NF-κB信号通路介导结肠癌多细胞耐药的作用研究

目的 探讨NF-kB信号通路在结肠癌HT-29细胞多细胞耐药中的作用及可能机制.方法 采用液体重叠培养系统和常规贴壁法对HT-29细胞进行三维(3D)和单层(2D)培养.采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察3D培养的HT-29细胞形态,并采用免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.电泳迁移率改变测定法(EMSA)测定3D和2D培养细胞中NF-kB的活性差异.将3D培养细胞分为两组:3D组(培养液中不加干扰因素)和3D SN50组(培养液中加入50μg/ml SN50处理24h),采用EMSA测定两组NF-kB活性差异.TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bcl-2和Bax)的表达并对蛋白条带的光密度值进行半定量分析,外生半径测定法测定3D培养细胞对氟尿嘧啶的敏感性.结果 3D培养的HT-29细胞悬浮生长,细胞相互聚集增殖形成多细胞球,中心为坏死区,周围由多层异型性细胞组成,外围细胞PCNA阳性染色明显.与2D培养细胞相比,3D细胞中NF-kB活性条带颜色较深.EMSA显示3D SNS0组NF-kB活性较3D组低,TUNEL法显示3D组细胞凋亡率(8.71%±0.73%)较3D SN50组(15.75%±1.02%)明显降低(P<0.01).3D SN50组和3D组中,Caspsse-3活化片段光密度值分别为126.79±13.48和87.24±10.68(P<0.01),Pax蛋白为129.73±15.28和89.26±14.31(P<0.01),Bcl-2蛋白为97.27±12.63和131.24±14.53(P<0.01).结论 NF-kB活性升高是导致结肠癌HT-29细胞多细胞耐药的重要原因之一,其机制可能与凋亡相关蛋白的表达调控有关.     

姜黄素联用长春新碱对人结肠癌细胞凋亡的影响研究

目的:研究观察姜黄素联用VCR(长春新碱)对人结肠癌细胞凋亡的影响.方法:用培养基培养人结肠癌细胞(HT-29),将VCR单独作用于结肠癌细胞作为对照组,姜黄素与VCR共同作用为实验组,利用MTT比色法观察两组细胞的增殖情况,荧光染料双染法检测两组HT-29细胞的凋亡情况,并进行比较.结果:实验组HT-29细胞的增殖明显受到抑制,细胞的凋亡率明显比对照组高,存在统计学意义(P＜0.05).结论姜黄素与VCR共同作用能加强人结肠癌细胞的凋亡,可用于肿瘤的治疗.     

ABCG_2食管癌耐药细胞系Eca109/ABCG_2的建立

目的 探讨腺苷三磷酸结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG_2)在介导食管癌多药耐药中的作用.方法 扩增ABCG_2基因,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNNA3.1-ABCG_2重组质粒,转染Eca109细胞后用G418筛选稳定转染细胞.采用流式细胞术检测细胞内阿霉素的含量,评价细胞对药物的外排作用.MTT法检测阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞生长的抑制作用,并计算半数抑制浓度(IC_(50))和细胞的耐药指数.采用Western blotting和RT-PCR法检测细胞中ABCG_2蛋白及mRNA的表达量.结果 成功建立转染ABCG_2基因的Eca109/ABCG_2细胞.Eca109/ABCG_2细胞中ABCG_2的mRNA和蛋白表达量升高.阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞的IC_(50)值分别为18.61±3.94、4.18±0.14、4.69±0.88μg/ml.Eca109/ABCG_2细胞对阿霉素的耐药指数为3.97,且外排阿霉素的作用增强.结论 Eca109/ABCG_2细胞具有ABCG_2的耐药表型,能够稳定表达ABCG_2蛋白,可作为研究ABCG_2介导的多药耐药相关机制的细胞模型.     

