节律基因隐花色素2在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及机制研究

【摘要】 目的 探讨节律基因隐花色素2（CRY2）在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及其机制。方法 咪喹莫特诱导小鼠模型实验：12只C57BL/6雌鼠随机均分为咪喹莫特组（连续外用咪喹莫特乳膏5 d诱导构建银屑病小鼠模型,6只）和对照组（不予任何处理,6只）,第6天处死小鼠,取其背部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达。HaCaT细胞转染实验：使用小干扰RNA（siRNA）技术在HaCaT细胞中敲减CRY2的表达（siRNA-CRY2组）,以siRNA-NC组作为对照,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色检测HaCaT细胞增殖活力,实时荧光定量PCR（qPCR）检测HaCaT细胞中趋化因子mRNA表达水平,Western印迹检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）蛋白的磷酸化水平。肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激动物和细胞实验：12只C57BL/6雌鼠随机均分为TNF-α组（小鼠耳部皮下连续注射TNF-α溶液6 d,6只）和磷酸盐缓冲液（PBS）组（注射等量的PBS,6只）,第7天处死小鼠,取其耳部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达;用50 ng/ml TNF-α刺激CRY2基因敲减的HaCaT细胞12 h（siRNA-CRY2 + TNF-α组）,以siRNA-NC + TNF-α组作为对照,qPCR检测各组细胞中趋化因子mRNA的表达。统计分析采用两独立样本t检验。结果 免疫荧光染色显示,咪喹莫特组小鼠背部表皮层中CRY2蛋白的表达（0.94 ± 0.23）显著低于对照组（2.30 ± 0.25,t = 3.99,P = 0.016）。HaCaT细胞转染实验：siRNA-CRY2组EdU阳性细胞比例（48.13% ± 10.97%）显著高于siRNA-NC组（38.23% ± 0.81%,t = 5.00,P = 0.007）,且siRNA-CRY2组趋化因子CXCL1、CXCL8 mRNA相对表达量及p-ERK1/2蛋白相对表达量均显著高于siRNA-NC组（均P < 0.05）,但两组间CCL20 mRNA表达量及ERK1/2蛋白表达量差异无统计学意义（均P > 0.05）。TNF-α刺激实验：免疫荧光染色显示,TNF-α组鼠耳表皮组织中CRY2蛋白表达水平（0.37 ± 0.34）显著低于PBS组（2.04 ± 0.17,t = 4.38,P = 0.012）;siRNA-CRY2 + TNF-α组HaCaT细胞趋化因子CXCL1、CXCL8、CCL20 mRNA相对表达量均显著高于siRNA-NC + TNF-α组（均P < 0.05）。结论 CRY2在银屑病小鼠模型中表达降低,促进了角质形成细胞的增殖以及趋化因子CXCL1、CXCL8和CCL20的表达,且TNF-α可能是下调CRY2表达的上游细胞因子。     

microRNA-125a在寻常型银屑病皮损中的表达及其对HaCaT细胞增殖的影响

【摘要】 目的 检测寻常型银屑病皮损中microRNA-125a（miR-125a）的表达与皮损处炎症因子水平的相关性及其对人永生化角质形成细胞（HaCaT）增殖的影响。方法 收集2017—2018年沈阳市第七人民医院40例寻常型银屑病患者皮损及相邻非皮损组织,采用反转录实时荧光定量PCR检测组织中miR-125a的表达及皮损组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-17 mRNA的表达。将miR-125a过表达质粒、过表达对照质粒、miR-125a干扰质粒、干扰对照质粒转染HaCaT细胞,在转染后0、24、48、72 h采用CCK8法检测各组HaCaT细胞增殖能力,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测质粒转染后HaCaT细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平。相关性分析采用Spearman等级相关检验分析,两组间均数比较采用t检验。结果 寻常型银屑病皮损区miR-125a相对表达水平（2-ΔΔCt,0.389 ± 0.354）低于非皮损区（1.106 ± 0.396,t = 7.717,P < 0.001）。银屑病皮损组织中miR-125a表达与TNF-α、IL-1β、IL-17 mRNA的表达呈负相关（r = -0.447、-0.424、 -0.436,均P < 0.01）。转染相应质粒后0、24 h时,细胞增殖能力在过表达miR-125a组与过表达对照组（t = 0.282、1.445,均P > 0.05）、干扰miR-125a组与干扰对照组（t = 0.120、1.543,均P > 0.05）间差异无统计学意义;转染后48、72 h时,过表达miR-125a组细胞的增殖能力低于过表达对照组（t = 3.222、4.563,均P < 0.05）,干扰miR-125a组高于干扰对照组（t = 3.036、3.269,均P < 0.05）。MiR-125a过表达组TNF-α、IL-1β的表达水平低于过表达对照组,差异有统计学意义（t = 4.318、3.813,均P < 0.05）。结论 寻常型银屑病患者皮损中miR-125a低表达,miR-125a抑制角质形成细胞增殖,可能在银屑病发生发展中发挥保护作用。     

