白念珠菌菌丝调控小鼠巨噬细胞自噬关键分子微管相关蛋白1轻链3的实验研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌菌丝对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）自噬流的影响。方法 白念珠菌菌丝分别体外诱导BMDM细胞0.5、4、12 h,以不加菌丝处理的0 h组作为对照,Western印迹法检测各时间点自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换及磷酸化雷帕霉素机制性靶蛋白（p-mTOR）的表达。白念珠菌菌丝分别联合4种溶酶体阻断剂,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d + 胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴弗洛霉素-A1（BAF-A1）、氯化铵及氯喹,体外诱导小鼠BMDM细胞4、12 h,观察白念珠菌菌丝对BMDM细胞基础自噬流的影响。统计分析采用非配对t检验、析因设计的方差分析及LSD-t检验。结果 白念珠菌菌丝体外处理小鼠BMDM 0.5、4和12 h后,与0 h组（0.983 ± 0.030）相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换均增加（1.254 ± 0.118、1.629 ± 0.391、1.598 ± 0.379）,差异有统计学意义（t值分别为3.875、2.856、2.804,均P < 0.05）,但各组p-mTOR的蛋白表达无明显差异。白念珠菌菌丝联合E-64d + pepstatin体外处理BMDM细胞4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平较E-64d + pepstatin单独处理组明显增高,差异均有统计学意义（t值分别3.691、6.648,均P < 0.05）。与相应溶酶体阻断剂组相比,白念珠菌菌丝联合BAF-A1、氯化铵或氯喹4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平均显著升高（均P < 0.05）。结论 白念珠菌菌丝体外诱导可增加小鼠BMDM细胞基础自噬流中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换。     

α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬的影响

目的：评价α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法人皮肤成纤维细胞与终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L 的α硫辛酸孵育4、12和24 h 后,采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性,单丹酰戊二胺（MDC）染色法检测细胞自噬水平,Western 印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-B（LC3-B）表达。结果孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间人皮肤成纤维细胞增殖活性（A490值）差异均无统计学意义（F 值分别为2.85、1.34,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =10.41,P <0.01）。MDC 法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间自噬体阳性细胞百分率差异均无统计学意义（F 值分别为0.11、0.10,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =8.03,P <0.05）。Western 印迹法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间细胞 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）水平差异均无统计学意义（F 值分别为3.38、2.13,均 P >0.05）,但孵育24 h 时各组间差异有统计学意义（F =37.49,P <0.01）。结论α硫辛酸可能抑制人皮肤成纤维细胞基础自噬。     

依维莫司对顺铂产生抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效作用研究

目的 探讨依维莫司是否增加顺铂对人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的杀伤效应.方法 分别用50、100、200 nmol/L的依维莫司和25 μmol/L顺铂处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞12、24h,用AO标记自噬体囊泡并结合溶酶体酶抑制剂分析自噬和自噬流水平.Western印迹分析自噬标记性分子LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化、Caspase 3和PARP剪切;LDH释放实验分析细胞死亡;Annexin V-EGFP染色分析细胞凋亡.结果 50、100、200 nmol/L的依维莫司处理COLO-16细胞后,12 h LC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.52±0.21、4.03±0.39、5.05±0.22,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与未用药物处理的对照组(2.07±0.05)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).24 hLC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.38±0.26、3.29±0.06、6.57±0.16,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与对照组(2.61％±0.16％)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).50、100、200 nmol/L的依维莫司联合E64d、pepstatin处理COLO-16细胞12h后,LC3-Ⅱ与β肌动蛋白的比值分别为1.26±0.40、1.16±0.34、1.21±0.39,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.19±0.27)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).100 nmol/L依维莫司联合E64d、pepstatin自噬体囊泡表达阳性率2.06±0.61,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.68±0.62)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).依维莫司与顺铂联合处理24 h细胞死亡率42.58％±0.93％,高于顺铂单独处理的细胞(死亡率18.20％±1.46％),差异有统计学意义.依维莫司联合顺铂处理与顺铂单独处理细胞相比,Caspase 3和PARP剪切、Annexin V标记细胞数以及LC3-Ⅱ形成均无统计学差异(P＞0.05).结论 依维莫司增强顺铂诱导COLO-1细胞死亡,这种效应不依赖于凋亡和自噬调控.     

