儿童急性白血病PCNA和P53及Bcl-2蛋白表达及其临床意义

目的探讨儿童急性白血病(AL)骨髓细胞增殖细胞核抗原(PCNA)与抗凋亡基因P53、Bcl-2蛋白的表达及其与临床化疗和预后的关系。方法应用S-P免疫组织化学方法检测59例儿童AL骨髓穿刺标本,分别应用PCNA、P53、Bcl-2单克隆抗体进行检测。选择15例正常骨髓穿刺组织标本作为对照。结果PCNA、Bcl-2、P53在AL初治病例中的表达与对照组,未缓解组与缓解组比较均有显著性差异(P<0.05);PCNA表达复发难治组与对照组比较无显著性差异,与化疗敏感性有关,阳性表达组与阴性表达组,6周内缓解率有显著性差异(P<0.05),而3年以上无病生存率比较无差异(P>0.05);P53、Bcl-2表达复发难治组显著高于对照组,高表达者,化疗耐药,缓解率低,二者共同阳性者,不易缓解,提示预后不良。结论PCNA阳性表达者缓解率高,与长期预后无关。Bcl-2、P53阳性表达者缓解率低,与长期预后有关,二者可作为判断化疗效应及预后的分子生物学指标;PCNA、P53、Bcl-2基因以不同的途径参与儿童AL的发生过程,三者联合检测判断预后有更大的临床价值。     

氟对人胚肝细胞P53表达的影响

[目的]探讨氟对人胚肝细胞(L-02细胞)P53表达的影响。[方法]对体外培养的人胚肝细胞染毒氟化钠40、80、160μg/ml24h后,分别采用MTT试验、蛋白印迹技术(Westernblot)和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测人胚肝细胞存活率、P53蛋白和mRNA水平。[结果]高浓度氟组细胞存活率显著低于对照组(P<0.01);中、高浓度氟组细胞P53蛋白水平均显著高于对照组(P<0.01),且随氟浓度增加而升高;低浓度氟组与对照组差异没有显著性(P>0.05);各氟染毒组P53mRNA的表达量均显著高于对照组(P<0.01),低、中浓度氟组P53mRNA表达量随染氟浓度的增高而增加;高浓度氟组的P53mRNA表达量虽然与对照组有显著性差异(P<0.01),但相对于中浓度氟组来说,已呈现出下降的趋势,与低浓度氟组水平相当。[结论]高氟可使人胚肝细胞的存活率下降,并诱导P53表达,但P53mRNA和P53蛋白的变化趋势并不完全一致。     

二甲基乙酰胺对人胚肺细胞凋亡及Bcl-2和Caspase-3表达的影响

目的探讨二甲基乙酰胺(DMAC)诱导人胚肺成纤维细胞(HELF凋亡)的可能机制。方法用MTT法检测细胞生长抑制率,用Hoechst染色法检测细胞凋亡,用Western blot法检测Bcl-2、Caspase-3蛋白表达。结果DMAC处理HELF细胞24 h均可诱导细胞发生凋亡,并呈现明显的剂量-效应关系;DMAC诱导HELF细胞凋亡过程中伴随着Bcl-2蛋白表达下降、Caspase-3蛋白表达增加。结论 DMAC可诱导HELF细胞凋亡,其机制可能与Bcl-2蛋白表达下降从而激活Caspase-3的表达有关。     

阴道超声辐照后人胚绒毛滋养细胞凋亡及Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白表达的研究

目的:探讨阴道超声辐照对人胚绒毛滋养细胞凋亡的影响及其可逆性,同时探索Bcl-2蛋白及活化Caspase-3蛋白在滋养细胞凋亡中的作用。方法:选取符合条件的患者50例,随机分为5组,每组10例。4组实验组患者经阴道超声持续辐照10 min后分别于第1、3、5、7天行人工流产收集绒毛标本,第5组为对照组。采用TUNEL法检测各组绒毛滋养细胞的凋亡指数;同时采用免疫组化SABC法检测相应绒毛滋养细胞中Bcl-2蛋白及活化Caspase-3蛋白的表达水平。结果:阴道超声辐照对滋养细胞凋亡有影响。经阴道超声辐照10 min后,1天人胚绒毛滋养细胞的凋亡指数最高、Bcl-2蛋白的表达量最少、Caspase-3蛋白的表达量最多;随着取胚时间延长,凋亡指数逐渐下降、Bcl-2蛋白表达量逐渐增加、Caspase-3蛋白表达量逐渐减少;凋亡指数、Bcl-2蛋白及Caspase-3蛋白表达量分别于辐照后第5天、第3天、第5天开始与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:阴道超声辐照10 min可致人胚绒毛滋养细胞凋亡增加,但该改变呈近期可逆性。Bcl-2蛋白和活化Caspase-3蛋白在滋养细胞凋亡中起着重要作用。     

