应用胶原支架构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的 探讨应用胶原支架构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法 行兔皮下包埋实验。分别于4、6、8、12周观察材料的生物相容性和降解率。将犬主动脉壁间质细胞和主动脉内皮细胞种植于胶原膜上，进而将此瓣叶植入犬腹主动脉内3个月，观察材料吸收和瓣叶结构的变化。结果 胶原膜呈网孔状结构，孔径107μm。皮下包埋实验显示，材料生物相容性好，完全降解时间为12周。体内实验显示，材料于12周末被间质细胞合成的细胞外基质所取代，瓣叶表面有内皮细胞覆盖。结论 以胶原膜为支架构建组织工程心脏瓣膜是可行的，但材料在强度和组织相容性方面尚需改进。     

胶原水凝胶支架用于软骨组织工程的实验研究

目的探讨Ⅰ型胶原浓度对胶原水凝胶理化性能的影响,以及在体外组织工程模型中不同浓度的Ⅰ型胶原水凝胶对软骨细胞表型和基因表达的影响。方法制备Ⅰ型胶原浓度为12、8、6 mg/mL的3种胶原水凝胶,记为C12、C8、C6。扫描电镜观察形貌,并通过溶胀性能和抗压性能测试表征其理化性能。取2只新生7日龄新西兰大白兔的关节软骨,酶消化法分离、培养软骨细胞。取第2代软骨细胞与3种胶原水凝胶复合体外培养(C12组、C8组及C6组),1 d后采用二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,激光共聚焦显微镜观察细胞活性,体外培养14 d后行HE和甲苯胺蓝染色观察组织学形态,实时荧光定量PCR测定软骨细胞相关基因,即Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox9 mRNA表达。结果随着Ⅰ型胶原浓度从6 mg/mL提高到12 mg/mL,胶原水凝胶的理化性质出现明显变化,扫描电镜下纤维网络变得致密;192 h时C6、C8、C12溶胀率依次增大,分别为0.260±0.055、0.358±0.072、0.539±0.033,比较差异均有统计学意义(P<0.05);压缩模量逐渐增加,分别为(4.86±0.96)、(7.09±2.33)、(11.08±3.18)kPa,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。体外培养1 d,3组凝胶中软骨细胞经FDA/PI染色后,绝大部分被染成绿色,仅有少数被染成红色。14 d后组织学观察示:C12组软骨细胞在组织中聚集明显,并出现明显的甲苯胺蓝异染为紫红色的现象;C8组中也有部分增殖聚集的区域,细胞周围有较明显的甲苯胺蓝异染现象;C6组细胞分布较为均匀,也有较明显的甲苯胺蓝异染现象。实时荧光定量PCR检测显示,3组Ⅱ型胶原mRNA和Aggrecan mRNA表达水平相近;Ⅰ型胶原、Sox9和X型胶原mRNA表达水平C12组最高,C6组最低,C8组介于二者之间,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论提高Ⅰ型胶原浓度至12 mg/mL后,胶原水凝胶具有更好的理化性质,但软骨细胞纤维化和肥大相关基因表达也有所上调。     

组织工程中胶原支架材料的研究进展

组织工程是应用工程学、生命科学的原理和方法来制备具有生物活性的人工替代物,用以维持、恢复或提高人体组织、器官的一部分或全部功能。组织工程的研究主要集中在种子细胞的选择、支架材料的制备、组织工程骨的构建及体内植入相容性情况等方面。其中生物支架材料的选择是组织、器官重建的关键因素之一。理想的细胞种植基质材料应具备：①良好的     

组织工程皮肤种子细胞和支架材料的研究现状

皮肤是面积最大的人体器官,也是人体面对外界的第一重保护屏障.大面积的皮肤损伤可引起机体一系列的病理变化,严重者可造成死亡.随着细胞生物学、分子生物学及材料学的发展,组织工程皮肤产品应运而生;其不会造成皮瓣移植的大面积再损伤,也能够给大面积皮肤缺损患者及时的皮肤覆盖保护.组织工程的三要素为:种子细胞,生物支架材料和体内微环境[1].其中,种子细胞和支架材料的选择是组织工程的基本环节.笔者将围绕干细胞与天然可降解生物材料在皮肤组织工程中的应用作一综述.     