带状疱疹患者外周血CD4+ T淋巴细胞及皮损组织中自噬水平的检测

【摘要】 目的 观察带状疱疹患者外周血CD4+ T淋巴细胞、皮损组织表皮中自噬蛋白表达的变化及皮损组织表皮细胞中自噬囊泡的生成情况,探讨水痘-带状疱疹病毒感染与细胞自噬之间的关系。方法 选取2017年12月至2018年12月在解放军南部战区总医院皮肤科就诊的35例带状疱疹患者,男20例、女15例,年龄18 ~ 79（59.23 ± 9.27）岁,疼痛时间（5.14 ± 2.28） d,出疹时间（3.45 ± 1.77） d。流式细胞仪检测患者外周血CD4+ T淋巴细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、Beclin-1、p62的表达,30例健康成人作为对照组。获取12例带状疱疹患者的皮损组织,免疫组化检测表皮中LC3B、Beclin-1、p62的表达,透射电镜观察表皮细胞中自噬囊泡的生成,以同一患者皮损周围未受累皮肤组织作为对照。组间比较采用两独立样本t检验。结果 带状疱疹患者外周血CD4+ T淋巴细胞中LC3B、Beclin-1阳性表达率（61.23% ± 7.61%、35.84% ± 4.22%）明显高于对照组（36.56% ± 4.27%、15.34% ± 1.89%;t = 15.75、24.56,均P < 0.01）,而p62阳性表达率（5.75% ± 0.67%）明显低于对照组（10.03% ± 1.15%,t = 18.65,P < 0.01）。12例带状疱疹患者皮损组织表皮中LC3B、Beclin-1的表达明显高于周围正常皮肤组织,而p62的表达明显低于周围正常皮肤组织（t = 2.86、4.58、2.43,均P < 0.05）。透射电镜观察示,12例带状疱疹患者皮损区表皮细胞中有较多包饶着病毒颗粒的自噬囊泡生成,皮损区自噬囊泡计数明显高于周围正常皮肤（t = 9.67,P < 0.01）。结论 带状疱疹患者外周血CD4+ T淋巴细胞与皮损组织表皮中自噬水平升高。     

H2O2对人皮肤成纤维细胞衰老标记蛋白30及自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达的影响北大核心CSCD

目的 探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老标记蛋白30（SMP30）以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型（LC3Ⅱ）的影响。方法 用150 μmol/L H2O2处理2 ~ 4代NHSF 2 h,构建细胞衰老模型作为H2O2组,而未处理的NHSF作为对照组。细胞衰老β半乳糖苷酶（SA？β？gal）染色法检测衰老细胞比例,间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3的表达,反转录PCR（RT？PCR）检测SMP30 mRNA的表达,Western印迹法检测SMP30和LC3蛋白的表达。结果 H2O2组NHSF的SA？β？gal染色阳性率（41.70% ± 2.95%）显著高于对照组（3.03% ± 0.25%,t = 22.59,P 〈 0.05）。间接免疫荧光结果显示,H2O2组NHSF LC3阳性率（12.60% ± 1.57%）明显低于对照组（23.67% ± 3.04%,t = 5.61,P 〈 0.05）。Western印迹显示,H2O2组LC3Ⅰ/GAPDH比值（0.40 ± 0.02）与对照组（0.41 ± 0.04）比较差异无统计学意义（P 〉 0.05）,而H2O2组LC3Ⅱ/GAPDH比值（0.20 ± 0.02）明显低于对照组（0.80 ± 0.03,t = 29.69,P 〈 0.05）,且H2O2组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（0.51 ± 0.03）亦明显低于对照组（1.98 ± 0.23,t = 10.967,P 〈 0.05）。H2O2组SMP30 mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.16 ± 0.01和0.27 ± 0.02）明显低于对照组（分别为0.35 ± 0.01和0.63 ± 0.02）,均P 〈 0.05。结论 H2O2可降低NHSF中SMP30及LC3Ⅱ的表达水平,加速NHSF衰老。     

circIGF2BP3调控光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的研究

【摘要】 目的 初步探究circIGF2BP3对光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法 取中山大学附属第三医院泌尿外科6例儿童包皮环切术后包皮组织,分离培养成纤维细胞,以每日10 J/cm2长波紫外线（UVA）连续照射14 d,建立UVA诱导的光老化成纤维细胞模型（UVA处理组）,未经处理的正常成纤维细胞作为对照组,β半乳糖苷酶染色、Western印迹法检测P21蛋白表达,CCK8法检测细胞活力验证建模是否成功。Western印迹法检测光老化成纤维细胞中自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达,qRT-PCR验证光老化与正常成纤维细胞间circIGF2BP3表达差异,并对其进行生物学注释。将原代成纤维细胞分为4组：空载组、UVA + 空载组,circIGF2BP3过表达组、UVA + circIGF2BP3过表达组,Western印迹法检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平。两独立样本均数的比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 UVA处理组β半乳糖苷酶染色阳性率（61.33% ± 5.78%）、P21蛋白表达（1.25 ± 0.03）均显著高于对照组（6.37% ± 0.32%、1.00 ± 0.05,t = 9.49、4.26,P < 0.01、< 0.05）,而细胞活力（74.33% ± 3.48%）显著低于对照组（100%,t = 7.38,P < 0.01）。UVA处理组P62蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均显著高于对照组（均P < 0.05）。光老化成纤维细胞中circIGF2BP3的相对表达量为0.72 ± 0.04,显著低于对照组（1.00 ± 0.03）,t = 5.46,P < 0.01。circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（0.60 ± 0.01）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（0.71 ± 0.01）均显著低于空载组（1.00 ± 0.02、1.00 ± 0.01;t = 16.25、2.75,P < 0.01、P < 0.05）;UVA + circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（1.05 ± 0.02）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（2.04 ± 0.05）亦均显著低于UVA + 空载组（1.31 ± 0.02、2.72 ± 0.14;t = 10.49、6.47,均P < 0.01）。结论 circIGF2BP3可调控UVA诱导的光老化皮肤成纤维细胞自噬水平,为防治光老化提供了新的潜在治疗靶点。     

