克隆HBV抗原基因,并将其插入真核表达载体构建而成的重组DNA分子。通过皮下、肌肉注射或颗粒轰击技术将重组DNA分子导人体内,使目的基因在体内表达,从而诱导机体产生针对此种抗原的体液免疫和细胞免疫。     

乙型肝炎病毒DNA定量与血清病毒标志物的关系

对538例慢性乙型肝炎病毒标志物(HBV M)与HBV DNA之间的关系，进行如下分析。     

酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒 DNA 聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨 TP 的生物学功能。方法酵母双杂交相关实验材料购自美国 Clontech公司,其中 pACT2为人肝配合表达的 cDNA 文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为 HL4024AH。pGBKT7-53和 pGADT7-T 中的 p53和大 T 抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam 中的 Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照。含有 AF384372 HBV DNA P 全基因组 cDNA 的质粒 G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存。TP 基因的上下游引物序列分别为:5′-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTFA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶 EcoRI 和 BamHI 的酶切位点。引物合成及 DNA 测序由上海博亚公司完成。用聚合酶链反应(PCR)技术扩增 TP片段,连接人酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞 AH109并在其内表达,挑取在 SD/-Trp 培养基上的转化子-即 pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×10~9个细胞/ml),与转化了人肝 cDNA 文库质粒 pACT2的酵母细胞 Y187配合,生长6～18 d 后把长出的>2 mm 的酵母集落,在铺有 X-α-gal 的 QDO 培养基上检查α-gal 活性,蓝色菌落为真阳性集落。挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的 SOB 平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序。提交 GenBank 分析。结果成功得到47个与 TP 特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein)。筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP 糖基转移酶1家族多肽 A9;CD14抗原;B 糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW 域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S 蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素 E 亚基;Z 蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆 RP11-107P7;RNA 聚合酶Ⅱ亚单位 hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白 L 链。19个假设蛋白的同源性在97%～100%。结论 TP 蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗Ⅰ期临床研究进展

1990年Wolff等发现DNA免疫后 ,标志着新的疫苗革命即将来临。DNA疫苗与传统疫苗相比有诸多优点 ,尤其是其可诱导特异性CTL反应的能力 ,使它在抗细胞内感染中独具优势。 1993年Davis等[1] 开展了HBV基因免疫的研究 ,但由于安全性、耐受性及有效性等顾虑 ,多年来HBVDNA免疫的研究仅限于动物实验。 1999年Tacket等[2 ] 率先报道HBVDNA疫苗Ⅰ期临床试验获得较好的结果 ,标志着HBVDNA疫苗已从实验研究逐步走向临床应用。本文就HBVDNA疫苗临床研究现状进行综述。1　临床研究对象入选研究对象主要为健康青、中年志愿者 ,性别分布无…     

应用基因芯片技术对乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节基因的研究

目的应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBVDNAP)三个功能域[(N末端蛋白(TP),逆转录酶DNA多聚酶(PR),核糖核酸酶H(RNaseH)]的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明HBVDNAP对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法以常规分子生物学技术分别构建真核表达载体pcDNA3.1()TP,pcDNA3.1()PR和pcDNA3.1()RNaseH,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1()的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果TP有111条基因表达水平上调,88条基因表达水平下调。PR有79条基因表达水平上调,90条基因表达水平下调。RNaseH有113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调。结论应用基因芯片成功筛选HBVDNAP三个功能域蛋白转染细胞后的差异表达基因,为进一步研究HBVDNAP的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。     

乙型肝炎病毒DNA水平与临床的相关性分析

通过建立的定量聚合酶链反应(PCR)，对乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量水平与慢性乙型肝炎患者的HBV标志物表达模式、肝功能、肝内炎症及肝纤维的相互关系进行探讨。     

定量检测慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒DNA的临床价值

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者肝内乙型肝炎病毒(HBV)DNA载量与血清HBV DNA、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)水平的相关性及其在抗病毒治疗中的意义.方法41例HBeAg阳性CHB患者,在干扰素α和拉米夫定联合治疗前进行肝穿刺,取肝组织分别进行HBV DNA检测及组织学检查,据肝组织HBVDNA载量小于等于或大于104fg/cm3将其分为两组,治疗前及治疗期间监测其肝功能、血清HBeAg及HBV DNA情况.结果(1)肝组织HBV DNA载量高于血清HBV DNA载量(对数值4.081±1.127与3.163±1.010,t=2.218,P＜0.05),二者高度相关(r=0.840,t=4.322,P＜0.001);肝组织HBV DNA载量与血清HBeAg亦呈正相关(r=0.459,t=3.056,P＜0.005).(2)肝组织HBV DNA载量与肝组织炎症活动度呈反向关系(x2=3.874,P＜0.05).(3)治疗期间两组患者血清HBV DNA水平均明显下降,治疗前肝组织HBV DNA水平低者效果较好;治疗1年时HBeAg、抗-HBe血清转化率以肝组织HBV DNA水平低者为高(HBeAg转阴率68.4%与36.4%,x2=4.194,P＜0.05;抗-HBe阳转率73.7%与40.9%,x2=4.447,P＜0.05).结论肝组织HBV DNA水平较血清HBV DNA、HBeAg水平更能准确反映肝组织HBV DNA复制情况,且能间接反映机体的免疫状态,可作为抗病毒治疗适应证选择及疗效预测因子.     

