重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

骨形成蛋白7真核表达质粒的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建骨形成蛋白7(hBMP7)基因真核表达质粒,并使其在骨髓间充质干细胞中表达。方法 采用PCR技术扩增BMP7基因,将其插入真核表达载体pcDNA3．1中,利用梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞(MSCs),然后用构建的BMP7表达质粒转染MSCs,使其得到表达。结果 经过PCR及酶切鉴定证明获得了BMP7真核表达质粒pcDNA-BMP7,通过反转录PCR和免疫组化鉴定证明BMP7在转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。结论 BMP7真核表达质粒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达,为BMP7基因治疗的研究奠定了坚实的基础,同时也为组织工程成骨和成软骨的研究提供了改良的种子细胞。     

转BMP-7软骨细胞在Matrigel胶支架中修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

[目的]研究骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein,BMP-7)在构建 Matrigel 胶支架软骨膜块修复关节软骨缺损中的作用.[方法]将软骨细胞种植于 Matrigel 胶支架上,体外培养,在培养系统中加入 BMP-7,观察软骨细胞在支架中的繁殖以及载体降解情况;将培养出的软骨膜块植入于动物关节软骨缺损模型中进行定期观测(4周).[结果]Matrigel 胶支架可满足组织工程软骨修复需要,BMP-7 在用于构建膜块修复关节软骨缺损模型中可促进软骨细胞增殖,并在植入 4 周动物试验中发现与对照组比较在关节软骨缺损修复质量上有显著性差异(P<0.01).[结论]BMP-7 在 Matrigel 胶软骨膜块中可明显促进组织工程软骨膜块构建以及关节软骨缺损的修复.     

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及转染骨髓间充质干细胞的研究

目的 构建骨形成蛋白(BMP)7重组腺病毒，使其转染骨髓间充质干细胞并在细胞内得到表达。方法 将BMP7基因克隆到转移载体pAdTrack—CMV中，在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组，得到BMP7重组腺病毒基因组，通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP7重组腺病毒转染分离纯化后的骨髓间充质干细胞，鉴定BMP7在细胞内的表达。结果 经过多聚酶链反应(PCR)及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒padTrack—BMP7和BMP7重组腺病毒基因组，并包装出重组腺病毒。逆转录PCR和免疫组织化学证明BMP7在重组腺病毒转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。结论 BMP7重组腺病毒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达，为BMP7基因治疗的研究奠定了基础。     

PcDNA3-hBMP3基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性基因ｈＢＭＰ３在软骨细胞获得稳定表达的可能性。方法 将和ＢＭＰ３的ｃＤＮＡ构建于真核表达载体ＰｃＤＮＡ３,形成重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３,转染培养状态下兔关节软骨细胞。利用重组ＤＮＡ和基因克隆技术构建重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３;利用细胞２和细胞基因转染技术体外转染ｈＢＭＰ３基因至关节软骨细胞;     

转染人骨形成蛋白-7基因的骨髓基质细胞异位成骨实验研究

目的 观察转染人骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7,BMP-7）基因的骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）与胶原膜（BME-10X）复合培养后的异位成骨能力。方法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC,与胶原膜复合培养后,植入裸鼠皮下,8周后取材,HE、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其异位成骨能力。结果各组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,转染组和未转染组显著高于单纯膜组,转染组又显著高于未转染组（P〈0．05）。结论转染了hBMP-7基因的BMSCs具有更强的异位成骨能力,有望成为牙周组织工程理想的种子细胞,     

转染重组人骨形态发生蛋白-7基因对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后的稳定表达及表达产物对BMSCs生物学行为的影响。方法利用脂质体介导法将rhBMP．7基因转染BMSCs，以G418筛选出阳性克隆并扩大培养，用免疫组织化学链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测转基因细胞的稳定表达；转染48h后，用转基因细胞的培养液上清刺激正常培养的BMSCs，利用^3H标记的胞腺嘧啶氧核苷(^3H-TdR)掺入法、Na2^35SO4掺入法以及氯胺T法检测基因表达产物对BMSCs增殖、合成蛋白多糖以及胶原的影响。结果 转基因细胞4周时仍能表达外源性基因；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖以及蛋白多糖和胶原的合成。结论 rhBMP-7基因转染BMSCs后可获得稳定表达，且基因表达产物能促进BMSCs增殖。诱导其向软骨细胞分化并增强其生物学活性。     

