酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白。方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7。在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7-MHBs-mut。Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白。酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C-Jun结合蛋白1,c-Jun-activation-domain binding protein 1,JAB1)。结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因

乙型肝炎病毒(HBV )的慢性感染是引发肝细胞癌的主要危险因子,HBV诱导细胞恶性化的发病机制还未完全弄清,已有许多研究提示HBVX蛋白(HBxAg)对多种增强子及启动子有反式激活作用[1,2 ] ,在HBV诱导肝细胞癌的发生中起着重要作用。筛选肝细胞中与HBxAg结合的蛋白对探讨HBV致癌的细胞效应机制提供了重要线索。材料与方法一、材料及主要试剂AH10 9酵母菌株、预转化的cDNA肝文库(Y187)、pGBKT7 BD克隆载体及酵母YPD培养基、SD培养基、X αgal购于Clontech公司。大肠埃希菌DH5α及HBVayw亚型基因全序列质粒载体pCP10为本室保存…     

酵母双杂交法对HBV表面抗原主蛋白候选结合蛋白的筛选

目的:自肝细胞cDNA文库中筛选与HBV主蛋白(SHBs)相互作用的蛋白基因,探讨主蛋白的生物学功能.方法:利用PCR扩增S主蛋白基因,定向克隆技术将靶基因克隆到pDEST32构建出S主蛋白的诱饵质粒:Western blot方法验证转化诱饵质粒的酵母细胞表达SHBs:将诱饵质粒与人肝cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,在营养缺陷型培养基和X-gal上进行三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母茵落的猎物质粒进行DNA测序;利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.结果:构建S主蛋白及肝文库酵母细胞表达载体,进行酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,筛选出既能在缺陷培养基也能在X-gal的检测下变成蓝色的真阳性菌落3个,分别为核糖体蛋白L3、微管蛋白α-1a和α-2巨球蛋白.结论:用酵母双杂交技术筛选出3个与SHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,提示SHBs可能参与到肝细胞内部的多种生物学反应.     

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的：寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白，进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用，阐明其分子作用机制。方法：应用酵母单杂交体系，以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”，对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选，应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果：共获得了12个双阳性克隆，编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白，其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论：这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合，可能是作用于SPⅠ的反式作用因子，但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用，笔者正进行进一步的研究。     

酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白相关蛋白

目的 利用酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1(PreS1)蛋白相关蛋白,进一步探讨PreS1在乙型肝炎病毒(HBV)人胞中的作用机制。方法 以HBV DNA阳性血清为模板扩增含EcoRⅠ与PstⅠ酶切位点的PreS1基因序列,pAS2—1载体及PreS1基因PCR产物经双酶切并连接,对饵载体pAS2—1—PreS1进行序列测定;将pAS2—1—PreS1转化入酵母菌AH109,以western blot法证实其在酵母细胞中的表达。将pAS2—1—PreS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养、LacZ活性测定筛选阳性菌落,分离实验及交合实验排除假阳性,扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定,结果提交BLAST程序,在GenBank数据库查询其同源序列。结果 饵载体pAS2—1—PreS1经序列测定含有完整的PreS1基因片段,western blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的PreS1—BD融合蛋白。pAS2—1—PreS1与正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养共长出97个菌落,筛选出1个阳性克隆,其PCR扩增产物经GenBank数据库查询与人类初期多肽相关复合体α亚单位(NACA)高度同源。结论 成功构建了pAS2-1-PreS1饵载体,并通过酵母双杂交体系筛选出肝细胞内与PreS1相互作用的蛋白NACA。     

乙型肝炎病毒全S蛋白结合蛋白基因的筛选

HBV与肝硬化、肝细胞癌的发生发展密切相关[1],通过其表达的病毒蛋白与肝细胞蛋白相互作用导致疾病进展.本研究中,我们对全S基因编码产物功能进行了探讨,并以其为靶蛋白,利用酵母双杂交技术寻找其与肝细胞相互作用的蛋白质,以进一步探讨HBV致病机制.     