定量PCR检测血清中乙型肝炎病毒DNA及其意义

目的检测血清中乙型肝炎病毒DNA拷贝数,并了解HBV感染的不同血清学指标组合相应的HBV DNA含量分布,以指导临床。方法 采用定量PCR和定性PCR方法,检测216份不同临床类型血清标本的HBV DNA,再用ELISA方法测定HBV-M,统计不同免疫指标组合的HBV DNA平均含量。结果病毒量分为高、中、低三度,大于107拷贝mL-1为高滴度:107-105拷贝mL-1为中等滴度;105拷贝mL-1以下为低滴度。60例HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)血清,HBV DNA全部阳性,平均含量为1.9×108拷贝mL-1。51例HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)血清,HBV DNA平均含量为5.4×106拷贝mL-1;33例HBsAg(+)HBeAb(+)血清,HBV DNA平均含量为7.5×105拷贝mL-1;114例HBsAb(+)HBeAb(+)HBeAb(+)血清,HBV DNA平均含量为1.8×105拷贝mL-1。定性和定量PCR阳生率分别为59.3％和61.6％。两种方法相对符合率为94.5％。结论定量PCR可真实反应HBV感染、复制及病程变化,对乙型肝炎临床诊断及治疗均有较大的指导意义。     

抗-HBs阳性者血清乙型肝炎病毒DNA检测的价值

有研究表明抗-HBS的出现并不标志乙型肝炎病毒(HBV)复制的停止。套式聚合酶链反应(PCR)既能保持常规PCR的特异性又能提高检测灵敏度,因而受到关注。 一、资料与方法     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的扩增与清除动力学

HBV基因组是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)分子,其两条链均不闭合,在病毒的复制过程中,病毒DNA进入宿主细胞核,两条链的缺口被补齐,形成超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently dosed circular DNA,cccDNA).cccDNA是HBV在肝内进行复制的原始模板,虽然其含量较少,但对病毒在宿主细胞内感染状态的建立以及维持病毒在细胞内的复制过程具有十分重要的意义.     

乙肝肝硬化血清透明质酸与HBV DNA的相关性

目的:探讨乙肝肝硬化患者血清透明质酸与HBV DNA水平的相关性.方法:收集乙肝肝硬化患者144例,其中女性42例,男性102例,平均年龄(54.42±11.53)岁,Child pugh A级42例,Child pugh B级40例,Child pugh C级62例,采用放射免疫法检测血清透明质酸,荧光定量PCR检测血清HBV DNA水平,对血清透明质酸、血清HBV DNA水平进行统计并分析两者之间的关系.结果:随着乙肝肝硬化Child分级的加重,患者的血清透明质酸水平也增高,不同分级之间的差异有统计学意义(174.10μg/L±127.98μg/Lvs421.35μg/L±176.96μg/Lvs903.58μg/L±212.02μg/L,P<0.01).不同Childpugh分级患者的血清HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05).不同Child pugh分级患者的血清HBV DNA和透明质酸水平无显著相关性(P>0.05).结论:随着患者的Child pugh分级升高,HA水平显著增高,说明HA是反映肝硬化程度的敏感指标;乙肝肝硬化患者HBV DNA与肝硬化程度无显著相关,血清透明质酸与HBV DNA水平之间也无显著相关性,因此抗病毒和抗纤维化治疗对乙肝肝硬化患者同等重要.     

