HPV16E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞的定位及对凋亡的影响

目的 探讨外源人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)与人Daxx蛋白(hDaxx)在HeLa细胞内的亚细胞定位及诱导HeLa细胞凋亡的影响.方法 Western印迹法检测融合蛋白DsRed-HPV 16 E6和EGFP-hDaxx的表达.激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6和hDaxx的亚细胞定位.将HeLa细胞分为对照组、TNF-α处理组、转染空载体组、转染HPV16 E6组、共转染HPV16 E6和hDaxx组.后4组均经TNF-α诱导.用流式细胞仪测定细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-8与Caspase-3的相对活性.结果 融合蛋白DsRed-HPV16E6和EGFP-hDaxx在细胞内表达并分布于胞质与胞核,出现共定位现象,且部分hDaxx从胞核转移至胞质.转染E6组凋亡率(21.4％±1.1％)低于转染空载体组(27.0％±0.9％,P＜ 0.01);与转染E6组相比较,共转染组凋亡率(32.5％±2.1％)显著升高(P＜0.01).转染E6组Caspase-8和Caspase-3相对活性分别为0.057±0.003、0.054±0.006,均低于空载体组(0.092±0.012、0.093±0.005,均P＜0.01);与转染E6组相比较,共转染组Caspase-8和Caspase-3相对活性(0.109±0.013、0.110±0.004)均显著升高(P值均＜ 0.01).结论 HPV16 E6使部分hDaxx从胞核转位至胞质,二者发生共定位.HPV16E6蛋白可抑制TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡,bDaxx高表达可下调HPV16 E6蛋白这种作用.     

β联蛋白对体外过氧化氢所致人皮肤成纤维细胞衰老表型的影响

目的 观察高表达的β联蛋白对体外过氧化氢（H2O2）所致正常人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老表型的影响。方法 NHSF分别转染pcDNA3.1-β联蛋白或空载体pcDNA3.1,然后150 μmol/L H2O2处理2 h。实验分为转染H2O2处理组（NHSF + β联蛋白 + H2O2）、转空载体H2O2处理组（NHSF + 空载体 + H2O2）以及转空载体组（NHSF + 空载体）。用RT-PCR和Western印迹分析β联蛋白的表达,显微镜观察细胞形态,试剂盒检测衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-β-gal）、细胞活性氧（ROS）以及超氧化物歧化酶（SOD）的活性。所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析,多组间比较采用ANOVA检验。结果 pcDNA3.1-β联蛋白明显上调了NHSF中β联蛋白的表达。NHSF + 空载体 + H2O2组β联蛋白mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.2900 ± 0.0195和0.3130 ± 0.0171）明显低于NHSF + 空载体组（分别为0.5963 ± 0.0400和0.6190 ± 0.0090）,两组比较,均P ＜ 0.05;NHSF + β联蛋白 + H2O2组β联蛋白表达水平（0.7953 ± 0.0074）高于NHSF + 空载体 + H2O2组（P ＜ 0.05）。SA-β-gal染色率在NHSF + 空载体组、NHSF + 空载体 + H2O2组、NHSF + β联蛋白 + H2O2组分别为（2.9667 ± 0.2517）%、（37.70 ± 0.9539）%、（29.330 ± 0.6359）%,各组比较,差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。NHSF + 空载体、NHSF + 空载体 + H2O2、NHSF + β联蛋白 + H2O2组ROS活性分别为（50.9963 ± 9.2688）%、（109.9190 ± 11.5215）%、（75.1063 ± 3.0138）%,SOD水平分别为（88.0856 ± 3.9181）、（35.5585 ± 3.4438）、（61.7029 ± 3.1716） U/mg,各组比较,差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 高表达的β联蛋白能够抑制细胞衰老相关β-半乳糖甘酶（SA-β-gal）和细胞活性氧（ROS）的表达,同时上调了SOD的活性。 【关键词】 β连环素; 过氧化氢; 成纤维细胞; 氧化性应激; 细胞衰老     