利用聚羟基乙酸构建组织工程皮肤的实验研究

目的 以聚羟基乙酸(PGA)为培养支架，用组织工程方法在体外构建双层、有活性皮肤。方法应用酶消化法分别获取人成纤维细胞(FB)和表皮角质形成细胞(KC)，体外扩增培养。接种HF与PGA上1周后，在复合物表面接种KC，共培养1周将复合物置于气-液界面继续培养。于不同时间段取材。行组织学、超微结构及免疫组织化学检测。结果接种表皮角质形成细胞在“FB-PGA”复合物表面1周后可见2～3层连续的HK在复合物上生长良好；4周时PGA已部分降解，表皮分层分化较完善，抗involucrin染色阳性，透射电镜观察可见表皮细胞分层分化良好。细胞的相邻面有桥粒连接。结论 采用组织工程技术可以在体外构建双层、有活性的人工皮肤；组织工程皮肤具有和正常皮肤相似的组织学特征及生化成分。     

组织工程化人工复合皮肤的构建

目的 为皮肤缺失的移植提供具有生物活性的表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法 将体外传代培养的表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞分别接种在冷冻干燥及戊二醛交联的I型胶原基质网架的两侧,在液面下培养1周后,改为气－液界面培养,动态观测人工皮肤光镜下组织学形态及电镜下超微结构。结果 人工复合皮肤具有表皮、真皮双层结构。培养过程中表皮逐步增殖、分化、发育,形成基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层;真皮基质网架渐渐降解,并逐步被增殖的成纤维细胞及其所分泌的细胞外基质所取代,完成真皮构建。结论 利用组织工程技术体外构建人工复合皮肤,可用于皮肤缺失者的自体移植治疗,体外构建的复合人工皮肤可从根本上解决自体供皮不足,且细胞源于自体皮肤,排除了发生免疫排斥反应和疾病传播的风险,具有安全、有效、实用等优点。     

胶原复合支架在血管组织工程中的应用

目的综述胶原与可降解高分子材料复合支架在血管组织工程中的应用,介绍近年来基于胶原材料制备的多层血管支架。方法查阅近年来胶原复合支架作为组织工程血管支架材料的相关文献,并进行综述。结果作为天然血管的结构蛋白之一,胶原因其良好的组织相容性、可降解性以及具有细胞识别信号等特点,广泛应用于血管组织工程。胶原复合高分子材料可制备具生物活性、力学性能良好的血管支架,其中多层血管支架更可在结构和功能上模拟天然血管。结论胶原复合高分子材料是目前血管支架研究的热点,其中多层血管支架已成为研究的新趋势。     

组织工程真皮支架材料的研究进展

组织工程皮肤从概念提出至今发展迅速,而真皮支架材料在组织工程化皮肤构建中具有关键作用。我们从3大类真皮支架材料的理化特性,及生物适用性等方面,对该领域的国内外最新研究现状进行综述,分析了各种支架材料的优势及仍存在的问题,并提出未来可能的发展方向。     

组织工程皮肤构建的研究进展

组织工程学是生物工程领域的一门新兴学科,是目前学术界的研究热点。利用组织工程的原理构建人工皮肤替代物,用于皮肤移植,可以有效解决临床上皮肤缺损修复,供皮不足的难题。文中从表皮、真皮、复合皮三个方面就近年来组织工程皮肤构建的研究进展及干细胞在这一领域的应用作一综述,并分析组织工程皮肤目前存在的问题,展望未来发展方向。     

射频电流对皮肤胶原含量的影响

目的探讨射频电流对兔皮肤胶原含量的影响,以便为应用于除皱提供实验依据。方法采用GP699A型射频热能皮肤治疗仪作用于兔背部皮肤,输出频率为5MHz,处理后当天及第8、19、33、43、59天切取实验组和对照组部位皮肤,行常规HE染色及苦味酸天狼猩红染色,检测皮肤胶原含量及观察组织学改变。结果射频电流作用可使兔皮肤真皮层胶原增生,排列更加紧密,促进兔皮肤I型、Ⅲ型胶原增生,且Ⅲ型胶原相对分泌较多,真皮层中Ⅲ型胶原与I型胶原比值增大。在应用射频电流后第8天,即可以观察到明显的真皮层胶原增生,在随后的几个时间点中,可以明显的发现随着时问的推移,真皮层胶原增生更为明显,同时Ⅲ型胶原所占比例更大。结论射频电流可促进皮肤真皮成纤维细胞分泌I型、Ⅲ型胶原,增加真皮的厚度,改变胶原纤维的排列,是用于除皱的理论基础之一。     