甘露糖结合凝集素在寻常性银屑病皮损中的表达

目的 检测甘露糖结合凝集素（MBL）在寻常性银屑病患者皮损中的表达,初步探讨皮肤中MBL蛋白与银屑病发病的关系。 方法 采用免疫组化法和Western印迹检测30例进行期寻常性银屑病患者皮损、非皮损区皮肤（皮损周围外观正常皮肤）及30例健康人对照皮肤中MBL的表达。采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,组间资料比较采用t检验。 结果 免疫组化检测显示,银屑病皮损区MBL呈现阳性表达（相对表达量为0.636 7 ± 0.515 1）,非皮损区及健康对照皮肤中MBL表达弱或几乎无表达（分别为0.416 3 ± 0.160 1和0.381 6 ± 0.310 9）,银屑病皮损区较非皮损区和健康对照皮肤显著升高（t值分别为2.24和2.32,均P < 0.05）,非皮损区与健康对照皮肤MBL表达水平间比较差异无统计学意义（t = 1.51,P > 0.05）。Western印迹检测结果显示,银屑病皮损区、非皮损区及健康对照皮肤中均有MBL蛋白表达,相对表达量分别为0.273 1 ± 0.129 4、0.186 3 ± 0.193 1、0.149 2 ± 0.268 7,银屑病皮损区较非皮损区及健康对照皮肤显著增高（t值分别为2.05和2.28,均P < 0.05）,非皮损区与健康对照皮肤表达差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 结论 银屑病患者皮损区MBL蛋白高表达,可能与银屑病的发病存在一定关系。     

寻常性银屑病患者表皮中DNA甲基化转移酶2和3a mRNA的表达

目的 检测寻常性银屑病患者表皮中DNA甲基化转移酶（DNMT2和DNMT3a）mRNA表达。方法 利用实时定量PCR技术检测2009年3月至2010年12月来自中国医学科学院皮肤病医院皮肤科及宜兴市人民医院皮肤科门诊的46例寻常性银屑病患者皮损和非皮损表皮以及来自中国医学科学院皮肤病医院皮肤外科的28例健康对照表皮中DNMT2和DNMT3a mRNA的表达。结果 在银屑病患者皮损、非皮损和对照组表皮DNMT2 mRNA表达水平（2-ΔΔCt值）分别是0.62 ± 0.02、0.36 ± 0.05和0.15 ± 0.11,皮损组明显高于非皮损组（t = 6.23,P < 0.01）,非皮损组明显高于对照组（t = 7.33,P < 0.01）;DNMT3a mRNA表达水平（2-ΔΔCt值）分别是0.85 ± 0.03、0.43 ± 0.04和0.18 ± 0.09,皮损组明显高于非皮损组（t = 5.66,P < 0.01）,非皮损组明显高于对照组（t = 8.62,P < 0.01）。结论 寻常性银屑病患者表皮DNMT2和DNMT3a mRNA均异常高表达。     

肿瘤坏死因子-α、白介素-6和干扰素γ对HaCaT细胞表达CD68抗原的影响北大核心CSCD

目的研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和干扰素γ（IFN-γ）以及细菌脂多糖（LPs）对CD68抗原在角质形成细胞株HaCaT细胞中表达的影响。方法RPMI1640培养液培养的HaCaT细胞随机分成自然增殖孔（无刺激组）、IFN一1刺激孔（组）、TNF-α刺激孔（组）、LPS刺激孔（组）、IL-6刺激孔（组）。培养24h后收集细胞,采用流式细胞仪、免疫组化和RT-PCR方法检测TNF-α、IL-6、IFN-γ和LPS作用HaCaT细胞后CD68表达情况。结果与无刺激组比较,不同刺激因素可使HaCaT细胞CD68阳性细胞数增多,但以TNF-α和IL-6的作用较强（t值为3．60和3．93,P值均〈0．01）,IFN-γ和LPS的作用稍弱（t值为2．38和2．52,P值均〈0．05）。只有IL-6可以使HaCaT细胞CD68阳性细胞平均荧光强度增强（t值为8．34,P值〈0．01）。在IFN-γ和TNF-α、IL-6作用HaCaT细胞24h后均有CD68表达于胞质和胞膜,并且以TNF-α和IL-6作用较强。TNF-α和IL-6作用HaCaT细胞24h后可见CD68mRNA表达明显增强（t值为4．34和7．52,P值均〈0．01）,IFN-γ作用后出现较弱表达（t=2．81,P〈0．05）。结论在IL6、TNF-α、IFN-γ和LPS的作用下HaCaT细胞CD68表达增强。     