基于Wnt/β联蛋白信号通路探讨EphB2抑制剂对皮肤鳞状细胞癌的影响及作用机制

【摘要】 目的 采用分子对接法筛选酪氨酸蛋白激酶受体B2（EphB2）小分子抑制剂,研究其对皮肤鳞状细胞癌（CSCC）的影响及可能机制。方法 利用 Schrodinger对接工具预测EphB2蛋白的三维结构及其配体结合位点,通过分子对接进行高通量虚拟筛选EphB2抑制剂,通过体内外实验验证筛出的EphB2抑制剂山奈苷与芦荟大黄素（AE）抗CSCC的作用及机制。体外实验中,将人CSCC细胞系A431、SCL-1及人永生化表皮细胞HaCaT分别分为空白对照组、二甲基亚砜组、AE组与山奈苷组,通过MTT实验（AE浓度：20、40、80、160 μmol/L;山奈苷浓度：12.5、25、50、100 μmol/L）、划痕实验及Transwell小室实验（AE浓度：80 μmol/L,山奈苷浓度：50 μmol/L）分析EphB2抑制剂对CSCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。体内实验中,SPF级BALB/c雌性裸鼠皮下注射0.2 ml A431细胞悬液,待成功长出瘤体以后,随机分为4组（n = 6）,空白对照组、二甲基亚砜组、AE组（腹腔注射AE 20 mg·kg-1·d-1 AE）与山奈苷组（腹腔注射山奈苷25 mg·kg-1·d-1）;每周测量裸鼠的肿瘤大小和体重;连续给药28 d后,剥取裸鼠移植瘤进行HE染色,qRT-PCR与Western blot分析AE和山奈苷对裸鼠移植瘤中上皮钙黏着蛋白、波形蛋白、磷酸化葡萄糖合成激酶3β（p-GSK-3β）、β联蛋白及GSK-3β表达的影响。组间比较采用单因素方差分析及t检验。结果 筛选出对EphB2具有较高抑制活性的两个小分子化合物AA-504/20999031（山奈苷）和AA-466/21162055（AE）。MTT实验结果表明,与HaCaT细胞相比,AE对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性,且随AE浓度升高毒性变强（F = 17.95,P＜0.001）,作用48 h时,IC50分别为124.59 μmol/L和80.85 μmol/L;山奈苷对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性,且随山奈苷浓度升高毒性变强（F = 11.34,P＜0.001）,作用48 h时,IC50分别为119.64 μmol/L和64.96 μmol/L。划痕实验显示,与二甲基亚砜组细胞迁移距离（88.1±1.4） μm相比,AE组和山奈苷组A431细胞迁移距离［（36.7±1.0） μm和（44.7 ± 3.5） μm］显著缩短（F = 52.34,P < 0.001）,而HaCaT细胞迁移距离差异无统计学意义（F = 1.73,P = 0.238）。Transwell小室实验表明,与二甲基亚砜组A431细胞跨膜细胞数量（195.3 ± 5.7）相比,AE组和山奈苷组A431细胞显著抑制（145.0 ± 2.5和94.7 ± 4.1,F = 72.85,P < 0.001）,而对HaCaT细胞则无明显抑制作用（F = 3.91,P = 0.055）。动物实验表明,与二甲基亚砜组裸鼠移植瘤体积（841.88 ± 84.63） mm3相比,AE组和山奈苷组显著下降［（407.42 ± 70.37） mm3与（368.77 ± 62.7） mm3,F = 73.78,P < 0.001］。HE染色证实,AE和山奈苷干预可改善其病理变化。qRT-PCR与Western印迹结果显示,AE和山奈苷明显上调瘤体组织中上皮钙黏着蛋白与p-GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均P < 0.001）,下调波形蛋白、β联蛋白及GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均P < 0.001）。结论 分子对接筛选的小分子抑制剂与EphB2可形成稳定复合物,并通过影响 Wnt/β联蛋白通路诱导的上皮间质转化现象来抑制CSCC进程。     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43；P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（t = 2.40，P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、人乳头瘤病毒16型E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T细胞浸润的相关性分析

目的 探究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T(Treg)细胞浸润的相关性及临床意义。方法 选取成都医学院第一附属医院2018年1月至2020年1月84例行手术治疗的宫颈癌患者的癌组织作为宫颈癌组,选取同一医院同期手术治疗的42例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的宫颈组织作为CIN组,另选取42例因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者的正常宫颈组织作为正常组。对比分析三组组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量、Treg细胞浸润的情况。结果 宫颈癌组HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺T细胞比例均高于CIN组、正常组,CIN组上述指标均高于正常组(P<0.05);宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量与Treg细胞占CD4⁺T细胞比例呈正相关(P<0.05);HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺...     