构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究

目的 探讨运用组织工程方法构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤。方法 以包皮组织作为细胞来源，采用消化法获得角朊细胞、成纤维细胞和黑色素细胞，在自行设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。行Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测构建的皮肤中黑色素细胞的分布和状态。结果 构建的组织工程皮肤结构完整，细胞状态良好，Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测均显示含有大量黑色素细胞并处于良好状态。结论 构建了含黑色素细胞的组织工程皮肤，可用于下一步的动物实验和临床实验。     

构建含血管结构的组织工程皮肤的研究

目的　探讨应用组织工程方法构建含有血管结构的组织工程皮肤。　方法　以新生儿脐带静脉和包皮作为细胞来源 ,用消化法获得血管内皮细胞、皮肤角朊细胞和成纤维细胞 ,用设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。实验组 :真皮层含有 1∶ 1的成纤维细胞和血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮 ;对照组 :真皮层只含有成纤维细胞 ,不含血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮。 HE染色和免疫组织化学染色检测第 因子抗体 ,观察两种组织工程皮肤真皮层中血管结构的形成情况。用所构建的两种组织工程皮肤修复裸鼠的全层皮肤缺损。　结果　所构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,实验组真皮层内含有血管样结构 ,对照组未见到血管样结构。修复裸鼠全层皮肤缺损 ,肉眼观察皮肤缺损愈合 ,染色显示移植部位有大量血管长入。　结论　构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,真皮层中形成了微血管样结构。采用所构建的组织工程皮肤成功修复了裸鼠的皮肤缺损     

皮肤组织工程

目的 综述近阶段皮肤组织工程研究领域中的进展。方法 广泛查阅国内外近期在皮肤组织工程研究的文献,着重阐述表皮替代物,真皮替代物,培养的表皮真皮复合皮片的研究进展和重要问题。结果 多数学者认为理想的皮肤替代物应及时重建已人的表皮和真皮结构。目前的研究主要集中在如何尽早移植表皮细胞,并保护移植后细胞的活性和功能,以及研制能更有效地促进细胞功能,诱导创床血植入,移植后可降解,无毒性,无病原携带风险的细胞     

壳多糖-胶原-糖胺聚糖凝胶人工皮肤的初步研究

目的 研制一种新型的胶原凝胶类人工皮肤。方法 制备壳多糖—胶原—糖胺聚糖(GAGs)—成纤维细胞真皮替代物(DE)，观察成纤维细胞(FB)在凝胶中的生长情况和不同因素对凝胶收缩的影响，并绘制FB生长曲线和凝胶收缩曲线。了解不同含量壳多糖对FB和角质形成细胞(KC)生长的影响，不同含量壳多糖DE的抗感染能力。再于“成熟。的DE表面接种KC，先浸没培养，后行气液界面培养，构建完整的人工皮肤。对DE和人工皮肤行组织学和电镜分析。结果 DE收缩度与FB数量呈正比，终末收缩度与胶原蛋白浓度成反比；FB在凝胶中2—9天呈指数增生。DE基质配方对FB的生长无明显抑制作用，但可促进KC的生长，对金黄色葡萄球菌的抑制作用随壳多糖的含量增大而增强。扫描电镜示DE有丰富的微孔结构。人工皮肤组织学观察见类似于正常皮肤，有分化良好的表皮和致密的真皮。结论 壳多糖—胶原—GAGs胶原凝胶人工皮肤是一种新型、有一定抗感染能力的活人工皮肤。     

利用不同支架材料构建人工真皮的研究

目的 探讨脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶的不同支架材料上构建人工真皮的可行性。方法 采用酶消化法分离幼儿包皮成纤维细胞，并进行传代培养；将第3代成纤维细胞种植于三种不同支架上，14天后利用HE染色、透射电镜和扫描电镜对构建的人工真皮结构进行鉴定。结果 ①酶消化法得到皮肤成纤维细胞，可在含有10％小牛血清的DMEM中传代培养；②成纤维细胞在三种不同支架上形成单层细胞，并可向胶原膜和胶原凝胶内部生长；③成纤维细胞在胶原膜和脱细胞基质内增殖不如胶原凝胶内活跃，但人工真皮收缩不明显，而胶原凝胶构建的人工真皮收缩明显。结论 利用脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶支架材料构建的人工真皮具有较好的组织结构，是一种较理想的皮肤替代物，可作为移植物进行深入研究。     