二噁英对HepG2和SPC-Al细胞P53和P38 MAPK基因表达的影响

[目的] 探讨二(口恶)英(TCDD)对人体肝癌细胞株(HepG2)和肺腺癌细胞株(SPC-A1)中P53基因和P38 MAPK基因表达的影响,并研究剂量与效应的关系.[方法] 用常规的细胞培养方法,利用RT-PCR方法对2种基因进行表达,并以β-actin作为内对照.对基因表达的强度进行比较分析.[结果] P38 MAPK基因在2种细胞中都有表达,在HepG2中,P38 MAPK基因表达随浓度1、 5、 10、 20 nmol/L增加先抑后扬(表达值分别为0.900、 0.820、 1.260、 0.898,P＜0.05),而在SPC-A1中差异无显著性(表达值分别为0.898、 0.919、 0.808、 0.846,P＞0.05).P53基因在人体肝癌细胞株(HepG2)中有表达,并随浓度增加而上调(表达值分别为0.764、 0.890、 1.099、 1.218、 1.405,P＜0.05)而在肺腺癌细胞株(SPC-A1)中未见表达.[结论] 二英对人体肝癌细胞株(HepG2)中P53基因和P38 MAPK基因有诱导作用,在肺腺癌细胞株(SPC-A1)中仅见对P38 MAPK基因有诱导作用,P53蛋白未见阳性表达.     

锰诱导PC12细胞凋亡与P53、MDM2蛋白表达

目的 探讨锰对嗜铬细胞瘤细胞(PC12cells)凋亡的诱导作用及与抑癌基因P53、原癌基因MDM2蛋白表达的关系.方法 以PC12细胞作为多巴胺能神经元的模型细胞,取对数生长期的PC12细胞,用含200,400,800μmol/LMnCl2的培养液分别染毒培养24,36,48h.四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞的生长情况,流式细胞仪(FMC)和原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡状况;用免疫细胞化学法检测细胞P53、MDM2蛋白表达强度.结果 氯化锰可呈时间和剂量依赖性抑制PC12细胞的增殖和诱导细胞凋亡,抑制率为11.8%～73.6%,凋亡率为8.72%～53.60%.免疫化学法检测结果显示,随锰浓度的增高,P53蛋白的表达增加(P<0.01),而MDM2蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.01),且呈剂量依赖关系.结论 锰可诱导PC12细胞凋亡,上调P53基因的表达和下调MDM2基因的表达可能在其诱导PC12细胞凋亡中起着重要的作用.     

亚硫酸钠对人胚肾293细胞APP蛋白表达影响

目的研究食品添加剂亚硫酸钠(Na₂SO₃)对β-淀粉样物质(Aβ)前体蛋白(APP)表达的影响。方法用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人胚肾293(HEK293)中APP基因的mRNA表达水平,用蛋白印迹法(West-ern-blotting)检测HEK293中APP蛋白水平。结果RT-PCR检测显示,HEK293接触0.039~10 mmol/L Na₂SO₃24 h后细胞内APP基因的3个亚型APP695、APP751、APP770的mRNA水平均未见明显改变。蛋白印迹分析发现,10mmol/L Na₂SO₃可明显降低细胞内APP蛋白水平,为阴性对照组的0.908倍;而较低剂量组0.039~2.5 mmol/LNa₂SO₃却可以明显增加细胞内APP蛋白的水平,分别达到阴性对照组的1.596,1.630,1.556和1.446倍。结论亚硫酸钠在一定剂量范围内影响HEK293细胞内APP蛋白水平,可能对老年性痴呆的发生有一定影响,但是细胞内APP蛋白水平的增加不是由该基因转录水平增加所致。     

菟仙海蚣胶囊对腺嘌呤致大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、P53表达的影响

目的探讨菟仙海蚣胶囊对生精细胞损伤大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、P53表达的影响。方法建立腺嘌呤诱导致生精细胞损伤大鼠动物模型,用流式细胞仪检测菟仙海蚣胶囊对该模型大鼠生精细胞的凋亡率及Bcl-2、P53蛋白表达,同时检测大鼠睾丸、附睾指数及精子数量、精子活率。结果菟仙海蚣胶囊可明显抑制大鼠睾丸生精细胞凋亡,升高睾丸组织细胞Bcl-2的表达,降低P53的表达,提高附睾指数,增加精子数量和精子活率。结论菟仙海蚣胶囊治疗少精、弱精症的作用机理可能与抑制生精细胞凋亡、上调睾丸组织细胞Bcl-2的表达和下调野生型P53表达,并作用于附睾,提高附睾指数,促进精子发育成熟,增强其活力有关。     