人乳头瘤病毒16型 E6通过微小RNA-504调控宫颈癌细胞增殖、侵袭和凋亡的研究

目的 探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6通过微小RNA(miR)-504对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法 将体外培养的SiHa细胞分为对照组、空载体组、E6过表达组、E6过表达+miR-NC组和E6过表达+miR-504组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HPV16 E6 mRNA和miR-504的表达;采用免疫印迹法检测HPV16 E6蛋白表达;采用噻唑蓝(MTT)法、Transwell小室和流式细胞仪分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡情况。结果 与对照组和空载体组比较,E6过表达组细胞中HPV16 E6蛋白和mRNA表达水平均明显升高,而miR-504表达水平降低(P<0.05);与对照组比较,E6过表达组细胞增殖活力和侵袭能力明显升高,而细胞凋亡率降低(P<0.05);与E6过表达组和E6过表达+miR-NC组比较,E6过表达+miR-504组细胞中miR-504表达水平和细胞凋亡率明显升高,而细胞增殖活力和侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论 HPV16 E6可能通过下调miR-504的表达促进宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭并抑制其细胞凋亡。     

尖锐湿疣、鲍温样丘疹病及鲍温病皮损中人乳头瘤病毒感染与P16蛋白表达的关系

目的：探讨鲍温样丘疹病（BP）、鲍温病（BD）及尖锐湿疣（CA）皮损中高、低危人乳头瘤病毒（HPV）感染对P16蛋白表达的影响。方法：用荧光定量PCR（FQ－PCR）方法检测30例CA病损及12例正常人皮肤粘膜中HPV6／11、HPV16／18DNA；用原位杂交方法检测30例BP、15例BD中HPV16DNA；用免疫组化方法检测上述组织中P16蛋白、Ki-67蛋白的表达。结果：在HPB感染皮损中，P16蛋白、Ki-67蛋白的表达均增高（P＜0．05），且在HPV16阳性的BP、BD中的表达高于HPV6／11感染的CA（P＜0．05）；P16蛋白表达与Ki-67蛋白表达呈正相关（P＜0．05）。结论：HPV感染皮损中，P16蛋白的过度表达可能是机体对HPV感染引起细胞异常增殖的一种反馈调节；P16蛋白表达的不同可能是由于高、低危HPV引起的Rb蛋白功能失活不同。     

核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

【摘要】 目的 研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达,及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法 收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过 qRT-PCR分析 E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s）和色素痣细胞中的表达,免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞,通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。结果 7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞（均P < 0.001）。qRT-PCR显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达（0.000 55 ± 0.000 17）高于色素痣组织（0.000 18 ± 0.000 09,t = 3.22,P < 0.001）。免疫组化、Western印迹显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织（均P < 0.001）,而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组（均P < 0.001）。相关性分析显示,恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关（免疫组化：r = -0.56,Western印迹：r = -0.63,均P < 0.01）。敲减A375细胞E2F6基因后,E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组（t = 3.38、2.76,P < 0.001）。CCK-8实验显示,继续培养后48 h,E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组（t = 4.58,P < 0.01）;软琼脂平板实验显示,E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组（t = 2.26,P＜0.001）;迁移实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（165 ± 23）低于对照组（376 ± 22,t = 3.14,P < 0.01）;侵袭实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数（96 ± 11）低于对照组（315 ± 31,t = 2.12,P < 0.01）;3D细胞培养实验显示,E2F6抑制组细胞形态发生明显变化,侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示,E2F6抑制组G0 - G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组（均P < 0.001）。Western印迹显示,E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组（P < 0.001）,P21蛋白水平高于对照组（P＜0.001）;E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组（P < 0.001）,而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组（P < 0.001）。结论 核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达,敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。     