白念珠菌诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞焦亡的初步研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）焦亡的影响。方法 通过活细胞工作站实时观察白念珠菌［感染复数（MOI） = 50,下同］体外诱导BMDM后是否发生焦亡;将BMDM分为对照组、白念珠菌组,分别用磷酸盐缓冲液和白念珠菌酵母诱导BMDM 6 h,实时荧光定量PCR检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （NLRP3）、白细胞介素1β （IL-1β）、IL-18 mRNA表达水平,Western印迹法检测NLRP3、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、Gasdermin D（GSDMD）的表达及剪切水平。用白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后,酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-18分泌水平。白念珠菌体外诱导野生型（WT）BMDM及 GSDMD 敲除（KO）BMDM 15 min,采用流式细胞仪比较WT、GSDMD KO BMDM对白念珠菌的吞噬率;诱导6 h后,采用流式细胞仪及乳酸脱氢酶（LDH）释放法分别检测WT、GSDMD KO BMDM的死亡率。分别设置空白对照组、对照组、样品最大酶活性对照孔组、IL-1β组、白念珠菌组、IL-1β + 白念珠菌组,用IL-1β和/或白念珠菌酵母诱导BMDM后用LDH释放法分析WT及GSDMD KO BMDM死亡率。采用非配对t检验、Kruskal-Wallis 检验、方差分析等统计学方法进行统计分析。结果 白念珠菌体外诱导BMDM后细胞可出现气球样变及出泡现象,证实焦亡发生;与对照组相比,白念珠菌组诱导BMDM 6 h后NLRP3、IL-1β的mRNA表达水平明显升高（t = 13.02、17.51,P = 或＜0.001）,而IL-18 mRNA表达水平无明显变化（P = 0.486）,且白念珠菌诱导可引起炎症小体NLRP3表达增多及Caspase-1、GSDMD剪切。白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后IL-1β的分泌水平随时间逐渐升高（H = 12.90,P = 0.012）,而IL-18的分泌水平无明显变化（F = 0.48,P = 0.753）,且GSDMD KO组BMDM的IL-1β分泌水平低于WT BMDM组（F = 24.22,P = 0.008）。白念珠菌体外诱导15 min后,GSDMD KO BMDM［（50.3 ± 1.10）%］对白念珠菌的吞噬率低于WT BMDM［（58.53 ± 1.19）%,t = 5.09,P = 0.007］;白念珠菌体外诱导6 h后,流式细胞仪检测显示GSDMD KO组BMDM的死亡率（38.40% ± 0.50%）高于WT组BMDM（34.37% ± 0.52%）,t = 4.72,P = 0.009;LDH检测同样显示GSDMD KO BMDM的死亡率（22.52% ± 0.18%）高于WT BMDM（12.48% ± 0.15%）,t = 42.36,P＜0.001;IL-1β预处理后予白念珠菌体外诱导的WT BMDM及GSDMD KO BMDM 的细胞死亡率均较单纯白念珠菌诱导组降低（均P＜0.001）。结论 白念珠菌可诱导BMDM发生焦亡,焦亡的发生可促进IL-1β释放,并通过提高巨噬细胞的免疫活性,降低巨噬细胞死亡率。     