NanoUPLC-nano-ESI-MS/MS鉴定二维凝胶银染后蛋白质点的方法

目的提高银染色后二维凝胶电泳图谱中蛋白质斑点的鉴定率。方法采用欧洲分子生物学实验室（EMBL）银染色方法结合改进后的质谱兼容胶内酶切方法并应用超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱（NanoUPLC-nano-ESI-MS/MS）对二维凝胶电泳上的蛋白质斑点进行分析。结果二维凝胶上50个蛋白质斑点中46个点得到鉴定,共鉴定出74个有意义的蛋白质,其中一个蛋白斑点鉴定出6个有意义的蛋白质。结论该方法获得的样品经质谱检测和网上数据库比对,蛋白鉴定率高达90%以上,与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）方法相比,蛋白质的鉴定率明显提高,表明该方法适合鉴定复合蛋白质斑点,是鉴定银染后二维凝胶蛋白质的一种强有力的分析手段。     

褪黑素对人结肠癌细胞辐射敏感性的影响

目的 分析褪黑素联合γ射线照射对体外和体内人结肠癌HCT 116细胞生长的影响,探讨褪黑素在人结肠癌HCT 116细胞辐射敏感性中的作用。 方法 将人结肠癌HCT 116细胞分为4组,即:空白对照组（不给予任何处理）、褪黑素组（给予褪黑素,给药浓度为1 mmol/L,给药时间为2 h）、照射组（接受6 Gy γ射线照射）及褪黑素+照射组（在照射前2 h给予褪黑素,给药浓度为1 mmol/L,然后接受6 Gy γ射线照射）。体外实验:人结肠癌HCT 116细胞分别进行2、4、6、8 Gy照射,采用克隆形成实验检测细胞的增殖能力;人结肠癌HCT 116细胞进行6 Gy照射,采用流式细胞术检测24 h后细胞周期以及24 h和48 h后细胞的凋亡;采用彗星实验检测2 h后细胞DNA的损伤。体内实验:将人结肠癌HCT 116细胞接种于裸鼠体内建立肿瘤模型,检测结肠癌瘤体体积和瘤体质量的变化并计算抑瘤率。两组间比较采用t检验。 结果 ①体外实验:照射前给予褪黑素处理的人结肠癌HCT 116 细胞的克隆形成数目明显少于对照组,差异有统计学意义（t=3.83,P=0.005）;褪黑素+照射组停留在G₂期的人结肠癌HCT 116细胞比例显著增加（53.04%±4.67%）,与照射组（42.83%±7.10%）和褪黑素组（12.95%±0.96%）相比,差异均有统计学意义（t=2.94、20.66,P=0.017、P<0.01）;褪黑素+照射组在处理后24 h和 48 h大量人结肠癌HCT 116细胞发生细胞凋亡,凋亡率分别达到（12.15±0.41）%和（30.57±1.91）%,与照射组（9.00%±0.70%、8.69%±0.71%）和褪黑素组（3.03%±0.42%、12.56%±0.89%）相比,差异均有统计学意义（t=7.46、17.75、29.12、14.80,均P<0.01）;褪黑素+照射组HCT 116细胞的尾部DNA含量、尾长、尾矩和Olive尾矩均明显高于照射组（t=4.72、4.16、4.74、4.50,均P<0.01）和褪黑素组（t=20.27、22.80、13.81、18.85,均P<0.01）,差异均有统计学意义。②体内实验:褪黑素+照射组结肠癌生长速度减慢,到处理后的第15天肿瘤体积明显小于照射组和褪黑素组,差异有统计学意义（t=3.51、2.72, P=0.006、P=0.021）;褪黑素+照射组抑瘤率最高（54.7%±8.0%）,远远高于照射组和褪黑素组（t=7.50、4.12,均P<0.01）。 结论 褪黑素联合辐射对人结肠癌细胞生长有显著的抑制效应,提高了细胞对γ射线辐射的敏感性。     

99Tcm-MIBI显像对肿瘤多药耐药检测的应用

MDR(多药耐药)是目前肿瘤化疗失败的主要原因,对MDR的检测可以帮助化疗决策的制定,从而使肿瘤患者得到更有效的治疗。99Tcm-MIBI(99Tcm-甲氧基异丁基异腈)是mdr1基因编码的P-gp(P-糖蛋白)和MRP(多药耐药相关蛋白)的转运底物,肿瘤细胞内99Tcm-MIBI摄取减低表明其P-gp的高表达,并与MRP的表达相关。因此,99Tcm-MIBI显像可在治疗前预测对化疗的反应,并为选择更有效的化疗策略提供依据。99m     