Sprouty1、2、4在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达及临床意义

【摘要】 目的 研究Sprouty在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达及其与病情严重度的相关性。方法 2018年5 - 11月于南方医科大学皮肤病医院收集15例寻常型银屑病皮损及10例正常对照皮肤标本,采用免疫组化检测银屑病皮损与对照皮肤组织中Sprouty1、2和4蛋白的分布,Western印迹检测Sprouty1、2和4蛋白的表达,逆转录PCR（RT-PCR）检测Sprouty1、2和4 mRNA的表达。采用Pearson相关分析检验Sprouty蛋白表达量与银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）相关性。结果 免疫组化显示,银屑病皮损和对照皮肤均有Sprouty1、2和4表达,Sprouty1在对照皮肤颗粒层细胞的细胞膜和细胞质呈强表达,在银屑病皮损颗粒层的细胞膜少量表达,Sprouty4在银屑病组中的表达强于对照组,Sprouty2在两组中均少量表达。RT-PCR和Western印迹显示,银屑病组和对照组皮肤中均有Sprouty1 mRNA和蛋白的表达,银屑病组Sprouty1 mRNA（0.844 ± 0.169）和蛋白（0.148 ± 0.141）的表达均明显低于对照组（分别为0.972 ± 0.105和0.413 ± 0.108）,两组比较,均P < 0.05;且银屑病组Sprouty1蛋白表达量与PASI评分呈负相关（r = -0.628,P = 0.012）。银屑病组Sprouty4蛋白和mRNA表达量分别为1.306 ± 0.283、1.727 ± 1.017,均明显高于对照组（0.584 ± 0.304和0.714 ± 0.615）,差异均有统计意义（t值分别为6.063和2.814,均P＜0.05）,且银屑病组Sprouty4蛋白表达量与PASI评分呈正相关（r = 0.812,P < 0.001）;两组均少量表达Sprouty2蛋白和mRNA,组间差异无统计学意义（均P＞0.05）,且蛋白表达量与PASI评分无显著相关性（r = 0.436,P = 0.104）。结论 银屑病皮损中Sprouty1、4蛋白表达水平与PASI评分存在相关性,提示二者与银屑病的发病相关。     

miR-203及其下游靶基因p63、生存素在银屑病皮损中的表达北大核心CSCD

目的 检测寻常性银屑病皮损中miR-203及其下游靶基因p63、生存素的表达水平.方法 实时PCR法检测30例寻常性银屑病患者皮损及30例健康对照皮肤中miR-203、p63、生存素mRNA的表达水平,miR-203以U6为内参照,p63和生存素以GAPDH为内参照;Western印迹法检测靶基因p63、生存素蛋白表达水平,两组间比较采用t检验,寻常性银屑病皮损中miR-203与生存素、p63表达的相关性采用Pearson相关分析.结果 与健康对照皮肤相比,寻常性银屑病皮损中miR-203 mRNA表达量为对照组的（0.41±0.11）倍,表达明显下调（t=3.16,P＜0.05）;其靶基因p63、生存素mRNA表达量分别为对照组的（4.79±0.63）和（3.43±0.46）倍,表达水平明显上调（t值分别为4.72、4.35,均P＜0.05）;靶基因p63、生存素蛋白表达量分别为对照组的（2.40±0.23）,（3.49±0.14）倍,表达水平也明显上调（t值分别为3.87、4.36,均P＜0.05）.寻常性银屑病皮损中miR-203mRNA与生存素mRNA呈负相关（r=-0.36,P＜0.05）,与p63 mRNA呈负相关（r=-0.43,P＜0.05）.结论 miR-203及其下游靶基因p63、生存素可能参与了银屑病的发病过程.     