BMP-2重组质粒转染人骨髓基质干细胞及表达蛋白的诱导活性观察

目的 构建骨形态发生蛋白-2(BMP-2)真核表达质粒，使其在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中表达，并观察表达产物的诱导成骨活性。方法在脂质体介导下将BMP-2基因导入hBMSCs，流式细胞仪、ALP检测和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖、ALP活性和VEGF表达的影响。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)，检测其骨钙素、Ⅱ型胶原表达。结果 转染后细胞稳定表达BMIP-2基因，S期细胞比例增多，ALP活性和VEGF的表达明显增加。且诱导L929细胞骨钙素、Ⅱ型胶原阳性表达。结论 BMP-2重组质粒转染hBMSCs后表达目的蛋白，促进自身增殖、分化和上调VEGF的表达，并诱导成纤维细胞向成骨细胞转化，为BMP-2基因治疗奠定了实验基础。     

表达小鼠B7-1基因的重组逆转录病毒载体构建及真核表达

目的：构建表达小鼠B7—1基因的重组逆转录病毒载体并在真核细胞中检测其蛋白表达。方法：PCR法获基因，定向克隆连接到逆转录病毒载体上，得到重组逆转录病毒载体，酶切法鉴定，真核细胞中检测蛋白表达。结果：酶切所得片段与所需相符，在真核细胞中检测到蛋白表达。结论：成功构建重组的逆转录病毒载体，为今后研究奠定了基础。     

重组人pEGFP-heNOS质粒的构建及其在人内皮祖细胞中的表达

目的构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因(EGFP)的人内皮一氧化氮合酶(heNOS)重组质粒,观察其在人骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)中的表达。方法构建重组人pEGFP-heNOS质粒,脂质体转染人骨髓来源的内皮祖细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测heNOS在内皮祖细胞中的表达。结果重组人pEGFP-heNOS质粒构建成功,体外转染人人内皮祖细胞中,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测到heNOS的表达。结论重组人pEGFP-heNOS质粒体外转染人内皮祖细胞后,目的基因能够在细胞中有效表达,为下一步基因治疗提供了理论支持。     

重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7转染犬髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响

目的:观察重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7(recombinant adeno-associated virus-2expressinghuman bone morphogenetic protein-7,rAAV2-hBMP7)转染犬髓核细胞情况及其对细胞表型的影响。方法:用1岁龄Beagle犬L4/5椎间盘髓核进行髓核细胞体外培养,取第2代髓核细胞进行实验,实验组以rAAV2-hBMP7(1×105v.g/细胞)转染髓核细胞,对照组以重组2型腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinantadeno-associated virus-2expressing enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染髓核细胞。在转染后4d、7d和14d以PCR检测髓核细胞中hBMP7的mRNA表达,在转染后7d和14d以Western blot法检测髓核细胞中hBMP7蛋白表达。在转染后4d、7d和14d采用RT-PCR法检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的mRNA含量,采用二甲基蓝及ELISA法分别检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白含量。结果:实验组髓核细胞表达hBMP7 mRNA及蛋白,并于转染后7d时表达量最高,而对照组无表达。实验组髓核细胞蛋白多糖mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d时亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);4d时实验组与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。同组各时间点Ⅰ型胶原mRNA及蛋白含量均无统计学差异,两组各时间点间比较无统计学差异(P0.05)。实验组髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);实验组4d时与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。结论:rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞后能表达hBMP7蛋白,并能提高其蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量。     

脊柱后外侧融合过程中BMP-2、BMP-4基因的动态表达

目的：研究脊柱后外侧融合过程中骨形态发生蛋白(BMP)的表达情况，探讨BMP对融合过程的作用。方法：36只成年雄性新西兰白兔，制作L4、L5双侧横突间自体骨植骨模型，按术后处死时间(0d、2d、4d、1周、2周、3周、4周、5周、6周、10周、6个月、10个月)随机平均分为12组。将融合组织平均分为3等份，与横突交界的上、下区域定为边缘区，中间区域定为中央区。以RT-PCR法检测不同时间段、不同融合区域BMP-2 mRNA、BMP-4 mRNA的表达水平。结果：在脊柱融合术后1～6周，BMP-2和BMP-4表达量明显增高，并各自出现相应的峰值。中央区BMP表达水平的增幅及峰值明显低于边缘区，其开始增高的时间及峰值出现的时间滞后于边缘区1～3周，表现出明显的时间和空间差别：结论：脊柱融合中央区BMP低表达及时间滞后可能是不融合发生的重要原因。在融合早期补充外源性BMP可能有助于提高融合率。     