镉诱导人胚肾细胞金属硫蛋白基因亚型的表达

为了研究镉对人胚肾细胞（HEK293T）金属硫蛋白（MT）各基因亚型表达的影响。研究人员使用10μmol／L CdCl2染毒HEK293T0、2、4、8、12、16、20、24h,2．5、5、10、20、40μmol／L CdCl2染毒HEK293T24h后,MTT法测定HEK293T增殖活性;RT-PCR检测镉对HEK293TMT-1A,MT-1B,MT-1E,MT-1F,MT-1G,MT-1H,MT-1X及MT-2AmRNA表达的变化。     

混合稀土和柠檬酸铝对温石棉致人胚肺细胞谷胱甘肽含量改变的影响

目的寻求一种适宜的石棉表面改性剂。方法用不同浓度的混合稀土或柠檬酸铝溶液浸泡温石棉１小时后,再将其与人胚肺（ＨＥＬ）细胞共同孵育,测定ＨＥＬ细胞的谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量。结果随着石棉剂量的增加或染毒时间的延长,ＨＥＬ细胞的ＧＳＨ含量明显降低。经混合稀土或柠檬酸铝预处理的石棉,其所诱导的ＨＥＬ细胞ＧＳＨ下降的程度明显减弱。结论用混合稀土或柠檬酸铝预处理温石棉,均可降低温石棉对ＨＥＬ细胞的毒性作用。     

川芎嗪对乳腺癌MCF-7细胞AKT、Bcl-2蛋白活性表达的影响

目的:研究川芎嗪(TMP)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与凋亡的影响并探讨其可能的作用机制。方法:对乳腺癌MCF-7细胞分别施以0,0.5,1.0,2.0 mg/ml浓度TMP处理24、48、72 h,MTT法检测细胞的增殖抑制作用,Western Blot法检测AKT、Bcl-2蛋白的表达情况。所有数据均采用SPSS18.0,P0.05差异具有显著性,P0.01差异极具显著性。结果:与对照组相比,TMP对MCF-7细胞的增殖有抑制作用,且呈现一定的浓度、时间相关性(P0.01)。同时TMP可下调Bcl-2及AKT蛋白表达(P0.05,P0.01)。结论:TMP可能是通过调节Bcl-2、AKT蛋白的表达达到抑制MCF-7细胞增殖及诱导凋亡的效果。     

P53、MDM2、P21、P16在云锡矿粉诱导的人支气管上皮恶性转化细胞中的表达

[目的]研究P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的变化情况。[方法]采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。[结果]P53、MDM2蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阴性,而在BEAS-MD-25及BEAS-MD-C细胞中均呈阳性;P21、P16蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阳性,随细胞转化进程表达不断下降;在BEAS-MD-25细胞中呈弱阳性;在BEAS-MD-C中呈阴性。[结论]转化细胞中P53、MDM2、P21、P16的表达异常,提示其P53通路已发生改变,第25代细胞P53蛋白的阳性表达,提示P53基因异常可能是细胞发生恶性转化的关键步骤之一。     

细胞色素P450 1A1-Wt和Asn461、Vla462真核表达载体的构建及人胚肺成纤维细胞转染

目的构建能够高效表达细胞色素P450 1A1（CYP 1A1）蛋白的细胞株，分析不同基因型蛋白表达的差异。方法首先将已经建立的T载体中CYP1A1-Wt和Asn^461、Val^462的CYP1A1片断重组至pBABE-neo载体上，转染入人胚肺成纤维细胞（HLF），G418筛选获得阳性细胞，Western-Blot检测CYP1A1蛋白的表达，观察细胞形态，生长曲线，恶变性等生物学特性的改变。结果CYP1A1野生型、变异型转染的HLF细胞均能高效表达CYP1A1蛋白，其生物学特性与正常细胞无显著差异，也不属于恶性细胞。结论通过细胞转染和筛选获得了表达CYP1A1蛋白的细胞株。     