牛肌腱复合胶原与人牙周膜成纤维细胞培养的实验研究

目的　观察牛肌腱复合胶原三维支架材料 (tendon mixed extraction of bovine collagen,t MEBC)与人牙周膜成纤维细胞的生物相容性 ,探讨其应用于牙周组织工程的可行性。　方法　胎牛肌腱经脱细胞、冷冻 -干燥方法构建复合胶原三维支架载体 ,取 4～ 6代人牙周膜成纤维细胞 (human periodontal ligament fibroblasts,HPDL Fs) ,接种浓度 5× 10 6 / ml与 t MEBC复合材料共培养 ,于培养第 1、3、5及 10天 ,细胞计数法了解细胞附着及增殖情况 ;培养第 5、10天 HE染色、扫描电镜行形态学观察。　结果　 t MEBC具有良好的多孔网状结构 ,HPDL Fs黏附良好 ,复合培养 1d细胞密度达 0 .5 5 6× 10 4 / ml,随培养时间延长细胞增殖明显 ,培养第 10天细胞密度达 3.94 4× 10 4 / ml;组织学检测显示细胞均匀分布于材料内部 ,形成良好的细胞材料复合体。　结论　 t MEBC具有良好的生物相容性 ,可作为支架材料复合HPDL Fs应用于牙周组织工程研究。     

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性. 方法 将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养.将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5 mL与纤维蛋白支架(0.5 mL)混合凝固构建组织工程皮肤.取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3 g,平均20.0 g,制备背部全层皮肤缺损模型.随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤.术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察. 结果 细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6 d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞.构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞.移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻.术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为(0.460 ±0.049)、(0.480 ±0.055)、(0.540 ±0.043)、(0.510 ±0.032)及(0.60 ±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P＜0.05).术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见. 结论 用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

培养基钙浓度对复方壳多糖组织工程皮肤基底膜构建的形态学研究

目的寻找最适于组织工程皮肤生长及基底膜构建的体外培养基钙浓度。方法按照鲁元刚等建立的方法制备复方壳多糖组织工程皮肤，根据培养基钙浓度不同，分为1．00、1．45、1．65和1．95mmol／L四组。在37℃、5％CO2及90％以上湿度孵箱内浸没培养3d后，将培养物置于不锈钢筛网上进行气一液界面三维培养，每天换液1次。培养7、15d，行HE、PAS染色观察组织工程皮肤的组织学特性；并利用免疫组织化学染色对基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原进行观察，评价基底膜构建情况。结果各组组织工程皮肤组织学观察类似正常皮肤，有分化良好的表皮和致密真皮，但1．95mmol／L组表皮分化较其他组更好；1．00、1．45及1．65mmol／L组角化层外侧常伴未角化的角质形成细胞，1．95mmol／L组表皮细胞角化完全，且与颗粒层细胞结合牢固。PAS染色显示各组真、表皮间有紫红色带状结构；免疫组织化学染色显示真皮与表皮间Ⅳ型胶原反应呈阳性，且1．95mmol／L组阳性反应强于1．00mmol／L组。结论钙浓度为1．95mmol／L的培养基最适合于复方壳多糖组织工程皮肤生长及基底膜构建。     

胶原-透明质酸支架的制备及其与软骨细胞复合培养的实验研究

目的制备胶原-透明质酸支架,评价其与兔髁状突软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法冷冻干燥法制备胶原-透明质酸复合多孔海绵支架材料,将其与碳化二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide,EDC]进行化学交联。分别采用体积法和体外酶解实验测定支架材料孔隙率和降解率,扫描电镜观察交联前后支架材料的形态变化。取3周龄新西兰兔髁状突软骨细胞,体外培养5d后,甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜下观察行细胞鉴定。取消化后第2代软骨细胞接种至支架材料复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。复合培养1、3、5、7和10d后,PBS液清洗3次,置入24孔板并以0.25%胰酶和0.1%EDTA消化细胞,采集细胞进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。另取部分样本继续培养5d,行组织学和扫描电镜观察。结果胶原-透明质酸支架材料经化学交联后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为83.7%,孔径100-120μm;交联后抗酶解能力显著增加。髁状突软骨细胞在其表面和内部贴附良好,形成细胞-材料复合体,细胞增殖实验显示,复合培养1d,材料中细胞数为3.7×104/支架,10d后增至8.2×104/支架。电镜观察见细胞周围有基质分泌。结论EDC交联后的胶原-透明质酸支架具有良好空间结构和生物相容性,可作为支架材料用于髁状突软骨组织工程的研究。