弓形虫不同地理株致密颗粒蛋白基因的比较研究

目的 比较弓形虫不同地理株(RH株、ZS2株、GT株)GRA7基因的异同。方法 从弓形虫不同地理株的基因组DNA中扩增出GRA7基因，对目的基因用限制性内切酶(Esp31、CfrⅠ、MboⅠ)酶切并比较。结果 PCR扩增出3株弓形虫的目的基因片段大小均在500bp-750bp之间，约711bp。三种限制性内切酶酶切片段的大小均与理论值相符。结论 弓形虫不同地理株GRA7基因具有高度保守性。     

弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的 将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法 将重组表达质粒pGEX-4T-1／GRA7转入大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳，分别以Anti-GSTAn-tibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western Blot分析。用GSTrap FF HiTrap affinity columns纯化重组蛋白，以此蛋白作为包被抗原，BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果 SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达，蛋白分子量大小与理论值相符。Western Blot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白，且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论 弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达；该重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。     

弓形虫致密颗粒蛋白4的原核细胞表达与纯化

目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白4（GRA4）的pET原核细胞表达系统，并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。 方法 利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段，定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a（+），转化大肠埃希菌（E.coli BL21 DE3），以组氨酸结合柱亲和层析法纯化表达产物，并对其进行抗原活性分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，用ELISA检测其特异性抗体滴度。 结果 成功构建了弓形虫pET-GRA4原核细胞表达系统，其表达产物相对分子质量（Mr）约为 40 000，主要以包涵体形式存在，纯化后的重组蛋白能被人工感染弓形虫RH株速殖子的兔血清识别。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性IgG抗体。 结论 利用pET原核细胞表达系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白，该蛋白具有一定的免疫学活性。     

弓形虫致密颗粒蛋白的分子生物学研究进展

本文对近年来弓形虫致密颗粒的发生、分泌及致密颗粒蛋白的分子生物学特性及其临床应用前景的研究进展作一概述。     

弓形虫GRA6可溶性蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫GRA6抗原,为制作弓形虫感染基因工程诊断试剂盒奠定基础.方法将重组pGEX-GRA6表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达.超声破壁后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物的表达形式,并对表达产物以硫酸铵沉淀、Sephedax G50脱盐和GST亲和层析柱进行目的蛋白的纯化.通过Western blotting检测其纯化的重组抗原的免疫反应性.结果GRA6以融合蛋白（GST-GRA6）的形式在大肠埃希菌中得到了高效表达.对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达.在上清液中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度可达90%以上.Western blotting分析表明纯化蛋白能被弓形虫感染的人血清所识别.结论GRA6在大肠埃希菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化后能特异性地被弓形虫感染者血清所识别.     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的 构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒，分析其表达状况。 方法 采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列，经克隆后，亚克隆至原核表达载体中，构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒，分析GRA8的表达；将各重组菌进行诱导，将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白，免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性。 结果 GRA8基因被正确插入原核表达质粒中，原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低，几乎无完整GRA8的表达，截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。 结论 GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低，纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。     

弓形虫表面抗原和致密颗粒蛋白的研究进展

弓形虫生活史包括无性增殖与有性增殖,存在形式有滋养体、包囊、卵囊、配子体、裂殖体,滋养体包括速殖子、缓殖子,它们在分子学上有一些共同成份:表面抗原(surface an-tigen,SAG),微线体蛋白(microneme protein,MIC)、棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP),致密颗粒抗原(dense gran     

弓形虫SAG1可溶性融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫SAG1抗原,为研制新型弓形虫病基因工程诊断试剂盒奠定基础. 方法将重组pGEX-SAG1表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物的表达形式.通过降低培养温度和升高LB培养基的pH,诱导融合蛋白在上清中表达,表达产物以硫酸铵沉淀、GST亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤层析进行纯化.Western blot检测纯化融合蛋白的免疫反应性. 结果 37 ℃条件下,SAG1以融合蛋白（SAG1-GST）的形式在大肠埃希菌中高效表达,表达蛋白以包涵体形式存在.在27 ℃和升高LB培养基pH条件下,融合蛋白在上清中得到表达,经纯化后其SAG1可溶性蛋白纯度可达90%以上.Western blot分析纯化蛋白能被弓形虫感染者血清所识别.结论 SAG1可溶性蛋白在大肠埃希菌中得到了表达,经纯化后能被弓形虫感染者血清所识别,可用于制备弓形虫感染诊断试剂盒.     

弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

弓形虫强毒株和弱毒株致密颗粒蛋白1基因的比较研究

目的比较弓形虫强毒株RH株、桂弓株和弱毒株B36株致密颗粒蛋白1(GRA1)基因片段的异同。方法分别从接种RH株、桂弓株、B36株弓形虫的小鼠腹水中收集、纯化虫体,提取基因组DNA,PCR扩增3个虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段;构建pMD-18-T/GRA1重组质粒,PCR和双酶切鉴定其准确性;测序并用NCBI中Blast软件和MEGA3.1软件分析比较3种不同毒力株GRA1基因的异同。结果获得3株弓形虫的GRA1目的基因片段并构建了pMD-18-T/GRA1重组质粒,经鉴定目的基因片段大小与预期理论值相符。测序分析3不同毒力株GRA1基因片段相似为100%。结论弓形虫强毒株RH株、桂弓株和弱毒株B36株的GRA1基因片段极其相似,且高度保守。因此认为弓形虫GRA1基因具有较高应用价值。     

弓形虫GRA6抗原基因的克隆与表达

目的在大肠杆菌中高效表达弓形虫抗原GRA6。方法采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，经DNA序列分析后导入表达载体。PGEX-5X-3。然后在大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP中进行表达，以SDS-PAGE和Westen blotting进行鉴定，用GST亲和层析柱纯化表达产物。结果1．在我们所比较的336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致。2．得到一分子量为49kDa的融合蛋白。占大肠杆菌总蛋白的25．55％，通过Westen blotting证实，该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所识别。结论1．弓形虫昆山分离株和RH株的GRA6基因片段几乎完全一致；2．在大肠杆菌中得到了高效表达的融合蛋白；3．该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所别．可用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫病检测试剂盒．     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。