紫檀芪对人乳头瘤病毒16整合感染宫颈上皮细胞系生长、凋亡和自噬的影响

【摘要】 目的 探讨紫檀芪对人乳头瘤病毒16（HPV16）整合感染宫颈上皮细胞（H8细胞）生长、凋亡和自噬的影响。方法 紫檀芪与H8细胞共培养24 h和48 h,使用CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测H8细胞凋亡和细胞周期,荧光显微镜观察MDC染色后细胞自噬形态学改变,Western印迹检测各组细胞周期相关蛋白（cyclinD1）、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9）、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62）、HPV致癌基因蛋白（E6、E7蛋白）的表达。采用单因素方差分析、重复测量方差分析和LSD-t检验分析组间差异。结果 对照组（0）、25、50、75、100 μmol/L紫檀芪作用H8细胞48 h后,各组细胞相对生长率（100.00% ± 1.56%、99.02% ± 4.97%、93.59% ± 2.01%、81.28% ± 4.90%、69.17% ± 7.56%）差异有统计学有意义（F = 77.22,P < 0.05）,随着浓度增加生长率渐降低,各紫檀芪组与对照组比较,均P < 0.05。紫檀芪作用H8细胞24 h后,各组细胞G1 期、G2期、S期细胞比例差异均有统计学意义（F = 7 845.00、51.14、266.50,均P < 0.05）,各紫檀芪组G1期、G2期细胞比例均高于对照组,S期细胞比例均低于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用48 h后,0 ~ 100 μmol/L组细胞凋亡率分别为11.58% ± 0.50%、14.66% ± 0.22%、13.50% ± 0.49%、14.56% ± 0.19%、15.30% ± 0.76%,各紫檀芪组均高于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用24 h后细胞MDC染色显示,对照组中仅有少量H8细胞检测到高亮点状荧光,各紫檀芪组高亮点状荧光的自噬小体较对照组增多。Western印迹显示,紫檀芪作用24 h、48 h后各组细胞cyclinD1、caspase3、caspase9、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62、E6、E7蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较,紫檀芪处理后cyclinD1表达降低,caspase3、caspase9表达升高,Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62升高,E6、E7表达降低（个别浓度组与对照组比较P > 0.05,多数组间比较P < 0.05）。结论 紫檀芪可抑制H8细胞增殖,促进其凋亡和自噬,抑制E6、E7致癌基因的表达。     

皮肤鳞状细胞癌组织中miR-21、miR-31、Ras GTP酶激活蛋白1表达与人乳头瘤病毒的相关性研究

目的:测定皮肤鳞状细胞癌(CSCC)组织中人乳头瘤病毒(HPV)、miR-21及miR-31的表达量,分析HPV感染与miRNA之间的相关性,并探讨miR-31可能的致癌机制。方法:采用HPV DNA检测试剂盒和巢式聚合酶链式反应(PCR)检测CSCC组和正常对照组中HPV表达情况,实时荧光定量PCR分别测定HPV阳性和阴性CSCC组织中miR-21及miR-31的表达量,免疫组化检测CSCC组织中Ras GTP酶激活蛋白(RASA)1表达水平。结果:CSCC组织中HPV检出率为18.29%(15/82)。miR-21和miR-31在CSCC组织中相对表达量分别为0.2750±0.2280和0.0130±0.0220,均高于正常对照组(0.0110±0.0190、0.0002±0.0002),差异均有统计学意义(P均0.05);RASA1蛋白在CSCC组织中表达明显减少(P0.05)。在HPV阴性组织中RASA1蛋白表达与miR-31水平呈负相关(r=-0.588,P0.05)。结论:HPV可能在CSCC发展早期起一定作用;miR-31可能是HPV相关性miRNA;高表达的miR-31可能通过下调RASA1促进细胞增殖,参与CSCC的发生及发展。     

热休克蛋白110对人乳头瘤病毒16型E711-20配体的佐剂效应研究

目的 探讨热休克蛋白（HSP）110对人乳头瘤病毒（HPV）16型E711-20配体的免疫佐剂效应。方法 体外构建HSP 110与HPV 16型E711-20配体的复合物。将C57BL/6雌性6周龄小鼠15只随机分为3组：复合物组、配体组和磷酸盐缓冲液（PBS）组,每组5只,腹腔注射免疫复合物100 μg,肽10 μg,PBS 100 μl,2周后重复1次,第2次免疫2周后,分离脾细胞作为效应细胞。免疫小鼠后采用噻唑蓝法（MTT）判断脾淋巴细胞增殖活性,干扰素γ（IFN-γ）胞内染色法检测小鼠脾细胞中特异性细胞毒T淋巴细胞,并以标准51Cr释放实验检测特异性细胞毒T淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应。采用SPSS10.0软件进行t检验。结果 HSP110与HPV16型E711-20配体的复合物免疫小鼠后脾淋巴细胞增殖活性（增殖指数为1.87 ± 0.12）和CD8+ IFN-γ+ T细胞的频率（3.9%）显著高于配体组（分别为0.32 ± 0.071和0.4%）,差异均有统计学意义（P < 0.01）。配体的复合物对靶细胞的杀伤效应（效靶比为100 ∶ 1、50 ∶ 1、25 ∶ 1、12.5 ∶ 1时,杀伤率分别为54.7%、72.2%、61.5%、39.8%）显著高于配体组（分别为35.2%、49.3%、28.1%、17.4%）。结论 HSP110能增强HPV16型711-20配体的免疫效应,具有较好的免疫佐剂作用。     