分割剂量电离辐射对卵巢癌细胞多药耐药的影响

目的 研究不同分割剂量电离辐射方案对卵巢癌细胞多药耐药性的影响.方法 采用卵巢癌亲本细胞SKOV3及其耐药细胞株SKVCR,分别进行假照射、单次照射(10 Gy)、常规分割照射(2 Gy ×5)和超分割照射(1 Gy×2 ×5).MTT方法检测细胞对4种化疗药物硫酸长春新碱( vincristine,VCR)、依托泊苷(etoposide,VP-16)、盐酸吡柔比星(pirarubicin,THP)和顺铂(cisplatin,DDP)敏感性的变化.Western blot检测P-gp蛋白表达量.结果 与SKOV3相比,SKVCR倍增时间增加为1.8倍,P-gp糖蛋白表达增高,4种药物对SKVCR的IC50浓度明显增加(P＜0.05).在SKOV3中,与假照组相比,单次照射后细胞对THP、DDP药敏性降低,常规分割照射后细胞对VCR、THP、VP-16药敏性降低,超分割照射使VP-16药敏性降低;在SKVCR中,与假照组相比,3个照射组对VCR、VP-16的药敏性增高,对DDP的药敏性无明显改变,单次和分割照射均可降低P-gp表达.结论 单次、分割和超分割照射在SKOV3亲本细胞中诱导多药耐药,在耐药株SKVCR中逆转对VCR、VP-16的耐药性.     

αv整合素沉默对结肠癌多细胞球药物敏感性的影响

目的 应用反转录病毒介导的shRNA沉默αv整合素,探讨后者在结肠癌多细胞球(MCSs)对奥沙利铂耐药中的作用.方法 构建针对αv整合素的反转录病毒质粒,脂质体转染质粒至结肠癌细胞株HT29.采用改良liquid overlay技术培养MCSs;Western blotting检测MCSs中αv整合素蛋白的表达;Cell Counting Kit-8检测梯度浓度(0、5、50、500、5 000μg/L)的奥沙利铂处理后MCSs的存活率.结果测序证实质粒构建成功.Western blotting结果 显示反转录病毒质粒介导的shRNA能有效、特异、稳定地沉默αv整合素基因.沉默αv整合素基因后,MCSs对奥沙利铂的药物敏感性显著增加.奥沙利铂50、500μg/L处理48h后,MCSs的存活率为0.86%±0.05%和0.43%±0.04%,转染反转录病毒的MCSs则下降为0.77%±0.06%和0.30%±0.04%(P<0.05).结论 反转录病毒介导的shRNA能有效沉默αv整合素基因.沉默αv整合素能有效提高结肠癌MCSs对化疗药物奥沙利铂的敏感性.     

肿瘤耐药相关鞘糖脂CMH对人树突状细胞B7表达的影响

为了探讨肿瘤耐药相关鞘糖脂CMH在耐药肿瘤细胞免疫逃避中的作用,用柱层析的方法分离纯化了KBv200细胞的耐药相关中性鞘糖脂CMH,采用流式细胞仪技术检测CMH作用前后人树突状细胞（DC）B7抗原的表达。结果显示,CMH明显地抑制DC B7抗原的表达,说明肿瘤耐药相关鞘糖脂可能是通过对DC的影响而抑制机体的免疫反应。     

NM-3及氧化苦参碱对裸鼠体内耐药人胃癌细胞SGC-7901的分子作用

 目的探讨NM-3及氧化苦参碱对裸鼠体内多药耐药人胃癌细胞SGC-7901的抑制作用及其抗肿瘤作用的分子机制.方法建立多药耐药人胃癌SGC-7901细胞的皮下移植瘤模型并随机分成生理盐水对照组,NM-3、氧化苦参碱、NM-3联合氧化苦参碱治疗组.每组裸鼠在胃癌组织移植7周后处死,并测算其肿瘤抑制率和采用TUNEL(末端脱氧核酸转移酶原位标记)和流式细胞仪法分析其凋亡指数.结果NM-3治疗组(10 mg/L、20mg/L)对多药耐药SGC-7901细胞皮下移植瘤的抑制率显著增加,其凋亡率分别是(11.20±0.18)%和(12.20±1.65)%,两者比较无差异(P＞0.05);NM-3联合氧化苦参碱治疗组凋亡指数(AI)为(51.20±4.23)%,显著高于NM-3治疗组和生理盐水对照组(1.27±0.11%,P＜0.01).结论NM-3可以增强氧化苦参碱对多药耐药细胞SGC-7901的抑制作用,诱导裸鼠体内人胃癌细胞的凋亡,并能增强裸鼠体内胃癌对化疗的疗效和敏感性.     

腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜组织异常表达蛋白质的筛选与鉴定

目的 筛选及鉴定腹泻型肠易激综合征(D-IBS)患者与正常人结肠黏膜组织中的差异表达蛋白.方法 D-IBS患者及健康志愿者各4例,分别为D-IBS组和正常对照组.通过结肠镜取回盲部及乙状结肠黏膜进行活检,用含0.1% PMSF的冰盐水将标本洗净后立即置于液氮中保存.提取蛋白质,采用双向凝胶电泳法筛选差异表达蛋白,并采用质谱法对变化最明显的蛋白点进行鉴定.结果 利用双向凝胶电泳技术成功得到人结肠黏膜组织的蛋白质组图谱.正常对照组图谱平均得到蛋白点336个,组内图像平均匹配率92%,D-IBS组图谱平均得到蛋白点426个,组内图像平均匹配率95%.D-IBS组与正常对照组之间进行平均胶图谱的比较,两组间匹配率为74%.Volume值变化大于2倍以上的点共24个,其中21个点表达上调,3个点表达下调.表达上调最明显的2个蛋白点经鉴定分别为免疫球蛋白J链(Ig-j)和热休克蛋白27(HSP27),表达下调最明显的2个蛋白点则分别为血红蛋白β亚基和果糖二磷酸醛缩酶A.结论 采用双向凝胶电泳法可以成功得到人结肠黏膜组织蛋白质组表达图谱,D-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达存在差异,已经鉴定出来的4个蛋白可能在D-IBS的发病机制中起一定作用.     

结肠癌细胞促人淋巴管内皮细胞体外成管作用的研究

目的探讨结肠癌细胞对人淋巴管内皮细胞(hLECs)体外成管的影响。方法实验组hLECs采用结肠癌细胞SW480的培养上清液进行培养,对照组hLECs采用单纯内皮细胞培养基进行培养。观察两组hLECs体外成管能力的差异;采用免疫荧光法检测hLECs细胞骨架变化情况和Prox-1蛋白表达;Western blotting检测hLECs中整合素α9的表达水平。结果与对照组比较,实验组hLECs的成管能力更强,培养第7天即形成丰富的网状结构,至第14天形成典型的管状结构。从第6天开始实验组形成的小管数量(2.93±0.56条)即明显多于对照组(1.56±0.26条,P<0.05)。实验组微丝结构完整连续,呈极性排列,细胞有伪足伸出,对照组微丝结构不明显;两组的微管结构无明显差异。实验组Prox-1和整合素α9的表达(37.46±16.73,1.20±0.04)与对照组(20.35±12.58,0.59±0.05)比较均有增加(P<0.05)。结论结肠癌细胞在体外可通过外分泌作用促进hLECs形成管状结构。     

西妥昔单抗对人肝癌细胞HepG2的体外效应

目的探讨西妥昔单抗（爱必妥,cetuximab,Erbitux）对人肝癌细胞HepG2的体外效应。方法流式细胞术检测HepG2细胞表面表皮生长因子受体（EGFR）的表达。细胞划痕及Transwell实验检测西妥昔单抗对HepG2细胞迁移能力的影响。Western印迹检测西妥昔单抗对HepG2细胞EGFR、AKT及ERK表达及活化的影响。碘化丙啶（propidium lodide,PI）染色检测西妥昔单抗对细胞周期的影响。结果流式细胞分析结果显示,HepG2细胞表面存在较高水平的EGFR表达;细胞划痕及Transwell结果表明,西妥昔单抗对HepG2细胞迁移能力具有明显的抑制效应;Western印迹结果证明西妥昔单抗能显著降低HepG2细胞内EGFR、AKT及ERK的磷酸化水平;细胞周期分析显示西妥昔单抗作用24 h剂量依赖性影响HepG2细胞周期进程,并将其阻抑在G0/G1期。结论西妥昔单抗可以抑制高表达EGFR的肝癌细胞系HepG2胞内关键信号蛋白的活化,阻滞其细胞周期,抑制肝癌细胞的迁移能力。     