喜树碱对人原代角质形成细胞自噬的影响

目的 探讨喜树碱对人原代角质形成细胞（HPK）自噬的影响。方法 取健康男性包皮组织,采用两步消化法分离提取HPK,取第3代细胞用于实验。将HPK分为实验组和对照组,实验组用200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱处理,对照组用0.1%二甲基亚砜（DMSO）处理。处理24、48 h后,采用CCK8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测药物作用24 h后细胞凋亡;免疫印迹法检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）、p62变化。选取2 μmol/L喜树碱作用HPK 24 h,间接免疫荧光法检测LC3蛋白变化,透射电镜观察自噬体超微结构,进一步确认喜树碱对自噬的诱导效应。结果 随着喜树碱浓度的增加,对HPK的增殖抑制作用逐渐增强,各组24 h增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 152.9,P < 0.01）,其中2、6 μmol/L组高于对照组,差异有统计学意义（t = 12.09、18.76,均P < 0.01）,200 nmol/L组与对照组差异无统计学意义（t = 2.24,P > 0.05）。48 h时各组增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 123.8,P < 0.01）,实验组均高于对照组（均P < 0.01）。对照组和200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱组24 h细胞凋亡率分别为（2.30 ± 1.68）%、（15.90 ± 2.14）%、（29.33 ± 3.51）%、（35.28 ± 3.05）%,差异有统计学意义（F = 89.57,P < 0.01）,各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（均P < 0.01）。2、6 μmol/L喜树碱处理细胞24 h后,LC3Ⅱ蛋白显著上调,p62蛋白表达下调。间接免疫荧光检测显示,2 μmol/L喜树碱组与对照组自噬体阳性细胞比例分别为（60.16 ± 8.78）%、（38.96 ± 13.12）%,差异有统计学意义（t = 3.003,P < 0.05）。透射电镜观察到2 μmol/L喜树碱作用细胞24 h后细胞内形成自噬体和自噬溶酶体。结论 2、6 μmol/L喜树碱可诱导HPK自噬水平升高,同时抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。     

长波紫外线对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响

目的 探讨长波紫外线（UVA）对人皮肤成纤维细胞（HSF）自噬水平的影响。 方法 HSF慢性UVA照射分组：未照射组、5 J/cm2组、10 J/cm2组和20 J/cm2组,每天照射1次连续4 d;HSF急性照射分组：未照射组、5 J/cm2组、10 J/cm2组、30 J/cm2组和60 J/cm2组,单次照射。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐分析法（MTT）检测细胞增殖活力。单丹酰戊二胺染色法（MDC）检测细胞自噬体。Western印迹法检测细胞LC3蛋白LC3-I向LC3-II转化分析（LC3-II/LC3-I）。 结果 与未照射组HSF比较,5、10、20 J/cm2慢性UVA照射组细胞增殖活力降低（F = 155.5,P < 0.05）。与未照射组HSF比较,5、10、30、60 J/cm2急性UVA照射后1、6和12 h,细胞增殖活力均降低（F值分别为1 335、1 649、2 774、均P < 0.05）。MDC法标记细胞自噬囊泡,与未照射组比较,5、10、20 J/cm2慢性照射均可上调细胞自噬水平（F = 748.62,P < 0.05）,而5、10、30、60 J/cm2急性照射后1、6和12 h对细胞自噬水平无明显影响（F值分别为0.014、0.004、0.002,均P ＞ 0.05）。5、10和20 J/cm2慢性照射组LC3-I向LC3-II转化（LC3-II/LC3-I）均增加（t 值分别为9.002、21.772、18.33,均P < 0.05）,细胞自噬水平上调。与未照射组比较,5、10、30、60 J/cm2急性照射后1、6和12 h,细胞LC3-I向LC3-II转化均无明显变化（F值分别为0.13、0.27、0.06,均P ＞ 0.05）,对细胞自噬水平无明显影响。 结论 慢性UVA照射可上调HSF自噬水平,急性UVA照射HSF自噬无明显变化。     

血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应研究北大核心CSCD

目的研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应,初步分析其分子机制。方法采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬,分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力（MTr法）的影响。透射电镜观察自噬体囊泡形成,使用Western印迹法进行自噬标志性分子LC3-I-Lc3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡。对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析。结果血清饥饿HaCaT细胞活力上升,电镜观察和MDC染色发现,血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成。Western印迹显示,血清饥饿细胞LC3-I—LC3Ⅱ转化（LC3-Ⅱ,LC3-I比率为3．5084-0．415）较正常培养的细胞（0．538±0．038）显著上调（两组比较,t=13．32,P〈0．01）;自噬关键基因Atg7表达上调（对照细胞和血清饥饿细胞Atg7／GAPDH分别为0．021±0．006和0．048-4-0．011,t=7．27,P〈0．05）。血清饥饿处理的细胞中,roTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低（对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448／mTOR比率分别为0．762±0．108和0．394±0．048,t=7．58,P〈0．05;磷酸化mTORser248I／mTOR的比率分别为0．263±0．039和0．111±0．020,t=13．77,P〈0．01）。结论血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬,并且导致细胞活力上升。这种自噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。     

