茵兰益肝颗粒剂体外抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

[目的]验证含有茵兰益肝颗粒剂药效成分的药物血清对转染乙型肝炎病毒基因的人肝癌细胞系2.2.15(HepG2.2.15)细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原的(HBeAg)抑制作用。[方法]组织培养及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。[结果]药物血清第8天对HepG2.2.15细胞半数毒性浓度(TC₅₀)为11.48%,最大药物血清无毒浓度(TC₀)为6.0%。6.0%~3.0%、1.50%、0.75%4种药物血清浓度在HepG2.2.15细胞中第8天对HBsAg的抑制率分别为7.89%~5.8%、1.6%、1.6%,对HBeAg抑制率均为负值。[结论]茵兰益肝颗粒剂对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg有较低的抑制率,对HBeAg无抑制作用。     

RNA干扰的抗病毒作用：阻止乙型肝炎病毒复制的新策略

近年来，科学家们发现了一种普遍存在的重要的基因调节机制，被称为RNA沉默或者是RNA干扰(RNAi)。虽然RNAi基因调节的机制并没有完全搞清楚，但科学家已将研究的重点放在治疗作用上，特别是抗病毒作用。本文介绍了近年利用小干扰RNA(siRNA)阻止乙肝病毒复制的多个成功的体内和体外研究。这些研究使我们离使用RNAi作为一种抗病毒治疗的手段越来越近。     

乙型肝炎病毒复制表达载体的构建与表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)复制表达载体,验证其在HepG2细胞系中的复制和表达。方法通过引物设计合成,以实验室构建的HBV C1亚型质粒通过PCR、酶切、克隆等分子生物学技术,构建HBV复制表达载体。利用转染试剂(Fugene HD Transfection Reagent)将载体质粒导入HepG2细胞,分别检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA在不同时间点的表达。结果酶切和测序结果均证实载体构建成功,通过瞬时转染细胞证实培养上清液中可检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。结论利用分子克隆技术成功构建了HBV复制表达载体,可以在HepG2细胞系中复制表达。通过进一步改造,可以为HBV表型耐药以及复制活性研究提供支持。     

新型稀土杂多化合物对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的：研究稀土杂多化合物(PTW-6)体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法：MTT法检测PTW-6对Hep G2 2.2.15细胞的毒性,乙型肝炎病毒e（s）抗原诊断试剂盒检测上清液中HBeAg、HBsAg的含量,Southern blotting 法检测PTW-6对细胞内HBV DNA复制的抑制作用。荧光定量PCR分析PTW-6对细胞内HBV mRNA和上清液中HBV DNA含量的影响。结果：PTW-6对2.2.15细胞的半数中毒浓度为1590.46 mg•L^-1, PTW-6各浓度实验组对HBeAg和HBsAg的抑制率均高于对照组（P<0.05）;随着PTW-6浓度的增高,PTW-6对2.2.15细胞内外HBV DNA的抑制率增加,PTW-6对2.2.15细胞外HBV DNA和细胞内HBV mRNA半数抑制浓度分别为51.1和63.6 mg•L^-1。结论：PTW-6体外毒性较低, 且对HBV复制有较好的抑制作用。     

RNA干涉及其应用

目的　综述RNA干涉可能的作用机制及其在基因功能研究和基因治疗等方面的应用前景与展望。方法　通过检索国内外文献资料进行分析、整理、总结。结果　RNA干涉是由特定双链RNA(dsRNA)引起的转录后基因沉默现象。RNA干涉在基因功能研究和疾病基因治疗中已初步显示了其巨大优势。结论　RNA干涉将是基因功能研究和疾病基因治疗的革命性工具     

小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达影响的实验研究

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,并在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,明确感染后,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg,HBeAg(MEIA),通过RT-PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组,空载体对照组和无关干扰对照组。结果注射后第6天血清中HBsAg,HBeAg在pHBV1.5感染组中高表达。psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与感染组比较差异有显著性(P<0.01),RT-PCR显示肝内HBVCmRNA水平亦明显降低。而无关干扰对照组则无相应的干扰作用。结论RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBV的复制和表达,同时通过水动力学方法,成功建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,为进一步研究乙型肝炎病毒奠定了基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细菌内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

目的：研究乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)人源单链可变区抗体（ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒（HBV）基因治疗的作用。方法：用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体，聚合酶链反应（PCR）法扩增HBsAg单链抗体基因，并构建表达HBsAg ScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBsAg ScFv,转染PA317细胞，将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染2．2．15细胞，酶联免疫吸附法（ELISA）检测其上清HBsAg和HBeAg，定量检测HBV DNA。结果：成功筛选出HBsAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因，构建HBsAg ScFv基因的逆转录病毒载体，转染PA317细胞，在上清中检测出含HBsAg ScFv假病毒颗粒的存在，上清感染2．2．15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg,HBeAg逐渐下降，到第14天时HBsAg已变为阴性，DNA定量检测无明显变化。结论：HBsAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg,HBeAg表达的作用。     