宫颈上皮内瘤变的HPV感染及P53和MDM2的表达

目的研究宫颈上皮内瘤(CIN)的人类乳头状瘤病毒(HPV)感染、p53蛋白和MDM2蛋白的表达及三者之间的相互关系。方法选取CIN 47例、正常宫颈组织54例,分别采用原位杂交技术检测HPV6/11、HPV16/18感染,用免疫组织化学技术(SP法)检测P53蛋白和MDM2蛋白。结果HPV6/11感染率在CIN组和对照组分别为46.8%(22/47)、20.4%(11/54),HPV18感染分别为70.2%(33/47)、16.7(9/54)。CIN组的HPV6/11、HPV16/18的感染率均显著高于对照组(均P<0.01)。CIN组和对照组的p53阳性率分别为2.27%(13/47)、3.7%(2/54)。CIN组和对照组的MDM2阳性率分别为14.9%(7/47)、7.4%(4/54)。CIN组的p53阳性率显著高于对照组(P<0.05),MDM2阳性率CIN组和对照组之间无统计学差异(P>0.05)。在本实验中,p53、MDM2之间的阳性率均无统计学相关(P>0.05)。p53、MDM2蛋白阳性表达和HPV6/11、HPV16/18感染之间无统计学相关(均P>0.05)。结论CIN与HPV感染关系密切;p53可能参与小部分CIN的发生发展,而MDM2可能在CIN的发生发展中不起重要作用。     

细胞色素P4501A1-Wt和Asn~(461)、Val~(462)真核表达载体的构建及人胚肺成纤维细胞转染

目的构建能够高效表达细胞色素P4501A1(CYP1A1)蛋白的细胞株,分析不同基因型蛋白表达的差异。方法首先将已经建立的T载体中CYP1A1-Wt和Asn461、Val462的CYP1A1片断重组至pBABE-neo载体上,转染入人胚肺成纤维细胞(HLF),G418筛选获得阳性细胞,Western-Blot检测CYP1A1蛋白的表达,观察细胞形态,生长曲线,恶变性等生物学特性的改变。结果CYP1A1野生型、变异型转染的HLF细胞均能高效表达CYP1A1蛋白,其生物学特性与正常细胞无显著差异,也不属于恶性细胞。结论通过细胞转染和筛选获得了表达CYP1A1蛋白的细胞株。     

CK2β和p53蛋白在宫颈癌组织中的表达及对患者预后的预测价值

目的探讨CK2β和p53蛋白在宫颈癌组织中的表达及对患者预后的预测价值。方法选取2012年7月-2014年12月该院收治的宫颈癌患者95例(研究组)和慢性宫颈炎患者50例(对照组),采用免疫组化法检测两组中宫颈组织标本中CK2β和p53蛋白表达情况,分析CK2β和p53阳性表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系及与宫颈癌患者预后的相关性。结果研究组宫颈癌组织中CK2β、p53蛋白免疫组化评分分别为(6.89±1.46)分、(5.74±1.87)分,阳性率分别为67.37%、50.53%,均高于对照组(P<0.01)。宫颈癌组织中CK2β和p53蛋白阳性表达与患者年龄、病理分型无关(P>0.05),与FIGO分期、分化程度及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。95例宫颈癌患者随访时间为18~53个月,中位随访时间38个月,随访结束时82例(86.32%)存活,13例(13.68%)死亡。FIGO分期(OR=16.837,P=0.000)、分化程度(OR=12.254,P=0.031)、淋巴结转移(OR=5.432,P=0.037)、CK2β蛋白阳性表达(OR=3.476,P=0.038)、p53蛋白阳性表达(OR=18.384,P=0.000)均可影响宫颈癌患者预后;而FIGO分期(OR=2.648,P=0.021)、p53蛋白阳性表达(OR=5.598,P=0.012)是影响宫颈癌患者预后的独立危险因素。结论宫颈癌组织中CK2β和p53蛋白均呈高表达,p53蛋白阳性表达对宫颈癌患者预后预测具有一定的价值。     

von Hippel-Lindau 基因两种异构体在真核细胞中高效表达和对细胞凋亡信号Bax/Bcl-2的影响

目的构建uon Hippel—Lindau（VHL）基因的两种异构体的重组表达载体并研究异构体与细胞凋亡信号之间的关系。方法将VHL基因的两种异构体VHL19、VHL30分别克隆入真核表达载体pcDNA3．1中，测序鉴定。转染293细胞，通过蛋白印记分析细胞内两种异构体高效表达与凋亡信号Bax、Bcl-2之间的关系。结果重组质粒经酶切获得与目的基因大小相当的条带（pVHL30约660bp，pVHL19约500bp），测序结果显示与目的基因完全相同。蛋白印记分析结果显示VHL19和VHL30在293细胞中获得表达，Bax和Bcl-2在空白对照、载体对照和pcDNA3．1-VHL19、pcDNA3．1-VHL30各组细胞之间的表达均没有观察到明显的差异。结论成功构建VHL两种异构体VHL19、VHL30的高效表达质粒，并获得高效表达。当细胞内VHL19、VHL30高效表达时凋亡信号Bax、Bcl-2表达并没有明显变化。     