窄谱中波紫外线对HaCaT细胞增殖及Gadd45α表达的影响北大核心CSCD

目的探讨窄谱中波紫外线（NB-UYB）对HaCaT细胞表达Gadd45α及对细胞增殖、周期的影响。方法分别以100、200、400mJ／cm^2NB-UVB照射HaCaT细胞后,于6、12、24h收集细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测Gadd45amRNA和蛋白水平的变化;CCK8法检测照射后对HaCaT细胞增殖的影响;流式细胞术检测照射后对HaCaT细胞周期的影响。结果HaCaT细胞表达Gadd45α,分别经100、200、400mJ／cm^2NB-UVB照射后,Gadd45α mRNA及蛋白表达水平均在6h升高,12h升高明显,24h表达下降,与未照射组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。三个剂量组照射后12h,Gadd45α mRNA相对A值分别为1．4360±0．6551、1．8633±0．0979、1．9266±0．1724,均高于对照组（0．6000±0．1276）（P〈0．05）;Gadd45α蛋白A值分别为0．0773±0．0005、0．1936±0．0015、0．2373±0．0015,较对照组（0．0290±0．0010）增高（P〈0．05）。NB-UVB照射对HaCaT细胞有抑制作用,其抑制增殖作用呈量效及时效关系;三组照射后HaCaT细胞周期发生改变,G2期细胞比例依次为13．53±1．03、17．77±2．25、30．03±4．29,较对照组（9．24±0．97）显著增高（P〈0．05）,细胞周期被阻滞于G2期。结论NB-UVB照射后HaCaT细胞上调Gadd45α表达;Gadd45α可能参与了紫外线照射后HaCaT细胞增殖抑制、周期阻滞过程。     

本维莫德对HaCaT细胞增殖、炎症因子分泌及皮肤屏障因子产生的影响

【摘要】 目的 研究本维莫德对人角质形成细胞增殖、炎症细胞因子分泌、皮肤屏障蛋白合成以及信号转导与转录激活蛋白1（STAT1）磷酸化的影响。方法 体外培养HaCaT细胞,采用0.1 ~ 1 000 μmol/L本维莫德处理24 h,用CCK8法检测细胞增殖。部分HaCaT细胞分为6组,对照组仅加入DMEM培养基,刺激剂组加入10 μg/L肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素γ（IFN-γ）,本维莫德组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ以及终浓度为1 ~ 10或1 ~ 100 μmol/L本维莫德,AhR拮抗剂组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ、10或100 μmol/L本维莫德以及10 nmol/L StemRegenin1（SR1）,处理24 h后,酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清液中白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-22和胸腺活化调节趋化因子（TARC）的水平,RT-PCR检测HaCaT细胞芳香烃受体（AhR）、细胞色素P450 1A（CYP1A1）、聚丝蛋白、内披蛋白、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和TARC mRNA的表达水平,Western印迹法检测聚丝蛋白、内披蛋白、TSLP和STAT1及磷酸化STAT1（p-STAT1）的蛋白表达水平,免疫荧光检测本维莫德对HaCaT细胞中AhR核转位的影响。计量资料采用非配对Student t检验和单因素方差分析进行比较,Spearman检验分析各指标间的关系。结果 0.1、1、10、100、1 000 μmol/L本维莫德干预HaCaT细胞24 h后,细胞存活率分别为（90.2 ± 2.4）%、（85.4 ± 11.9）%、（52.8 ± 14.0）%、（39.4 ± 7.9）%、（27.5 ± 3.4）%,各组间差异有统计学意义（F = 162.5,P < 0.001）,50%抑制浓度为48.54 μmol/L。与刺激剂组相比,10和100 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞分泌的IL-10水平上升（F = 16.110,P < 0.001）,但100 μmol/L组IL-22（F = 6.884,P < 0.001）和10、100 μmol/L组 TARC水平（F = 7.052,P < 0.001）显著下降。与刺激剂组相比,1 和10 μmol/L本维莫德组CYP1A1 mRNA表达（P = 0.004）和10 μmol/L本维莫德组FLG mRNA表达（P = 0.040）水平显著增高,而10 μmol/L组 TARC mRNA和10 μmol/L组TSLP mRNA表达显著降低（均P < 0.01）,而刺激剂组和本维莫德组间AhR mRNA的表达差异无统计学意义（P = 0.193）。与刺激剂组相比,10 μmol/L本维莫德组聚丝蛋白（P = 0.020）和1、10 μmol/L本维莫德组内披蛋白表达水平（P < 0.001）显著上升,而10 μmol/L TSLP蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）,1和10 μmol/L本维莫德组p-STAT1蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）。与100 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组IL-10分泌水平显著下降（t = 4.794,P = 0.003）,TSLP mRNA的表达显著上升（t = 3.769,P = 0.005）;与10 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组 IVL蛋白表达显著下降（t = 5.117,P = 0.002）,TSLP蛋白表达显著上升（t = 3.117,P = 0.043）, p-STAT1蛋白表达无明显变化（t = 1.400,P = 0.719）。免疫荧光染色显示对照组和1 μmol/L本维莫德组中AhR绿色荧光主要表达于HaCaT细胞胞质中,细胞核中基本无荧光表达;而在10 μmol/L和20 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞的细胞质和细胞核均可见高密度绿色荧光。结论 本维莫德可通过活化AhR信号通路抑制HaCaT细胞增殖,调节炎症因子分泌,上调皮肤屏障相关因子的产生和抑制STAT1磷酸化。     