丁型肝炎病毒感染对乙型肝炎病毒复制的影响研究

用ＥＬＩＳＡ测定１８１例各型ＨＢＶ感染者血请中ＨＤＶ标志物，结果ＨＤＶＭ阳性５７例，阳性率为３１．４９％。各型肝炎间ＨＤＶ感染卒的差异有显著性（Ｐ＜０．０５），依次为ＳＨ＞ＬＣ＞ＣＡＨ＞ＣＰＨ＞ＡＨ＞ＡＳＣ。用异羟基洋地黄毒试元标记的ＨＢＶＤＮＡ探针测定其中５７例ＨＢＶ／ＨＤＶ及单纯ＨＢＶ感染病人血清中ＨＢｖＤＮＡ及其含量，结果ＨＢＶＤＮＡ的检出率在ＨＢＶ／ＨＤＶ组（６７．９２％）明显低于单纯ＨＢＶ感染组（８４．６２％）（Ｐ：０．０１５２），且前组中ＨＢＶＤＮＡ含量也明显低于后组（Ｐ＜０．０５）。以上结果提示：ＨＤＶ感染多见于严重的及慢性肝脏疾病；在ＨＢＶ／ＨＤＶ感染的急性期，ＨＢＶ复制受到抑制；而在重症型、慢性期和肝硬化时则未见这种抑制现象，说明在ＨＢＶ／ＨＤＶ感染的不同阶段可表现出不同的病毒复制现象。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠体内肝靶向反义RNA抗病毒疗效研究

目的：探讨半乳糖修饰的反义RNA真核表达质粒在乙型肝炎病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。方法：以半乳糖多聚赖氨酸（Gal-PLL)作肝靶向载体，将乙型肝炎病毒基因C区的反义RNA真核表达重组质粒（pCEP4-aC）制备为Gal-PLL－pCEP4-aC。将24只血清HBV DNA、HBsAg阳性的小鼠，随机等分为Gal-PLL－pCEP4-aC治疗组、Gal-PLL-pCEP4对照组和生理盐水阴性对照组，于实验第1天尾静脉分别注射Gal-PLL－pCEP4-aC、Gal-PLL－pCEP4（100μg/只）和等体积的生理盐水，观察治疗前后血清HBV DNA以及HBsAg变化。结果：Gal-PLL－pCEP4-aC治疗组21天时血清HBV－DNA转阴率62．5％（5／8），且7，14，21天时血清HBsAg明显降低；而Gal-PLL－pCEP4组血清HBV DNA转阴1只（1／8），生理盐水组8只均未转阴，两组用药后血清中HBsAg与用药前比较差异性均不明显（P＞0．05）。结论：肝靶向反义RNA能在乙肝基因小鼠体内抑制HBV的复制和抗原表达。     

地塞米松对乙型肝炎病毒复制与表达的调控研究

乙型肝炎是严重危害人民健康的传染病。据统计，全球ＨＢｓＡｇ阳性人数达３亿。现有抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的药物中，α－干扰素已普遍被接受，有不少报道于短程糖皮质激素治疗撤药后，再用α－干扰素，能提高后者的抗病毒效果。为了解糖皮质激素对ＨＢＶ复制与表达的...     

RNA干扰抑制HBV e抗原基因表达的实验研究

目的针对HBV前C／C基因的siRNA表达载体pSiHBV／C、含HBV前C／C基因（e抗原基因）及绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP—HBVC（1或4），共转染真核细胞，观察RNA干扰对HBVe抗原基因表达的抑制作用。方法脂质体共转染pSiHBV／C和pEGPP-HBVC真核细胞，通过观察荧光强度，及利用蛋白免疫印迹进行半定量分析来检测RNA干扰作用对HBVe抗原基因表达的抑制效果。结果针对HBV前C／C基因的siRNA表达载体pSiHBV／C与pEGFP—HBVC共转染真核细胞后，可明显抑制融合蛋白的表达。结论在细胞水平上，针对HBV前C／C基因的siRNA表达载体pSiHBV／C产生的siRNA可特异的抑制HBVe抗原基因的表达。     

Specific anti-viral effects of RNA interference on replication and expression of hepatitis B virus in mice

HHepeaptaitdisan Bv ivriidruase.is HthBeV p riontofetcyptieon m eism obnere o off t hthee fa mmoilsytcommon and severe viral infections because infectedindividuals are at high risk of developing liver cirrhosis,and eventually,hepatocellular carcinoma.While aneffective vaccine is available,present treatment regimentsfor hepatitis B are costly and often have limit of effects.Only about one-third of patients treated with alphainterferon show a sustained response.Nucleosideanalogues do not elimi…     