HP培养滤液诱导下抑制bcl-2基因表达对SGC7901细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨bcl-2表达与hTERT、端粒酶活性之间的调控关系,了解HP的致癌机制。方法:在HP培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测bcl-2AODN抑制bcl-2基因之后人SGC7901细胞hTERT蛋白的表达。结果:对照组人SGC7901细胞24h、36h和48h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于经HP培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P<0.05)。在HP滤液诱导下,抑制bcl-2基因的SGC7901胃癌细胞24h、36h和48h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于与SGC7901胃癌细胞(P<0.05),同时显著高于对照组(P<0.05)。结论:bcl-2基因正向调控hTERT蛋白表达,bcl-2表达上调可能是端粒酶活化的主要途径之一。端粒酶的激活不完全依赖于bcl-2途径,还存在其他的调控因素。HP感染不仅通过上调bcl-2的表达,还可以通过其他途径激活端粒酶,这可能是HP感染致癌的一条重要途径。     

Hp培养滤液诱导下抑制hTERT基因对SGC7901细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨bcl-2表达与端粒酶活性二者之间的调控关系,了解Hp的致癌机制。方法:在Hp培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测抑制hTERT基因之后SGC7901胃癌细胞bcl-2蛋白的表达。结果:对照组SGC7901胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数显著低于经Hp培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P<0.05)。在Hp滤液诱导下,抑制hTERT基因的SGC791胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数与SGC7901胃癌细胞无显著差异(P>0.05)。结论:Hp感染可以促进bcl-2蛋白表达,这可能是Hp感染致胃癌的重要机制之一。端粒酶活化不参与调控bcl-2蛋白表达。     

Hp培养滤液诱导下抑制hTERT基因对SGC27901细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的：探讨bcl-2表达与端粒酶活性二者之间的调控关系，了解Hp的致癌机制。方法：在Hp培养滤液诱导前后，采用流式细胞仪检测抑制hTERT基因之后SGC7901胃癌细胞bcl-2蛋白的表达。结果：对照组SGC7901胃癌细胞24h、36h和48h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数显著低于经Hp培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组（P〈0．05）。在Hp滤液诱导下，抑制hTERT基因的SGC791胃癌细胞24h、36h和48h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数与SGC7901胃癌细胞无显著差异（P〉0．05）。结论：Hp感染可以促进bcl-2蛋白表达，这可能是Hp感染致胃癌的重要机制之一。端粒酶活化不参与调控bcl-2蛋白表达。     

心肌梗死后延迟骨髓细胞移植对大鼠心肌细胞bcl-2/bax mRNA及蛋白表达的影响

目的观察心肌梗死(MI)后恢复期延迟的骨髓单个核细胞(BM-MNCs)移植对心肌细胞bcl-2/bax mRNA及蛋白表达的调节作用,并探讨影响凋亡的可能机制.方法通过结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支制成MI模型.2周后第2次开胸,移植组在心外膜下梗死区及周边区多点注射BM-MNCs混悬液200μl(5×106个细胞),对照组予等体积PBS液.TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白在心肌细胞中的表达水平,原位杂交法检测bcl-2、bax mRNA表达变化.结果 TUNEL结果显示心肌细胞凋亡指数在移植组明显低于对照组(4周0.095±0.017 vs 0.173±0.018, P<0.05;8周0.0926±0.014 vs 0.182±0.015,P<0.05).免疫组化结果表明,移植组Bcl-2蛋白表达高于对照组(4周12.66±3.37 vs 5.68±2.53, P<0.05;8周13.08±3.09 vs 5.02±1.91, P<0.05),Bax蛋白表达则低于对照组(4周11.48±3.13 vs 20.12±3.91, P<0.05;8周9.98±3.03 vs 22.74±3.12, P<0.05).第4、8周(治疗后第2、6周),移植组bax mRNA积分光密度和阳性面积较第2周降低,并低于对照组(P<0.05).结论延迟至心肌梗死后2周行骨髓单个核细胞移植可抑制心肌细胞凋亡,其机制可能与对bcl-2、bax表达的调节有关.