西罗莫司和饥饿处理对人A431细胞自噬水平的影响

目的 探讨经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿处理对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431自噬水平的影响。方法 分别将A431细胞和人宫颈癌细胞系HeLa分为对照组（单纯DMEM培养基处理）、二甲基亚砜（DMSO）组、20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、平衡盐溶液（EBSS）组。作用4 h后,Western印迹检测A431细胞和HeLa细胞自噬微管相关蛋白轻链3A/3B（LC3A/B）、重组人γ?氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）的表达水平。吖啶橙染色分析细胞自噬体表达水平。结果 Western印迹检测显示,对照组与DMSO组A431细胞中LC3A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值差异无统计学意义（P > 0.05）;20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、EBSS组LC3 A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值较对照组均明显升高,差异均有统计学意义（P < 0.05）。HeLa细胞Western印迹检测结果与A431细胞类似。双变量相关性分析显示,HeLa细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达呈正相关（r = 0.869,95% CI：0.807 ~ 0.999,P = 0.051）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.742,95% CI：-0.982 ~ 0.406,P = 0.042）;A431细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达亦呈正相关（r = 0.837,95% CI：-0.173 ~ 0.989,P = 0.037）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.684,95% CI：-0.977 ~ 0.500,P = 0.047）。吖啶橙染色显示,A431细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（23.750% ± 0.260%）与EBSS组（32.450% ± 0.488%）同样高于对照组（15.987% ± 0.242%,均P < 0.05）;HeLa细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（33.307% ± 0.715%）和EBSS组（66.097% ± 1.141%）高于对照组（14.117% ± 0.295%,均P < 0.05）。结论 经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿能够上调A431细胞的自噬水平, GABARAP蛋白可能与LC3A/B高度相关。     

西罗莫司对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响

目的研究西罗莫司对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法取健康青少年男子环切术后包皮进行人皮肤成纤维细胞的分离培养,西罗莫司浓度分别为0、0．1、1．0、10．0mg／L处理24h,并设立空白对照。吖啶橙染色检测细胞白噬,Western印迹检测白噬相关蛋白LC3-B及beclinl的表达水平。数据采用SPSSl6．0软件分析,多组问均数行单因素方差分析进行比较。结果0、0．1、1．0、10．0mg／L西罗莫司组吖啶橙染色荧光定量呈浓度依赖性升高,各组问差异均有统计学意义（P〈0．01）;LC3-B及beclin 1的表达水平明显升高,各组问差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论西罗莫司可以提高人皮肤成纤维细胞的自噬水平。     

卵巢滤泡激素在干扰素γ介导的黑素细胞凋亡以及趋化因子分泌中的作用研究

【摘要】 目的 研究卵巢滤泡激素（FLCN）在干扰素γ（IFN-γ）介导的黑素细胞凋亡及趋化因子分泌中发挥的作用。方法 从正常人包皮环切组织及白癜风移植患者正常部位的吸疱表皮分离正常原代黑素细胞及白癜风原代黑素细胞。采用Western印迹检测正常原代黑素细胞、白癜风原代黑素细胞及人原代黑素细胞系PIG1细胞中FLCN蛋白的表达。以10 ng/ml IFN-γ刺激48 h的PIG1细胞为诱导组,未经处理的PIG1细胞为对照组,采用qRT-PCR检测两组细胞FLCN及自噬相关微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅱ、Beclin基因mRNA表达,Western印迹检测FLCN、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化水平。进一步对采用10 ng/ml IFN-γ刺激的黑素细胞感染FLCN抑制病毒进行不同的处理,分为阴性对照组、FLCN抑制组、抑制FLCN及添加mTOR抑制剂的自噬增强组和抑制FLCN及添加AMPK抑制剂的自噬抑制组。采用流式细胞仪检测各组PIG1细胞凋亡,酶联免疫吸附实验检测各组细胞上清液中趋化因子CXCL10和CCL20的浓度。多组间计量资料比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验。结果 正常原代黑素细胞（0.850 ± 0.120）、白癜风原代黑素细胞（1.507 ± 0.170）和PIG1细胞（0.697 ± 0.130）FLCN蛋白的相对表达差异有统计学意义（F = 50.09,P < 0.001）,白癜风原代黑素细胞高于正常原代黑素细胞和PIG1细胞（t = 4.06、5.89,均P < 0.01）。诱导组FLCN mRNA及蛋白相对表达均高于对照组（均P < 0.01）,LC3Ⅱ、Beclin mRNA及蛋白相对表达均低于对照组（均P < 0.01）;诱导组PIG1细胞LC3Ⅱ/Ⅰ水平（0.72 ± 0.02）、AMPK磷酸化水平（0.714 ± 0.023）低于对照组（1.13 ± 0.02、1.176 ± 0.002,t = 7.34、6.67,均P < 0.01）,mTOR磷酸化水平（1.051 ± 0.023）高于对照组（0.451 ± 0.016,t = 3.81,P = 0.009）。对照组、诱导组及各处理组PIG1细胞凋亡率及CXCL10、CCL20浓度差异均有统计学意义（均P < 0.001）,诱导组高于对照组,FLCN抑制组低于阴性对照组,自噬增强组低于FLCN抑制组,自噬抑制组高于FLCN抑制组（均P < 0.05）。结论 白癜风黑素细胞中高表达FLCN,FLCN表达以及下游信号通路受IFN-γ调控,FLCN可通过调节自噬参与IFN-γ介导的黑素细胞凋亡和趋化因子分泌。     