RNAi靶向抑制HBV复制和HBeAg表达

目的观察靶向HBVC基因区的RNA干扰对HBV复制的抑制作用。方法选择HBV基因组C区的Nt2021-2049作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBV的受抑制情况。结果病毒复制及HBeAg的表达明显受到抑制。结论所选靶区通过RNA干扰可有效抑制HBV复制。     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

质粒表达型siRNA对SARS-CoV复制与感染干扰的初步研究

目的构建针对SARS-CoV的特异性siRNA质粒,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染.方法根据SARS-CoV的全长基因序列,以4个不同的部位为靶点,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的一段寡核苷酸,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3.1-H1载体中,构建表达siRNA的质粒.采用脂质体法将质粒转染Vero E6细胞,经潮霉素抗性筛选后,再对稳定表达的细胞进行细胞病变、病毒空斑形成和MTT实验,以观察干扰效应.结果对所构建的质粒分别测序,确定其含有siRNA的序列与预期的特异性干扰序列一致.用不同浓度的SARS-CoV感染转染质粒后的细胞,与阴性对照相比,其细胞病变减轻、活细胞显著增加,病毒空斑明显减少.结论利用RNA干扰能有效的抑制SARS-CoV在细胞中的复制,并对细胞有保护作用,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法.     

慢病毒介导基于microRNA系统的HBs RNAi技术抑制HBV复制

目的:构建HBs基因RNAi慢病毒载体,观察其对HBV复制和抗原表达的作用。方法:针对已经筛选确定的HBs基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pGCLM-GFP载体连接产生慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pGCLM-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。培养HepG2.2.15细胞系,用慢病毒（MOI=1和MOI=10）对肝癌细胞进行感染,感染后细胞培养上清进行ELISA、Western印迹、HBV DNA定量分析。结果:PCR和测序结果证实,成功构建HBs shRNA的慢病毒载体。包装慢病毒后浓缩病毒悬液的滴度为5×108~2×109 TU /ml。慢病毒HBs RNAi后,对HBV复制和抗原表达的抑制作用显著。感染4 d后,抑制效应开始出现,一直持续到第9天,抑制效应达到高峰(P<0.05)。相对于阴性对照,HBs shRNA作用后细胞上清中HBsAg分泌量下降70％以上(P<0.05),而Western印迹和real-time PCR结果进一步证实了上述结果,在蛋白水平和mRNA水平都得到了进一步验证。经HBV DNA定量,发现慢病毒RNAi后DNA水平也显著下降(P<0.05)。结论:成功构建HBs基因RNAi慢病毒载体,以HBs基因为靶点的慢病毒介导的基于microRNA系统的RNAi技术能有效抑制HBV的复制和抗原表达。     

表达A3C的HBV载体质粒抑制HBV的研究

目的 观察表达人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)的复制缺损型HBV载体质粒抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 利用PCR技术和基因重组方法构建表达A3C和人绿色荧光蛋白(hrGFP)的FIBV载体质粒pcH-LJ3-A3C、pCH-LJ3-hrGFP.分别与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞,提取细胞裂解液及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA进行Southern blot检测;提取细胞裂解液中核心蛋白相关的HBV DNA,PCR扩增,克隆,测序.结果 pCH-LJ3-A3C对细胞浆及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA具有抑制作用,使细胞浆内HBV DNA减少31%,使上清液中子代病毒颗粒HBV DNA减少40%;对HBV DNA具有编辑作用,50个克隆测定HBV DNA序列,36克隆出现G-A突变,G-A突变总数量982位点.结论 pCH-LJ3-A3C可以抑制HBV复制,pCH-LJ3-A3C对HBV DNA的编辑作用是其发挥作用的主要原因,pCH-LJ3-A3C可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗HBV感染.

Abstract：

Objective To observe the inhibitory effect of a replication-defective hepatitis B virus (HBV) vector plasmid expressing A3C on HBV replication in vitro. Methods The HBV vector plasmisd pCH-LJ3-A3C and pCH-LJ3-hrGFP expressing A3C and hrGFP were constructed using PCR and gene recombination technique. The two recombinant plasmids were separately cotranfected into HepG2 cells along with the wild-type HBV plasmid pCH-3093. The HBV DNA in the cell cytoplasmic lysates and in the cell culture supernatant was extracted for Southern blotting, and the nucleocapsid-associated HBV DNA were amplified by PCR, cloned and sequenced. Results pCH-LJ3-A3C showed obvious inhibitory effect on HBV DNA in the cytoplasmic lysates and cell culture supernatant, causing a reduction of the HBV DNA by 31% and 40%, respectively. The pCH-LJ3-A3C plasmid was capable of editing the HBV DNA. Among the 50 sequenced clones, 36 clones had G-A mutations, with a total of 982 such mutations. Conclusion pCH-LJ3-A3C can inhibit the replication of HBV primarily by editing HBV DNA. The pCH-LJ3-A3C plasmid may serve as a new antiviral agent against human HBV infection.     

针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.     

靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的 设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法 以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用...