乙型肝炎病毒前-X融合蛋白结合蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术自肝细胞cDNA文库中筛选HBV前-X(pre-X)融合蛋白结合蛋白,探讨pre-X融合蛋白的生物学功能。方法 PCR扩增HBV pre-X基因序列,根据酵母双杂合体系构建诱饵质粒pDEST32-pre-X,并测定DNA序列验证。将质粒pDEST32-pre-X转化为酵母细胞MaV203,应用Western blot验证pre-X融合蛋白在酵母细胞中正确表达,再与转化为人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞pDEST22配合,在营养缺陷型培养基和X-gal上三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的猎物质粒进行DNA测序。利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对筛选结果进行分析。结果成功构建pDEST32-pre-X诱饵质粒,Western blot证实转化诱饵质粒的酵母细胞能正确表达pre-X融合蛋白,pDEST32-pre-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出45个菌落,经缺陷培养基分离及X-gal检测后筛选出3个阳性克隆,测序结果为一种蛋白,即TCP1蛋白。结论用酵母双杂交技术筛选出1个与pre-X融合蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白,为进一步研究HBV pre-X融合蛋白的作用提供了新线索。     

乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白的筛选

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞与乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白(MHBst)结合蛋白．方法:PCR扩增MHBst基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达．后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落增菌后提出质粒转化入大肠杆菌(DH5α),并经氨苄青霉素抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,酶切鉴定,序列测定后进行生物信息学分析．结果:应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆8个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到7种已知基因,分别为ADP核糖基因子2种,RAB6相互作用蛋白(RAB6IP1)1种,CCR4-NOT转录复合体亚基10(CCR4- NOT-10)1种,脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1种,醛缩酶B(ALDOB)1种,补体成分3(C3)1种,丙酮酸脱氢酶(PDH)1种．结论:成功克隆出MHBst结合蛋白．     

酵母双杂交筛选人肝细胞文库戊肝病毒pORF3结合蛋白

目的筛选人肝细胞文库戊肝病毒pORF3结合蛋白,为HEVORF3蛋白的功能研究提供依据。方法构建pSOS-baitORF3诱饵重组载体,诱饵蛋白的自激活检测以及表达验证后,筛选cDNA文库中HEVORF3相互作用蛋白。结果经验证pSOS-baitORF3诱饵重组载体构建成功,诱饵蛋白的自激活检测以及表达验证均符合预期结果,共筛选出八种相互作用蛋白。结论筛选出的蛋白基本上为功能性蛋白,其中包括免疫信号通路激酶p110δ以及线粒体膜蛋白,和补体系统C3等,有进一步研究的价值。     

酵母双杂交技术筛选与克隆白细胞中与NS5ATP7蛋白结合的蛋白编码基因

目的 应用酵母双杂交体系寻找与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 5 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus,NS5ATP7)相互作用的白细胞蛋白,以探讨SN5ATP7的生物功能。方法 应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP7诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒。DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果 筛选出15个与NS5ATP7特异性相互作用的克隆,其中包括人类RhoGDF分裂抑制剂α、人类细胞色素b558a亚单位、人类MLL(MLL)基因外显子、人类S100钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B)、人类移动抑制因子相关蛋白14变体E(S100A9)、人类金属硫蛋白2A、人类染色体序列及人类cDNA序列等,1个是未知功能基因。结论 初步克隆了NSSATP7与白细胞结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究NS5ATP7的功能有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP7相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础。     

Screening of hepatocyte proteins binding to complete S protein of hepatitis B virus by yeast-two hybrid system