乙型肝炎患者血清前S1抗原和HBV DNA与肝功能的关系探讨

目的探讨乙型肝炎病毒前S1抗原(PreS1)及HBV-M和HBV DNA与肝功能检测间的关系。方法对576例血清标本进行PreS1及HBV-M和HBV DNA及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)同步检测。结果PreS1、HBV DNA阳性率分别为72.05%和61.81%,两者符合率达74.65%;在HBsAg(-)和正常对照组PreS1、HBV DNA均为阴性;在HBsAg、HBeAg与HBsAg、抗-HBe、抗-HBc和HBsAg、抗-HBc三种阳性模式组中,PreS1阳性率(87.25%、55.71%、68.21%)、HBV DNA阳性率(94.02%、29.29%、45.66%)在各组中相互比较差异均有显著性(P均<0.005);PreS1与HBV DNA阳性符合率为92.03%、53.57%、68.21%,差异有显著性(P<0.05);PreS1阳性组和PreS1阴性组ALT、AST异常率相比,差异有显著性(P<0.05)。结论PreS1主要存在于HbsAg阳性携带者中,且与HBeAg、HBV DNA关系密切,是反映HBV复制及传染性的又一血清学指标,同时PreS1阳性还与肝功能损害有关。PreS1联合HBV-M及HBV DNA和肝功能同步检测具有重要的临床意义。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立快速、特异、灵敏的碱性磷酸酶直接(AlkPhos Direc)标记核酸探针检测血清中乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)方法。方法 应用 AlkPhos DirecTM将碱性磷酸酶直接标记在HBV DNA全基因序列上制备探针,与目标核酸杂交后加入CDP-Star化学发光试剂,用胶片放射自显影检测HBV DNA。同时检测探针的灵敏度和特异性。比较AlkPhos Direc标记HBV DNA探针与地高辛标记的HBV DNA探针检测临床血清标本80份结果,并对70份临床血清标本的荧光定量PCR方法检测的结果与AlkPhos Direc标记HBV DNA探针斑点杂交检测的结果作相关性分析。结果 探针灵敏度至少为10pg,与地高辛探针比较,用AlkPhos Direct标记探针检测方法的灵敏度为100％,特异性为100％,符台率为100％,用HBV DNA荧光定量PCR方法和AlkPhos Direct标记探针核酸斑点定量方法检测的结果进行相关性比较,r=0.98,P<0.01。结论 AlkPhos Direc标记 HBVDNA探针检测血清中HBV DNA方法灵敏、特异,与地高辛标记的HBV DNA探针检测结果完全符合,与HBVDNA荧光定量PCR方法硷侧的结果有良好的相关性。     

Comparison of Abbott and Da-an real-time PCR for quantitating serum HBV DNA

AIM: To compare the performance of the Da-an real-time hepatitis B virus (HBV) DNA assay and Abbott RealTime HBV assay.METHODS: HBV DNA standards as well as a total of 180 clinical serum samples from patients with chronic hepatitis B were measured using the Abbott and Da-an real-time polymerase chain reaction (PCR) assays. Correlation and Bland-Altman plot analysis was used to compare the performance of the Abbott and Da-an assays. The HBV DNA levels were logarithmically transformed for analysis. All statistical analyses were performed using SPSS for Windows version 18.0. The correlation between the two assays was analyzed by Pearson’s correlation and linear regression. The Bland-Altman plots were used for the analysis of agreement between the two assays. A P value of < 0.05 was considered statistically significant.RESULTS: The HBV DNA values measured by the Abbott or Da-an assay were significantly correlated with the expected values of HBV DNA standards (r = 0.999, for Abbott; r = 0.987, for Da-an, P < 0.001). A Bland-Altman plot showed good agreement between these two assays in detecting HBV DNA standards. Among the 180 clinical serum samples, 126 were quantifiable by both assays. Fifty-two samples were detectable by the Abbott assay but below the detection limit of the Da-an assay. Moreover, HBV DNA levels measured by the Abbott assay were significantly higher than those of the Da-an assay (6.23 ± 1.76 log IU/mL vs 5.46 ± 1.55 log IU/mL, P < 0.001). A positive correlation was observed between HBV DNA concentrations determined by the two assays in 126 paired samples (r = 0.648, P < 0.001). One hundred and fifteen of 126 (91.3%) specimens tested with both assays were within mean difference ± 1.96 SD of HBV DNA levels.CONCLUSION: The Da-an assay presented lower sensitivity and a narrower linear range as compared to the Abbott assay, suggesting the need to be improved.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA套式-实时荧光定量聚合酶链反应的建立