circIGF2BP3调控光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的研究

【摘要】 目的 初步探究circIGF2BP3对光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法 取中山大学附属第三医院泌尿外科6例儿童包皮环切术后包皮组织,分离培养成纤维细胞,以每日10 J/cm2长波紫外线（UVA）连续照射14 d,建立UVA诱导的光老化成纤维细胞模型（UVA处理组）,未经处理的正常成纤维细胞作为对照组,β半乳糖苷酶染色、Western印迹法检测P21蛋白表达,CCK8法检测细胞活力验证建模是否成功。Western印迹法检测光老化成纤维细胞中自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达,qRT-PCR验证光老化与正常成纤维细胞间circIGF2BP3表达差异,并对其进行生物学注释。将原代成纤维细胞分为4组：空载组、UVA + 空载组,circIGF2BP3过表达组、UVA + circIGF2BP3过表达组,Western印迹法检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平。两独立样本均数的比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 UVA处理组β半乳糖苷酶染色阳性率（61.33% ± 5.78%）、P21蛋白表达（1.25 ± 0.03）均显著高于对照组（6.37% ± 0.32%、1.00 ± 0.05,t = 9.49、4.26,P < 0.01、< 0.05）,而细胞活力（74.33% ± 3.48%）显著低于对照组（100%,t = 7.38,P < 0.01）。UVA处理组P62蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均显著高于对照组（均P < 0.05）。光老化成纤维细胞中circIGF2BP3的相对表达量为0.72 ± 0.04,显著低于对照组（1.00 ± 0.03）,t = 5.46,P < 0.01。circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（0.60 ± 0.01）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（0.71 ± 0.01）均显著低于空载组（1.00 ± 0.02、1.00 ± 0.01;t = 16.25、2.75,P < 0.01、P < 0.05）;UVA + circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（1.05 ± 0.02）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（2.04 ± 0.05）亦均显著低于UVA + 空载组（1.31 ± 0.02、2.72 ± 0.14;t = 10.49、6.47,均P < 0.01）。结论 circIGF2BP3可调控UVA诱导的光老化皮肤成纤维细胞自噬水平,为防治光老化提供了新的潜在治疗靶点。     

氟芬那酸丁酯软膏对SKH-1无毛小鼠的光保护作用

【摘要】 目的 探讨氟芬那酸丁酯软膏能否对紫外线（UV）致SKH-1无毛小鼠日晒伤、皮肤光老化及皮肤鳞状细胞癌提供光保护作用。 方法 128只SKH-1无毛小鼠随机分为UV组、氟芬那酸组（氟芬那酸丁酯软膏 + UV照射）、基质组（基质 + UV照射）和空白组。以1.5倍最小红斑量的UV单次照射建立急性日晒伤模型（n = 24）,24h后观察皮肤红肿情况,免疫组化检测组织中COX-2表达;以90%最小红斑量为初始剂量,每周照射4次,连续12周和28周,分别建立光老化模型（n = 24）和皮肤鳞癌模型（n = 80）。12周后 Masson染色观察小鼠光老化模型的胶原改变,免疫组化检测组织中Bax、Bcl-2和Caspase 3水平。12 ~ 28周,记录小鼠鳞状细胞癌模型出现的肿瘤。 结果 氟芬那酸丁酯软膏预处理抑制UV照射引起的急性红肿反应（P ＜ 0.05）,降低COX-2的表达（P ＜ 0.05）。12周后,氟芬那酸丁酯软膏减轻皮肤老化,Masson染色显示,该组真皮层胶原带密度高于其他UV组（P ＜ 0.05）。同时免疫组化显示,氟芬那酸组较其他UV组下调Bcl-2,上调Bax和Caspase 3的表达（P ＜ 0.05）。连续28周,氟芬那酸丁酯软膏对小鼠无瘤生存期的影响与其他UV组相比差异有统计学意义（均P ＜ 0.05）,推迟了肿瘤的出现。 结论 氟芬那酸丁酯软膏具有一定的光保护作用。 【关键词】 氟芬那酸丁酯软膏; 紫外线; 光; 晒伤; 小鼠     