hBMP-7基因在脂肪源性干细胞中的表达及对其向成骨细胞分化的影响

目的构建hBMP-7基因真核表达载体,观察其在兔脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的表达,并观察其对ADSCs向成骨细胞分化的影响。方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔,雌雄不限,体重3～4 kg。取兔皮下脂肪约5 mL,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验;CD44、CD49d、CD106免疫荧光染色鉴定ADSCs。构建真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7,经鉴定后利用LipofectamineTM 2000介导转染ADSCs,免疫组织化学染色检测hBMP-7在ADSCs中的表达;ALP定量测定、Ⅰ型胶原免疫荧光检测hBMP-7基因转染对ADSCs向成骨细胞分化的影响。结果倒置相差显微镜观察示ADSCs呈梭形、多角形分布;表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106呈阴性表达。成功构建pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体,并利用脂质体介导的方法成功导入ADSCs中,免疫组织化学染色提示hBMP-7能在ADSCs中表达。ALP定量测定示,转染后7、10、14 d pcDNA3.1-hBMP-7转染组(实验组)ALP活性明显高于pcDNA3.1空载体转染组(对照组),差异有统计意义(P<0.05);转染后7、14 d,实验组Ⅰ型胶原表达量均高于对照组(P<0.05)。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7可在兔ADSCs中表达,且转染后的ADSCs ALP定量测定、成骨标志物Ⅰ型胶原的表达均高于pcDNA3.1空载体转染细胞,为开展以干细胞为载体的局部基因治疗奠定了基础。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

骨成形蛋白-7在大鼠肾小管间质损害中的作用

目的观察单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠中骨成形蛋白-7(BMP-7)在肾小管间质中的表达部位、动态变化及其与肾小管间质损害的关系。方法60只Wistar大鼠随机分为正常大鼠组、假手术组和单侧输尿管梗阻组,分别于术后1d、3d、7d、14d处死。采用RT-PCR方法检测BMP-7mRNA、TGF-β1.mRNA表达水平,免疫组化方法检测肾小管间质中BMP-7、TGF-β1、α-SMA的蛋白定位、表达及其与输尿管梗阻后肾小管间质损害的关系。结果与对照组相比,BMP-7mRNA于术后第1天即出现表达下降并随梗阻时间延长递减;而TGF-β1mRNA则随梗阻时间延长而递增(P均<0.05)。BMP-7蛋白在对照组中高度表达,主要分布在肾小管及肾间质,肾小球内基本无表达。在梗阻组随着肾间质损害的加重,BMP-7蛋白表达呈进行性下降,第14天表达量最弱,几乎没有明显的阳性表达,而TGF-β1、α-SMA蛋白表达则逐渐增加(P均<0.01)。BMP-7与TGF-β1蛋白表达阳性面积成显著负相关(r=-0.875,P<0.05)。BMP-7与α-SMA蛋白表达阳性面积亦成显著负相关(r=-0.843,P<0.05)。结论BMP-7于肾小管间质病变早期即出现表达下调,早于肾间质纤维化的出现,其表达量与肾间质TGF-β1、α-SMA表达负相关且随间质病变进展进行性下降。BMP-7表达下调可能参与介导肾小管间质损害的发生发展。     

人骨形态发生蛋白2重组腺病毒载体的构建及其生物学活性检测

目的构建人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2),并检测其转染后的骨髓基质细胞hBMP-2表达以及成骨能力的改变。方法采用Cre-lox重组方法构建含有hBMP-2基因的复制缺陷型重组腺病毒,并利用原位杂交和免疫组化手段观察转染后的骨髓基质细胞hBMP-2mRNA和蛋白表达情况;通过Ⅰ型胶原原位杂交、碱性磷酸酶测定、透射电镜观察以及裸鼠肌袋试验评价Ad-hBMP-2转染对兔骨髓基质细胞成骨能力的影响。结果病毒培养上清液的聚合酶链式反应证实构建的重组腺病毒含有Ad-hBMP-2基因,重组腺病毒滴度达3·8×1010pfu/L;感染增殖率为100的Ad-hBMP-2转染兔骨髓基质细胞24h和48h后即可分别检测到显著的hBMP-2mRNA和蛋白表达,转染效率几乎达100%;Ad-hBMP-2转染可以明显刺激兔骨髓基质细胞Ⅰ型胶原mRNA表达、碱性磷酸酶分泌、细胞内蛋白质合成以及异位骨形成等。结论Ad-hBMP-2具有高效转染能力,并能够诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化,进而促进骨形成。     

反义人骨形态发生蛋白2基因逆转录病毒表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 从分子水平探讨骨形态发生蛋白 2(BMP-2)基因对骨肉瘤生物学行为的影响，并为骨肉瘤的基因治疗提供理论依据。方法 将人 BMP-2基因约 1.0 kb的 cDNA片段反向插入逆转录病毒表达载体 PDOR,构建人 BMP-2基因的反义逆转录表达载体，然后用脂质体将重组的 PDOR-BMP-2质粒转染至人的骨肉瘤细胞 OS-9901，经 G 418筛选并获得阳性克隆。用免疫组织化学卵白素-生物素-过氧化酶 (ABC)方法检测肿瘤细胞中 BMP和增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达。应用流式细胞仪分析肿瘤细胞增殖周期并对其进行电镜观察。结果 转染后， OS-9901肿瘤细胞的内源性 BMP表达明显下降 (t=24.01,P