MiRNA-203在寻常性银屑病皮损的表达及其对HaCaT细胞增殖的影响

目的 研究微小核糖核酸(miRNA)-203在寻常性银屑病患者皮损中的表达,并探讨对角质形成细胞株(HaCaT细胞)增殖的影响.方法 取2014-2016年23例寻常性银屑病患者的皮损组织和相邻非皮损组织.荧光定量PCR法检测组织中miRNA-203的表达水平,并以5'端、3'端地高辛标记的探针对皮肤组织切片中目的miRNA进行原位杂交,观察miRNA-203在皮肤组织中的定位情况.将miRNA-203模拟物(miRNA-203模拟物组)和miRNA-203模拟物阴性对照(阴性对照组)分别转染HaCaT细胞,正常细胞培养组作为空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Western印迹法分别对HaCaT细胞的增殖、细胞周期及相关周期蛋白(Cyclin D1、Cyclin B1)的变化进行检测.结果 miRNA-203特异性地表达在表皮的角质形成细胞中,除细胞核外,细胞质亦有表达,且寻常性银屑病患者皮损组织中miRNA-203表达水平(1.35±0.28)显著高于非皮损组织(0.52±0.09),差异有统计学意义(t=6.76,P=0.012).转染miRNA-203模拟物能抑制HaCaT细胞增殖(F=9.36,P=0.007),且空白对照组、阴性对照组和miRNA-203模拟物组HaCaT细胞增殖率均随时间的延长逐渐增加(F=18.68,P＜0.001).与阴性对照组和空白对照组相比,miRNA-203模拟物组HaCaT细胞被阻滞在G2/M期(G2/M期细胞比例:31.33％±4.56％比17.02％±3.53％、16.67％±3.32％,均P＜0.05),HaCaT细胞周期蛋白周期蛋白D1表达水平较高(1.15±0.13比0.52±0.05、0.56±0.07,均P＜0.05),而周期蛋白B1水平较低(0.43±0.08比0.93±0.16、0.91±0.0.15,均P＜0.05).结论 miRNA-203可能参与了寻常性银屑病的发生发展过程.     

不同剂量中波紫外线对HaCaT细胞p62及自噬体形成关键基因Beclin-1、Atg12和Atg3的调控效应研究

【摘要】 目的 探讨不同剂量中波紫外线（UVB）照射培养的HaCaT细胞后不同时间点对p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白表达水平的调控效应。 方法 使用4.5、10和50 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞,照射后加入新鲜培养基继续培养4 h和12 h,同时设相同处理但不照射UVB的细胞为对照细胞。另设观察组,在照射后立即（包括对照细胞）,使用含蛋白酶抑制剂E64D（10 μg/L）和胃酶抑素（10 μg/L）的培养基孵育4 h和12 h,以阻断对p62的降解。使用Western印迹法测定HaCaT细胞p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白的表达水平。 结果 50 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞后4 h,p62表达水平（p62与内参的比值为0.473 ± 0.022）较对照细胞（0.246 ± 0.038）升高（t = 15.27,P < 0.05）;阻断溶酶体后,细胞新生p62的水平（0.445 ± 0.035）与阻断溶酶体的对照（0.244 ± 0.016）相比,仍为上调（t = 7.62,P < 0.05）。在4.5 mJ/cm2 UVB照射细胞后12 h,与对照（0.254 ± 0.035）相比,HaCaT细胞p62表达上调（0.497 ± 0.047,t = 22.89,P < 0.05）;阻断溶酶体后,与阻断溶酶体的对照（0.257 ± 0.025）相比,p62表达水平仍然上调（0.548 ± 0.051,t = 17.42,P < 0.05）。4.5 mJ/cm2和50 mJ/cm2 UVB照射后4 h和12 h,对照细胞和照射细胞间的Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异均无统计学意义（P > 0.05）,阻止溶酶体对自噬体内容物的降解也未能发现Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异（P > 0.05）。 结论 p62表达在不同剂量UVB照射和照射后不同时间存在差异调控,并且这种调控效应与自噬体形成可能没有生物学联系。     