吡咯喹啉醌对小鼠年龄相关皮肤衰老的延缓作用及机制研究

【摘要】 目的 研究吡咯喹啉醌对小鼠年龄相关皮肤衰老的作用及机制。方法 将昆明种小鼠SPF级喂养,分为3组,每组10只,年轻组用普通饮食喂养8个月,年老组用普通饮食喂养20个月构建小鼠自然衰老模型,吡咯喹啉醌组在每公斤普通饮食饲料中添加吡咯喹啉醌4 mg喂养20个月。喂养结束后,取各组小鼠背部皮肤组织,HE染色检测皮肤表皮和真皮厚度;Masson染色检测皮肤总胶原变化;免疫组化检测增殖蛋白Ki67表达变化;透射电镜检测皮肤自噬体变化;Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表达变化,各组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 HE和Masson染色显示,年老组表皮厚度［（15.67 ± 0.36） μm］和真皮厚度［（87.95 ± 11.86） μm］以及总胶原阳性百分率［（22.12 ± 1.72）%］均显著低于年轻组［（29.37 ± 0.25） μm、（264.93 ± 10.34） μm、（45.03 ± 1.54）%,均P＜0.05］,而吡咯喹啉醌组表皮厚度［（25.53 ± 0.47） μm］和真皮厚度［（145.01 ± 9.71） μm］以及总胶原阳性百分率［（31.17 ± 1.20）%］较年老组增加（均P＜0.05）。免疫组化结果显示,年老组皮肤增殖蛋白Ki67阳性细胞表达率［（13.74 ± 3.06）%］低于年轻组［（29.07 ± 2.79）%,P＜0.05］和吡咯喹啉醌组 ［（21.20 ± 1.47）%,P＜0.05］。透射电镜观察显示,年老组与年轻组比较,皮肤自噬体数量增加（P＜0.05）,吡咯喹啉醌组自噬体数量较年老组减少（P＜0.05）。Western印迹实验显示,与年轻组比较,年老组Beclin-1表达降低（P＜0.05）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P＜0.05）,p62表达升高（P＜0.05）;而吡咯喹啉醌组与年老组比较,Beclin1表达升高（P＜0.05）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加（P＜0.05）,p62表达降低（P＜0.05）。结论 吡咯喹啉醌能够延缓小鼠皮肤衰老,其机制可能与增加小鼠皮肤细胞增殖能力和促进皮肤自噬水平相关。     

丹参酮ⅡA体外促进黑素瘤A375细胞自噬及信号通路的实验研究

目的：探讨丹参酮ⅡA体外对黑素瘤细胞A375细胞自噬的影响及其信号通路研究。方法0.5、1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h后,噻唑蓝（MTT）比色法检测A375细胞的增殖活性。1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞48 h,采用流式细胞仪检测细胞自噬小体的数量,Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin?1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）?Ⅱ蛋白及磷酸肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p70S6激酶1（p70S6K1）蛋白的表达水平。结果 MTT分析显示,0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h,均能抑制A375细胞的增殖能力,且抑制作用呈剂量和时间依赖性（F=2564.12、1235.25,均P<0.05）。流式细胞仪显示,1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后,细胞内自噬小体比例分别为6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%,均明显高于对照组（0.41%±0.02%）,各组间差异有统计学意义（均P<0.05）。Western印迹显示,1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后,细胞自噬相关蛋白Beclin?1和LC3?Ⅱ表达水平随丹参酮ⅡA浓度增加而升高,各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义,且高于对照组（均P<0.05）。而PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路中PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度增加而下降,各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义,且低于对照组（均P<0.05）。结论丹参酮ⅡA可通过抑制P13K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路,促进黑素瘤细胞发生自噬。     

不同剂量中波紫外线对HaCaT细胞p62及自噬体形成关键基因Beclin-1、Atg12和Atg3的调控效应研究

【摘要】 目的 探讨不同剂量中波紫外线（UVB）照射培养的HaCaT细胞后不同时间点对p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白表达水平的调控效应。 方法 使用4.5、10和50 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞,照射后加入新鲜培养基继续培养4 h和12 h,同时设相同处理但不照射UVB的细胞为对照细胞。另设观察组,在照射后立即（包括对照细胞）,使用含蛋白酶抑制剂E64D（10 μg/L）和胃酶抑素（10 μg/L）的培养基孵育4 h和12 h,以阻断对p62的降解。使用Western印迹法测定HaCaT细胞p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白的表达水平。 结果 50 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞后4 h,p62表达水平（p62与内参的比值为0.473 ± 0.022）较对照细胞（0.246 ± 0.038）升高（t = 15.27,P < 0.05）;阻断溶酶体后,细胞新生p62的水平（0.445 ± 0.035）与阻断溶酶体的对照（0.244 ± 0.016）相比,仍为上调（t = 7.62,P < 0.05）。在4.5 mJ/cm2 UVB照射细胞后12 h,与对照（0.254 ± 0.035）相比,HaCaT细胞p62表达上调（0.497 ± 0.047,t = 22.89,P < 0.05）;阻断溶酶体后,与阻断溶酶体的对照（0.257 ± 0.025）相比,p62表达水平仍然上调（0.548 ± 0.051,t = 17.42,P < 0.05）。4.5 mJ/cm2和50 mJ/cm2 UVB照射后4 h和12 h,对照细胞和照射细胞间的Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异均无统计学意义（P > 0.05）,阻止溶酶体对自噬体内容物的降解也未能发现Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异（P > 0.05）。 结论 p62表达在不同剂量UVB照射和照射后不同时间存在差异调控,并且这种调控效应与自噬体形成可能没有生物学联系。     