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的套式一实时荧光定量PCR法.方法 根据HBV cccDNA与松环DNA(rcDNA)结构上的差异,设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺口下游的特异TaqMan荧光探针.根据Plasmid-SafeTM ATP-Dependent Dnasc(PSAD)对rcDNA与cccDNA作用的不同,对模板DNA进行酶切纯化,降解reDNA,再进行套式PCR扩增,先用外引物和模板进行第一轮常规PCR,再用内引物、荧光探针和第一轮PCR产物进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照标准品,得出待检标本定量值.结果 检测阳性参照标准品.得出该方法灵敏度可达2 lg拷贝/mL.用上述方法检测34份乙型肝炎患者血清HBV DNA阳性标本,25份血清HBVcccDNA阳性,28份外周血单个核细胞HBV cccDNA阳性.27份健康对照者血清HBV DNA阴性标本,6份HBV cccDNA阳性.对5份HBV cccDNA阳性标本扩增产物进行克隆测序,无碱基缺失、突变.与HBV不同基因型序列(A～G)比较,同源性为90.6%～99.1%,其中,与B、C基因型同源性为95.3%～99.1%,验证了方法的特异度.结论 套式-实时定量PCR法可检测乙型肝炎患者血清、PBMC中的HBV CCCDNA,且具有敏感、特异性.     

孕妇血清HBV DNA定量检测的临床意义

目的:探讨HBV DNA定量检测在乙型肝炎病毒宫内感染监测中的临床意义。方法:将134例HBsAg(+)孕妇及其所生婴儿作为研究对象,按孕妇HBsAg定性结果分为阳性组和阴性组。孕妇产时取血;新生儿出生2小时内取血,并注射高效价乙肝免疫球蛋白(HBIG)及乙肝疫苗,于7、12月龄时再分别取血留检。采用英国罗氏公司生产的Light Cycler Quantification直接进行ABV DNA定量测定,同时与HBsAg和HBV DNA定性检测结果比较。结果:HBsAg阴性组中依然有17.0％的病例HBV DNA定性阳性,且HBV DNA定量均值与阳性组比较无统计学差异(P>0.05);新生儿血清HBV DNA阳性病例的母亲血清HBV DNA定量均值明显高于阴性病例(P<0.01);HBVDNA阳性的新生儿母婴阻断成功率明显降低(P<0.01)。结论:用分子生物学技术证明孕期HBV DNA定量检测是监测HBV宫内感染程度的可靠方法。     

Establishment of the first World Health Organization International Standard for human parvovirus B19 DNA nucleic acid amplification techniques

BACKGROUND AND OBJECTIVES: A collaborative study, involving 26 laboratories from 14 countries, was carried out in order to establish a World Health Organization (WHO) International Standard for human parvovirus B19 (B19) DNA nucleic acid amplification techniques (NAT). MATERIALS AND METHODS: Four samples: AA, BB (which were lyophilized), CC and DD (which were liquid preparations) were analysed using several different NAT assays. The mean B19 DNA content of each sample was determined for each laboratory using an end-point dilution method. RESULTS: There was good agreement between the overall mean 'equivalents'/ml obtained by the different assays. The mean log(10) 'equivalents'/ml were 5.76 for sample AA, 5.73 for sample BB, 5.82 for sample CC and 7.70 for sample DD. The differences in titre among samples AA, BB and CC were not statistically significant, but the titre of DD was significantly higher. CONCLUSIONS: Despite the range of NAT assays used in the study, it was possible to calculate the mean B19 DNA concentrations in the four preparations. Lyophilized preparation AA was established as the first International Standard for B19 DNA NAT assays and was assigned a concentration of 10(6) international units (IU)/ml.     

慢性乙型肝炎干扰素治疗前后血清中HBV DNA定量检测及肝组织学变化

目的　探讨α 2b干扰素治疗慢性乙型肝炎前后肝组织学的变化及对血清HBVDNA滴度的影响。方法　对 2 1例慢性乙型肝炎患者于治疗前及治疗结束后 1周进行肝穿刺活检 ,用Knodell方法 (HAI)对治疗前后肝组织学进行评分 ,采用定量PCR方法检测血清中HBVDNA拷贝 ,免疫组织化学检测肝组织中HBsAg、HBcAg表达。结果　治疗前后血清中HBVDNA定量 (log值 )分别为 8 2 84± 0 .68,7.3 3 8± 1.12 (P <0 .0 1) ;肝组织学HAI计分治疗前后分别为 9.73 8± 3 .46,7.42 9± 3 .47(P <0 .0 5 ) ;肝组织中HBcAg于治疗后 10例转为阴性 (10 /2 1)占 47 61%。血清e抗原阴转率为 5 7 14 %。结论　α 2b干扰素对HBVDNA有显著的抑制作用 ,明显降低血清HBVDNA水平 ,并能明显改善慢性乙型肝炎肝组织的炎症及坏死程度。