喜树碱对低氧诱导HaCaT细胞趋化因子配体20表达的影响

目的观察喜树碱(CPT)对低氧(2%O2)培养下人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)趋化因子配体(CCL20)表达的影响,探讨CPT治疗斑块状银屑病可能的作用机制。方法将HaCaT细胞分为常氧组(21%O2点)和低氧(2%O2点)组,培养12 h,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测CCL20 mRNA 的相对表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)Kit测定细胞培养上清中CCL20表达;将12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L的CPT作用低氧诱导12 h的HaCaT细胞,ELISA Kit测定细胞培养上清中CCL20表达。结果常氧组和低氧组培养12 h,HaCaT细胞CCL20 mRNA 表达(ΔCT值)分别为-15.19±0.13和-13.70±0.10,两组间表达差异有统计学意义(t=-14.430,P=0.001);低氧培养12 h后HaCaT细胞(1×105个细胞)较常氧组CCL20蛋白表达增多,分别为(112.18±28.66)pg/ml、(64.36±47.85)pg/ml,但两组间表达差异无统计学意义(t=-1.485,P=0.212);100.0、200.0 nmol/L CPT处理低氧诱导12 h的HaCaT细胞(1×105个细胞)CCL20的表达分别为(64.35±19.70)pg/ml、(74.35±23.85)pg/ml,溶媒对照组为(112.18±28.66)pg/ml,组间多重比较差异有统计学意义(P0.05)。结论低氧可诱导HaCaT细胞CCL20 mRNA 表达增加;100.0、200.0 nmol/LCPT可抑制HaCaT细胞CCL20蛋白的表达。     

NCSTN基因沉默对HaCaT细胞增殖分化的影响

【摘要】 目的 检测NCSTN基因稳定沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）增殖活性及相关分化蛋白的改变,初步探索反常性痤疮发病的可能机制。方法 构建慢病毒介导shRNA沉默NCSTN基因的HaCaT细胞模型（shRNA组）,转染空载慢病毒的HaCaT细胞作为阴性对照组,实时定量PCR和Western印迹法检测NCSTN基因的沉默效率。CCK8法检测HaCaT细胞增殖活性,实时定量PCR和Western印迹法检测HaCaT细胞角蛋白（CK1、CK5、CK7、CK10、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19、CK20）及其他分化分子（内披蛋白、兜甲蛋白）mRNA和蛋白的表达。两组计量资料的比较采用两独立样本t检验。结果 shRNA组NCSTN mRNA及蛋白表达（0.42 ± 0.19、0.30 ± 0.07）均显著低于阴性对照组（1.00 ± 0.34、1.00 ± 0.26;t = 5.196、2.637,P < 0.001、< 0.05）,基因沉默效率达70%。与阴性对照组相比,shRNA组HaCaT细胞明显增殖活跃,CK16、CK19蛋白表达显著下调（t = 3.787、3.817,P < 0.01、< 0.05）,终末分化分子内披蛋白表达明显降低（t = 2.904,P < 0.05）。结论 稳定沉默NCSTN基因表达会引起HaCaT细胞异常增殖分化,为后续探究NCSTN基因突变引起反常性痤疮提供新思路。     

MiR-486-3p在银屑病皮损的表达及对角蛋白17表达的影响

目的 探讨银屑病患者皮损与健康人皮肤中miR-486-3p表达情况及其对角蛋白17（K17）表达的调控作用。 方法　采用生物信息学方法预测出调节K17表达的微RNA（microRNA）,选取10例银屑病患者皮损和10例健康人皮肤提取RNA,用加PolyA尾法逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行荧光定量。用miR-486-3p模拟物（mimics）和阴性对照物（NC）转染人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）,Western印迹检测K17表达情况;构建双荧光素酶报告系统,其中包括含有K173′UTR的片段,突变1组为将种子序列删除的片段,突变2组为将种子序列间隔突变的片段,突变3组为将种子序列重复2次的片段,并检测miR-486-3p是否与K17 3′UTR种子序列结合而抑制K17表达。 结果　银屑病皮损中miR-486-3P表达水平为0.211 ± 0.120,低于健康对照的0.555 ± 0.425,银屑病皮损为健康对照的0.380,两组比较,t = 2.62,υ = 9,P < 0.05。Western印迹结果显示,miR-486-3p类似物转染HaCaT细胞后,K17表达水平明显降低。双荧光素酶报告系统检测结果,含有K173′UTR种子序列组与突变3组荧光强度分别为65.31 ± 6.32和54.18 ± 10.01,均低于对照组（P < 0.05）;突变1组和突变2组荧光强度分别为114.77 ± 16.14和110.21 ± 12.99,与对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 miR-486-3p 在银屑病皮损中的表达水平低于健康人皮肤,miR-486-3p通过与K17 3′UTR种子序列结合抑制K17表达,提示其表达水平降低及对K17调控作用的改变可能与银屑病的发生与发展相关。     