我国不同地域烟曲霉临床分离株CSP基因型及对抗真菌药物的敏感性分析

【摘要】 目的 探讨我国不同地域致病烟曲霉临床分离株CSP基因型分布情况,以及不同地域、不同CSP基因型烟曲霉药物敏感性有无差异。 方法 对福建、上海、河北及北京四地临床分离到的112株烟曲霉分别通过形态学、温度试验及β微管蛋白分子生物学测序鉴定,再对烟曲霉进行CSP基因分型,同时用M38-A方法测定伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B对不同型别烟曲霉的最低抑菌浓度（MIC）。 结果 112株曲霉均鉴定为经典烟曲霉,共确定11个CSP基因型,其中t04A、t03、t01最多见,分别为32株、17株、24株。福建分离株以t10、t04A、t01最常见,上海分离株以t04A、t01最常见,河北分离株以t01、t03、t04A最常见,北京分离株以t02、t04A、t01和t03最常见,t25为1个新CSP基因分型,新基因型菌株的菌落形态、生长速度、最适生长温度与其他菌株并无显著差别。不同CSP基因型烟曲霉对抗真菌药物敏感性差异无统计学意义,但福建地区分离株对伊曲康唑的MIC值低于其他三地的分离株。 结论 烟曲霉临床株CSP基因型存在一定的地域特点,不同基因型的烟曲霉对抗真菌药物的敏感性差异无统计学意义,而不同地域来源烟曲霉对伊曲康唑敏感性存在差异。     

氨基酮戊酸光动力疗法治疗SKH-1小鼠皮肤鳞状细胞癌作用机制研究

【摘要】 目的 探讨氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对小鼠皮肤鳞状细胞癌（SCC）的作用机制。 方法 先建立SKH-1无毛小鼠SCC模型,ALA-PDT治疗前即对照组3只,ALA-PDT治疗后1、3、6、12、24 h组各3只。以透射电镜及TUNEL法观察ALA-PDT治疗后1 ~ 24 h SCC组织肿瘤细胞死亡方式（坏死、凋亡、自噬）;以免疫组化技术检测治疗后7 d SCC组织细胞自噬标记物LC3B、肿瘤局部微血管CD34、肿瘤局部免疫细胞浸润包括树突细胞CD1a、CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞表达的变化。采用SPSS17.0软件进行统计学分析,两样本均数比较采用t检验。 结果 透射电镜观察发现,ALA-PDT治疗后24 h,肿瘤细胞逐渐发生坏死和凋亡,且以细胞坏死为主,巨噬细胞中可见自噬小体。TUNEL检测显示,肿瘤细胞凋亡显著增加（ALA-PDT治疗前及治疗后24 h分别为2.00 ± 0.69和7.30 ± 2.18,P < 0.05）。免疫组化显示,与治疗前比较,ALA-PDT治疗后7 d,CD34表达显著下降（分别为19.00 ± 2.66和1.33 ± 0.58,P < 0.01）,肿瘤局部CD1a表达明显增高（分别为10.33 ± 1.88和23.01 ± 2.04,P < 0.05）,CD4+ T细胞数（分别为12.40 ± 2.27和28.67 ± 1.76,P < 0.05）和CD8+ T细胞数（分别为11.67 ± 1.45和25.79 ± 2.37,P < 0.05）明显增多,同时肿瘤间质中LC3B表达明显增多（分别为21.44 ± 4.3和30.6 ± 3.21,P < 0.05）。 结论 ALA-PDT可通过细胞坏死和凋亡两种方式直接杀伤SCC细胞,未发现肿瘤细胞自噬性死亡;ALA-PDT可损伤SCC组织微血管内皮细胞,诱导局部树突细胞以及CD4+、CD8+ T细胞聚集。     