AIM: To investigate the biological function of complete S protein and to look for proteins interacting with complete S protein in hepatocytes. METHODS: We constructed bait plasmid expressing complete S protein of HBV by cloning the gene of complete S protein into pGBKT7, then the recombinant plasmid DNA was transformed into yeast AH109 (a type). The transformed yeast AH109 was mated with yeast Y187 (α type) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing of plasmids from positive (blue) colonies, we underwent sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Nineteen colonies were selected and sequenced. Among them, five colonies were Homo sapiens solute carrier family 25, member 23 (SLC25A23), one was Homo sapiens calrer.iculin, one was human serum albumin (ALB) gene, one was Homo sapiens metallothionein 2A, two were Homo sapiens betaine-homocysteine methyltransferase, three were Homo sapiens Na+ and H+coupled amino acid transport system N, one was Homo sapiens CD81 antigen (target of anti-proliferative antibody 1) (CD81), three were Homo sapiens diazepam binding inhibitor, two colonies were new genes with unknown function. CONCLUSION: The yeast-two hybrid system is an effective method for identifying hepatocyte proteins interacting with complete S protein of HBV. The complete S protein may bind to different proteins i.e., its multiple functions in vivo.     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物贡和能量代谢相关的基因。     

酵母双杂交技术筛选肝细胞中与羧基末端截短型乙型肝炎表面抗原中蛋白MHBst167蛋白结合蛋白的研究

目的应用酵母双杂交技术筛选人肝细胞cDNA文库中与羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs^t167）具有相互作用的肝细胞蛋白，以探讨MHBs^t167可能的生物学功能。方法用多聚酶链反应（PCR）法扩增MHBs^t167研基因，应用酵母双杂交系统3，连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转染酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合，于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）上进行双重筛选阳性菌落。挑选阳性克隆，提取此酵母克隆的质粒转化DH5a大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选，提取单克隆菌落质粒DNA，酶切鉴定后进行测序，然后进行生物信息学分析。结果成功构建MHBs^t167酵母表达载体pGBKT7-MHBs^t167.筛选出阳性菌落28个，经生物信息学分析，最后从肝细胞cDNA文库中筛选出7个与MHBs^t167特异性结合作用的克隆。其中包括人类核糖基化因子1、胎儿肝全长cDNA克隆、人类醛缩酶B果糖二磷酸（ALDOB）、补体3（C3）、人类血清扩散因子（生长调节素B）、人类BAC（细菌人工染色体）克隆GSI一306C12。结论成功克隆出MHBs^t167基因并在酵母细胞中表达，应用酵母双杂交技术筛选出7个能与MHBs^t167蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白基因，根据所克隆到的基因，对以后研究MHBs^t167的生物学功能及乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制奠定了理论基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）相互作用蛋白的基因，明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3，将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体PGBKT7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人肝cDNA文库质粒PACT2的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基和X—α-半乳糖上进行双重筛选阳性菌落，提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上，选择生长菌落，提取质粒酶切鉴定，测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCV NS4A基因，构建表达载体并在酵母细胞中表达，与肝文库配合后选出既能在四缺培养基又能在铺有X—α-半乳糖的四缺培养基上生长，并变成蓝色的真阳性菌落22个，序列分析显示，筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞能量代谢、蛋白翻译合成等多种生物学过程。结论成功克隆出HCV NS4A蛋白在肝细胞内的结合蛋白，为进一步研究NS4A蛋白的功能、阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。     

乙型肝炎病毒抗原与金属硫蛋白相互作用的研究

目的 为探讨乙型肝炎病毒(HBV)抗原在乙型肝炎发病机制中的作用，寻找防治HBV感染的有效方法，筛选并克隆人肝细胞中与HBV抗原相互作用的蛋白基因。方法 应用酵母双杂交系统3构建HBV抗原诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其中表达，与含肝文库质粒的酵母Y187进行配合、双杂交，在营养缺陷培养基(SD／Trp-Leu-His-Ade)上及X-α-gal蓝白斑双重筛选与肝细胞蛋白结合的蛋白编码基因，进一步用网织红细胞裂解物体外翻译、蛋白间免疫共沉淀实验证实其相互作用的可靠性。结果 成功地筛选出HBV前-S2抗原、e抗原(HBeAg)、核心抗原(HBcAg)、X抗原(HBxAg)的肝细胞结合蛋白，发现均有含金属硫蛋白基因的菌落。体外免疫共沉淀技术再次证实金属硫蛋白与HBeAg、HBcAg及HBxAg间有确切的结合作用。结论 金属硫蛋白能与HBV的多种抗原成分结合，在致肝细胞损伤过程中可能起着重要作用。