染尘巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞应激蛋白诱导表达

目的观察染尘巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞（HELF）血红素氧合酶-1（HO-1）、金属硫蛋白（MT）表达的影响。方法采用大鼠巨噬细胞（AM）和HELF组成体外模型，采用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）技术检测二氧化硅粉尘处理AM24h的培养上清液刺激HELF细胞的MT1A、MT2A和HO-1mRNA表达情况。同时用二氧化钛作为阴性对照，以不用粉尘处理的AM培养上清液作为正常对照。结果HO-1能被染尘AM诱导表达且呈良好的剂量-效应关系。MT1A、MT2A也能被诱导表达，但没观察到明显的剂量-效应关系。结论HO-1可能参与了矽尘致细胞氧化应激过程，起到一定的抗氧化保护作用。     

槲皮素对SiO_2介导人胚肺成纤维细胞增殖及TGF-β1表达的影响

目的探讨槲皮素抗硅肺纤维化的作用机制。方法以支气管肺泡灌洗法收集硅肺患者AM,在体外用含有SiO2(50μg/ml)的DMEM培养基和不含SiO2的DMEM培养基培养18h,然后收集培养的AM上清液,加入低、中、高浓度槲皮素(10、20和40μmol/L)作为刺激上清。用组织贴块法获取培养HELF,与刺激上清液共同孵育后,MTT法检测HELF增殖情况,免疫细胞化学法检测HELF中TGF-β1的表达。结果 (1)各槲皮素组能抑制HELF增殖,并且浓度愈大抑制作用愈强,三组与SiO2+AM组(0.620±0.096)相比、中浓度组(0.406±0.070)和高浓度组(0.334±0.050)与AM组(0.490±0.064)相比差异有显著性(P<0.01)。(2)三种浓度槲皮素均能降低HELF中TGF-β1的表达,与SiO2+AM组(0.542±0.095)相比差异有显著性(P<0.05),与AM组(0.394±0.109)和空白对照组(0.314±0.066)比较差异无显著性。结论槲皮素对硅肺纤维化有一定的防治作用。     

SO2吸入对大鼠肺p53、bax、bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响

[目的]观察SO2对大鼠肺细胞凋亡相关基因mRNA和蛋白表达的影响。[方法]运用荧光实时定量RT- PCR和免疫组化技术研究了不同浓度SO2(0、14、28、56 mg/m3)吸入对大鼠肺细胞p53、bax、bcl-2三种细胞凋亡相关基因mRNA和蛋白表达的影响。[结果]肺中p53和bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值呈剂量依赖性增加,在低浓度SO2(14mg/m3)吸入条件下,p53、bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值虽然有升高趋势,但统计学上未见显著差异, 在SO2浓度为28．00和56．00mg/m3时均为显著增加(与对照组相比,p53:在14mg/m3为1．07倍,在28mg/m3为1．23倍, 在56 mg/m3为1．39倍;bax:在14 mg/m3为1．12倍,在28 mg/m3为1．77倍,在56 mg/m3为2．26倍;bax/bcl-2比值:在 14 mg/m3为1．13倍,在28 mg/m3为2．19倍,在56 mg/m3为3．01倍);而bcl-2 mRNA表达水平呈剂量依赖性降低,在低浓度SO2(14mg/m3)吸入条件下,bcl-2 mRNA水平虽然有降低趋势,但统计学上未见显著差异,在SO2浓度为28．00和 56．00mg/m3时显著降低(与对照组相比,bcl-2:在14mg/m3为0．99倍,在28mg/m3为0．78倍,在56mg／m3为0．73倍)。免疫组化的实验结果表明吸入SO2后大鼠肺中p53和bax蛋白表达水平呈剂量依赖性增加,而’bcl-2蛋白表达水平呈剂量依赖性降低。[结论] SO2可以改变凋亡相关基因的表达,表明SO2可诱导大鼠肺细胞凋亡,这可能与一些凋亡相关疾病的发生有关。这些机制的阐明有助于对SO2毒作用机制的理解和所致疾病的治疗。