组织蛋白酶D调控皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的研究

目的 探究组织蛋白酶D（CatD）对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的晚期糖基化终末产物（AGE）的调控作用。方法 分别以CatB + CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂（pepstatin A）、MG-132处理皮肤成纤维细胞,CCK8和荧光法检测细胞活性及蛋白酶活性。CA074Me、pepstatin A、MG-132组分别加入AGE-BSA孵育8 h,而对照组加入磷酸盐缓冲液（PBS）。孵育8 h后,置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h,流式细胞仪检测各时间点胞内AGE-BSA平均荧光强度。以不同浓度pepstatin A（37.5、75、150 μmol/L）或PBS处理皮肤成纤维细胞,加入AGE-BSA孵育,方法同前,ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度,计算降解率。慢病毒转染皮肤成纤维细胞,设空白对照组、空载病毒转染组、CatD高表达慢病毒转染组,荧光显微镜观察,RT-PCR、Western印迹法和荧光法检测各组CatD mRNA和蛋白表达及酶活性。分别加入AGE-BSA孵育,处理及检测方法同前,计算降解率。结果 1 μmol/L CA074Me组、75 μmol/L pepstatin A组及1 μmol/L MG-132组细胞增殖活性均在90%以上,与对照组（100%）差异无统计学意义（F = 1.525,P > 0.05）。去除AGE-BSA 24 h后,CA074Me + AGE-BSA组和MG-132 + AGE-BSA组胞内AGE-BSA荧光强度（275.00 ± 10.15、259.00 ± 11.14）均较其相应8 h点荧光强度（295.00 ± 6.56、285.67 ± 8.74）显著下降（配对t值分别为4.778、6.154,均P < 0.05）,而pepstatin A + AGE-BSA组8 h和32 h点细胞内AGE-BSA荧光强度差异无统计学意义（均P > 0.05）。37.5、75和150 μmol/L pepstatin A组24 h内对吞入胞内AGE-BSA的降解率分别为9.64% ± 1.27%、5.62% ± 0.47%和3.21% ± 0.73%,各组间差异有统计学意义（F = 45.876,P < 0.05）,且该降解率随pepstatin A浓度增加而降低（P < 0.05）。荧光显微镜下观察,空白对照组细胞未见荧光,空载病毒转染组和CatD高表达慢病毒转染组细胞荧光阳性率均在80%以上。CatD高表达慢病毒转染组CatD mRNA、蛋白表达及活性均较另2组显著上调（均P < 0.05）。CatD高表达慢病毒转染 + AGE-BSA组24 h内AGE-BSA的降解率显著高于AGE-BSA组和空载病毒转染 + AGE-BSA组（均P < 0.05）。结论 CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA。     

紫檀芪对人乳头瘤病毒16整合感染宫颈上皮细胞系生长、凋亡和自噬的影响

【摘要】 目的 探讨紫檀芪对人乳头瘤病毒16（HPV16）整合感染宫颈上皮细胞（H8细胞）生长、凋亡和自噬的影响。方法 紫檀芪与H8细胞共培养24 h和48 h,使用CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测H8细胞凋亡和细胞周期,荧光显微镜观察MDC染色后细胞自噬形态学改变,Western印迹检测各组细胞周期相关蛋白（cyclinD1）、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9）、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62）、HPV致癌基因蛋白（E6、E7蛋白）的表达。采用单因素方差分析、重复测量方差分析和LSD-t检验分析组间差异。结果 对照组（0）、25、50、75、100 μmol/L紫檀芪作用H8细胞48 h后,各组细胞相对生长率（100.00% ± 1.56%、99.02% ± 4.97%、93.59% ± 2.01%、81.28% ± 4.90%、69.17% ± 7.56%）差异有统计学有意义（F = 77.22,P < 0.05）,随着浓度增加生长率渐降低,各紫檀芪组与对照组比较,均P < 0.05。紫檀芪作用H8细胞24 h后,各组细胞G1 期、G2期、S期细胞比例差异均有统计学意义（F = 7 845.00、51.14、266.50,均P < 0.05）,各紫檀芪组G1期、G2期细胞比例均高于对照组,S期细胞比例均低于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用48 h后,0 ~ 100 μmol/L组细胞凋亡率分别为11.58% ± 0.50%、14.66% ± 0.22%、13.50% ± 0.49%、14.56% ± 0.19%、15.30% ± 0.76%,各紫檀芪组均高于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用24 h后细胞MDC染色显示,对照组中仅有少量H8细胞检测到高亮点状荧光,各紫檀芪组高亮点状荧光的自噬小体较对照组增多。Western印迹显示,紫檀芪作用24 h、48 h后各组细胞cyclinD1、caspase3、caspase9、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62、E6、E7蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较,紫檀芪处理后cyclinD1表达降低,caspase3、caspase9表达升高,Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62升高,E6、E7表达降低（个别浓度组与对照组比较P > 0.05,多数组间比较P < 0.05）。结论 紫檀芪可抑制H8细胞增殖,促进其凋亡和自噬,抑制E6、E7致癌基因的表达。