银屑病患者皮损Toll样受体4、核因子-κBp65、CC趋化因子配体20的表达北大核心CSCD

目的探讨Toll样受体4（TLR4）、核因子（NF）-κBp65、CC趋化因子配体20（CCL20）在银屑病患者皮损区及非皮损区的表达及意义。方法用免疫组化EnVision法检测40例进行期银屑病患者斑块状皮损及20例进行期银屑病患者非皮损区皮肤、10例正常皮肤石蜡标本中的TLR4、NF-κBp65、CCL20的表达,对其在皮损中的表达水平进行相关性分析。结果银屑病皮损区角质形成细胞中TLR4、NF-κBp65、CCL20的表达（A值分别为0．3006±0．1200、0．4551±0．1572和0．3862±0．1304）较正常人皮肤TLR4、NF-κBp65、CCL20的表达（A值分别为0．1379±0．0663、0．1970±0．0679和0．1262±0．0612）及银屑病非皮损区组（A值分别为0．1930±0．0687、0．2626±0．0606和0．2387±0．0467）明显上调（t值分别为4．113、5．044、6．106、3．711、5．265和4．889,均P〈0．05）。与正常人皮肤相比,银屑病非皮损区TLR4、NF-κBp65、CCL20表达明显上调（t值分别为2．118、2．685和5．608,均P〈0．05）。银屑病患者TLR4、NF-κBp65、CCL20的表达水平问均呈正相关（r值分别为0．766、0．851和0．885,均P〈0．05）。结论TLR4、NF-κBp65、CCL20的高表达可能与银屑病发病有关。     

Nrf2蛋白在中波紫外线照射HaCaT细胞中的光保护作用

【摘要】 目的 探讨Nrf2对中波紫外线（UVB）致HaCaT细胞光损伤的保护作用及其作用机制。方法 将培养的HaCaT细胞分为对照组、UVB组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组，Nrf2组、Nrf2 + UVB细胞感染Nrf2基因过表达慢病毒，UVB组、Nrf2 + UVB组细胞以30 mJ/cm2的UVB照射30 s，继续培养24 h，观察UVB照射后HaCaT细胞形态的变化，Western印迹检测各组Nrf2蛋白水平，CCK8法检测各组细胞生存率，流式细胞仪检测各组细胞活性氧（ROS）水平，生化法检测超氧化物歧化酶（SOD）水平。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果 对照组 HaCaT 细胞形态为多角形、呈簇集状生长，UVB照射后细胞出现皱缩、变圆，漂浮细胞数增多，贴壁数量明显减少。对照组、UVB 组、Nrf2组、Nrf2 + UVB组Nrf2蛋白相对表达水平分别为1.84 ± 0.047、0.63 ± 0.082、2.19 ± 0.168、1.43 ± 0.069，差异有统计学意义（F = 64.81，P < 0.05），Nrf2组水平高于对照组（t = 14.82，P < 0.05）；4组细胞生存率分别为98.00% ± 2.39%、24.40% ± 2.98%、71.63% ± 3.39%、43.38% ± 3.39%，差异有统计学意义（F = 236.66，P < 0.05），UVB 组细胞活力低于对照组（t = 33.34，P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 10.07，P < 0.05）；4组细胞的相对ROS含量分别为1.27 ± 0.10、5.65 ± 0.19、2.10 ± 0.73、3.67 ± 0.19，差异有统计学意义（F = 481.39，P < 0.05），UVB组高于对照组（t = 33.68，P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 12.47，P < 0.05）。4组细胞SOD水平差异有统计学意义（F = 170.76，P < 0.05），UVB组低于对照组（t = 11.25，P < 0.05）和Nrf2 + UVB组（t = 17.52，P < 0.05）。4组细胞IL-6水平差异有统计学意义（F = 532.34，P < 0.05），UVB 组高于对照组（t = 28.48，P < 0.05），Nrf2 + UVB组低于UVB 组（t = 27.82，P < 0.05）。4组细胞TNF-α水平差异无统计学意义（F = 2.02，P = 0.19）。结论 Nrf2可以通过降低细胞内ROS水平，提高内源性抗氧化酶SOD的活性，保护细胞免受UVB照射引起的氧化损伤。     

缺氧诱导因子-1α小干扰RNA对HaCaT细胞VEGF表达的影响

目的 探讨缺氧诱导因子-1α( HIF-1α )RNA干扰对低氧条件下HaCaT细胞HIF -1α和血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法 将HaCaT细胞分为4组：常氧对照组(无干预因素)、低氧组(缺氧培养24h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧培养24h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧培养24 h)。荧光实时定量PCR法检测各组HaCaT细胞HIF-1α和VEGF mRNA表达水平,Western印迹检测各组HaCaT细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达水平。结果 低氧组和常氧对照组HIF-1α mRNA的表达水平分别为0.907±0.032和0.878±0.034,两者比较差异无统计学意义(F=1.108,P＞0.05),而低氧组VEGF mRNA和HIF-1α及VEGF蛋白的表达水平分别为0.935±0.032和0.813±0.047,0.791±0.030,均较常氧对照组(分别为0.652±0.053、0.236±0.014和0.316±0.013)明显增高(P值均＜ 0.05);RNA干扰组HIF-1α mRNA及蛋白的表达水平为0.230±0.044和0.213±0.026,VEGF为0.497±0.033和0.249±0.028,均较脂质体对照组(分别为0.978±0.030、0.817±0.049和0.806±0.040、0.833±0.052)显著降低(P值均＜0.05)。结论 低氧可以使HaCaT细胞HIF-1α和VEGF的表达增加,而抑制HIF-1α的表达可以使低氧条件下HaCaT细胞VEGF的表达减少。     