锌指蛋白A20和NF-κB在皮肤鳞状细胞癌的表达及其与人乳头状瘤病毒感染的关系

目的 探讨皮肤鳞状细胞癌（皮肤鳞癌）组织中锌指蛋白A20、核因子κB（NF-κB）的表达及其与人乳头状瘤病毒（HPV）感染的关系。 方法 收集43例皮肤鳞状细胞癌和21例健康人皮肤组织,利用基因芯片法检测21种HPV亚型,免疫组化法检测锌指蛋白A20和NF-κB表达水平,分析临床病理特征及其与HPV感染的关系。 结果 锌指蛋白A20、NF-κB的表达水平在皮肤鳞癌患者不同年龄、性别、肿瘤原发部位和组织学分级组间差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）;皮肤鳞癌临床不同分期组间锌指蛋白A20、NF-κB的表达水平（Ⅰ + Ⅱ级组39例和Ⅲ级组4例锌指蛋白A20分别为25.85 ± 3.84和48.34 ± 7.69,NF-κB分别为46.64 ± 8.93和57.34 ± 10.02）以及有无淋巴结转移组间（有转移组3例和无转移组40例锌指蛋白A20分别为35.34 ± 6.02和26.51 ± 4.09,NF-κB分别为57.53 ± 13.32和45.45 ± 9.64）差异均有统计学意义（P ＜ 0.05或 ＜ 0.01）。在低危型HPV、高危型HPV、高危型/低危型混合感染的皮肤鳞癌组织中,A20表达分别为8例中2例、13例中5例和3例中1例阳性,NF-κB p65表达分别为3、10和2例阳性,经Fisher精确概率法计算,NF-κB p65与A20在3组中表达的阳性率差异均无统计学意义（P > 0.05）。HPV感染的鳞癌组织中锌指蛋白A20和NF-κB p65染色积分呈显著正相关（r = 3.14,P ＜ 0.05）。 结论 A20与NF-κB高表达在HPV感染致皮肤鳞癌形成过程中发挥了重要的作用。     

lncRNA DLX6-AS1通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭

【摘要】 目的 研究长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1（lncRNA DLX6-AS1）对皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭的影响及潜在机制。方法 以双荧光素酶报告系统实验验证lncRNA DLX6-AS1与miR-16-5p、miR-16-5p与核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1（NUCKS1）mRNA的靶向结合。通过单独或联合转染lncRNA DLX6-AS1抑制物（si-DLX6-AS1）、miR-16-5p抑制物（anti-miR-16-5p）、NUCKS1抑制物（si-NUCKS1）和相应对照（DLX6-AS1-NC、anti-miR-NC、NUCKS1-NC）调控A431细胞目的基因的表达，采用qRT-PCR 检测A431细胞lncRNA DLX6-AS1、miR-16-5p、NUCKS1 mRNA的表达；Western印迹检测NUCKS1、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗体、基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP9蛋白水平；CCK8实验检测细胞存活率；Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。两组间比较采用独立样本t检验。结果 双荧光素酶报告系统实验显示，lncRNA DLX6-AS1靶向结合miR-16-5p，miR-16-5p靶向结合NUCKS1。si-DLX6-AS1组A431细胞miR-16-5p表达水平（3.01 ± 0.31）高于DLX6-AS1-NC组（1.02 ± 0.10，t = 18.33，P < 0.001）；NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于DLX6-AS1-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于DLX6-AS1-NC组（均P < 0.05）。si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数亦低于NUCKS1-NC组（均P < 0.05）。低表达lncRNA DLX6-AS1后，anti-miR-16-5p组A431细胞miR-16-5p表达（0.34 ± 0.04）低于anti-miR-NC组（1.00 ± 0.12，t = 15.65，P < 0.05），Cyclin D1、MMP2和MMP9相对表达水平均高于anti-miR-NC组（均P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均高于anti-miR-NC组（均P < 0.05）。低表达lncRNA DLX6-AS1、敲减miR-16-5p后，si-NUCKS1组A431细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平均低于NUCKS1-NC组（P < 0.05），细胞存活率、迁移和侵袭细胞数均低于NUCKS1-NC组（P < 0.05）。结论 lncRNA DLX6-AS1可通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控A431细胞增殖、迁移和侵袭，lncRNA DLX6-AS1可能是治疗皮肤鳞状细胞癌的潜在分子靶点。