中性粒细胞胞外诱捕网通过活化角质形成细胞黑素瘤缺乏因子2炎症小体参与银屑病发生发展

【摘要】 目的 研究银屑病患者皮损处中性粒细胞胞外诱捕网（NET）对角质形成细胞中黑素瘤缺乏因子2 （AIM2）炎症小体的活化作用。方法 收集2018年1 - 12月于第四军医大学西京皮肤医院就诊的进展期寻常型银屑病患者皮损与外周血标本各4份。另外收集4份健康对照皮肤组织标本和3份15岁以下儿童包皮环切术后的包皮标本。采用组织免疫荧光检测正常人皮肤及寻常型银屑病患者皮损处NET及AIM2表达情况。采用磁珠分选患者外周血中性粒细胞,提取NET结构。从包皮组织中分离原代角质形成细胞,分为4组,分别采用PBS（对照组）、NET提取物（NET组）、经DNaseⅠ处理的NET提取物（NET降解组）、DNaseⅠ（降解剂对照组）刺激细胞48 h,Western印记检测4组AIM2炎症小体及其下游分子的表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测NET组及对照组细胞培养上清液中白细胞介素1β（IL-1β）的浓度。采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett-t检验。结果 银屑病皮损表皮处可见NET结构形成及AIM2的表达,而健康对照皮肤未见明显的结构或表达。Western印记显示,不同处理组细胞AIM2蛋白及下游分子IL-1β前体及IL-1β的蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（F = 23.80、5.82、15.64,P < 0.001）,NET组AIM2（1.42 ± 0.03）、IL-1β前体（1.32 ± 0.08）和IL-1β（1.40 ± 0.05）水平均高于对照组（t = 15.14、4.26、8.71,均P < 0.05）,NET降解组AIM2 （1.15 ± 0.07）、IL-1β前体（0.93 ± 0.03）和IL-1β（1.07 ± 0.05）水平与对照组差异均无统计学意义（t = 2.10、2.18、1.40, 均P > 0.05）。NET组细胞上清液IL-1β浓度（13.15 ± 3.77 pg/ml）高于对照组（3.61 ± 0.20 pg/ml,t = 2.53,P < 0.05）。结论 银屑病皮损表皮处存在NET,可能通过活化角质形成细胞AIM2促进IL-1β的剪切及分泌,加重银屑病的炎症进程,参与银屑病发生发展。     

白细胞介素22对人表皮角质形成细胞CC趋化因子配体27表达的影响

目的 研究白细胞介素22（IL-22）对人表皮角质形成细胞CC趋化因子配体27（CCL27）表达的影响及机制。方法 免疫组化法检测10例银屑病患者皮损及5例健康对照组皮肤中CCL27的表达。培养HaCaT细胞,分为8组：对照组用PBS处理,IL-22处理组分别用12.5、25、50、100、200 μg/L IL-22处理,信号通路阻断组先分别加入50 μmol/L AG490（JAK2/STAT3通路抑制剂）或PD98059（MAPK-ERK1/2通路抑制剂）阻断处理,2 h后各加入50 μg/L IL-22,继续于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。孵育24 h 后,分别提取 HaCaT 细胞总蛋白并收集上清液,Western印迹、ELISA法分别检测CCL27表达。结果 免疫组化检测示,银屑病患者皮损中CCL27的表达水平明显高于正常人皮肤。Western 印迹显示,HaCaT细胞分别用12.5、25、50、100、200 μg/L IL-22处理后,CCL27相对表达量逐渐升高至0.491 ± 0.013、0.620 ± 0.019、0.623 ± 0.014、0.802 ± 0.052、1.138 ± 0.013,均较对照组（0.413 ± 0.013）升高（P＜0.01）;IL-22 + AG490组及IL-22 + PD98059组CCL27表达量分别为0.411 ± 0.019和0.280 ± 0.012,均低于50 μg/L IL-22组（均P＜0.01）。ELISA法检测显示,各组HaCaT细胞CCL27分泌水平变化趋势与Western印迹法检测结果一致。结论 IL-22可促进HaCaT 细胞CCL27表达,其机制可能与MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3通路有关。