1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测

目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。     

Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测

目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平。结果地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠。HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平。肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量最高。结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠。     

中国流行株C基因型HBV稳定复制表达小鼠模型的建立

目的 构建稳定复制中国流行株C基因型HBV的小鼠模型.方法 将携带1.3倍C基因型HBV基因组(adr血清型)的重组腺相关病毒rAAV8-1.3HBV-C转导人肝癌细胞HuH7,采用ELISA法评估HBV抗原(HBsAg、HBeAg)在肝癌细胞中的表达.筛选高表达的重组病毒,经尾静脉注射入6～8周龄C57BL/6小鼠体内,建立HBV-C复制小鼠模型(实验组,n=8);同时建立文献已报道HBV-D复制小鼠模型(对照组,n=7,rAAV8-1.3HBV-D,ayw血清型).动态监测两组小鼠血清(眼底静脉丛采血)HBV DNA载量和HBsAg、HBeAg的抗原表达量;于第9周处死小鼠,HE染色观察肝组织病理改变,免疫组化染色分析HBsAg和HBcAg的表达.结果 重组病毒rAAV8-1.3HBV-C体外转导人肝癌细胞HuH7,72h后细胞上清中可检测到HBsAg和HBeAg的表达.小鼠注射重组病毒后第2、3、5、7、9周,血清HBV DNA存在稳定复制,血清HBeAg表达水平较稳定,但血清HBsAg表达存在波动.两组小鼠肝组织未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常,但可检测到HBsAg和HBcAg蛋白.结论 利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3倍C基因型HBV基因组体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了稳定复制并持续表达C基因型HBV的小鼠模型.     

慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。     

中国流行的C基因型HBV稳定复制表达细胞系的建立

目的 建立中国流行的C基因型HBV的稳定复制表达细胞系.方法 从1例慢性乙肝患者血清中分离克隆得到1株C基因型病毒DNA全序列,以此为模板扩增产生1.3倍体HBV DNA,包含完整基因组(3.2kb)、从1825位点(polyA)至2599位点大小为775bp的3′端冗余序列,以及至1400位点大小为425bp的5′端冗余序列,将其连接改建重组后的pcDNA3.1(+)载体,构建pN31-51-6-1表达质粒,转染肝癌细胞系HepG2.采用ELISA检测HBsAg、HBeAg的瞬时表达情况,选择双高表达细胞孔进一步行G418筛选稳定表达细胞系.通过ELISA、免疫组化、直接免疫荧光流式细胞术以及HBV复制中间体核心颗粒DNA、细胞内cccDNA、分泌上清中病毒DNA的RT-PCR检测等方法评估稳定细胞克隆的复制表达情况.结果 获得1株具有高抗原表达和高复制能力的细胞克隆HepG2-51-6-1,已稳定传代26代.检测HBsAg、HBeAg吸光度(A)值分别为>3.5和1.29;直接免疫荧光流式细胞术证实细胞表面存在s抗原,免疫组化染色可见细胞内病毒表达.分泌到培养上清中的HBV DNA和细胞内的HBV复制中间体水平分别为2.0×104和5.5×105拷贝/ml,HBV cccDNA为6～8拷贝/细胞.结论 成功获得HBV-1.3倍体转染的C基因型HBV稳定复制表达细胞系,为研究我国流行HBV的生物特性和抗HBV新药筛选奠定了基础.     

心肌细胞特异性Let-7b转基因小鼠的建立

目的建立心肌细胞中特异性过表达Let-7b的转基因小鼠。方法构建心肌细胞特异性过表达Let-7b的转基因载体,显微注射导入小鼠受精卵中,通过胚胎移植,获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Let-7b基因整合情况。通过实时定量PCR检测Let-7b过表达的效率。结果 PCR检测发现,1只小鼠在其基因组上整合有Let-7b基因。实时定量PCR结果显示,该转基因小鼠在心脏组织中特异性地过表达Let-7b基因。结论成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性过表达Let-7b的转基因小鼠。     

1.1倍长乙型肝炎病毒基因组在Huh7细胞中的高效复制和表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)1.1倍基因组长度的重组载体,研究其在人肝癌细胞系Huh7中的复制与表达。方法以慢性乙型肝炎患者C基因型HBV DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出HBV基因组的两条DNA片段,酶切后与载体连接成含HBV1.1倍基因组长度的重组载体。经PCR、酶切及测序鉴定后,将重组载体经FuGENEHD转染入Huh7细胞,用ELISA检测转染细胞培养上清液的HBsAg和HBeAg表达,用荧光定量PCR和Southern杂交检测HBV DNA的复制水平及复制中间体。结果经鉴定证实成功构建1.1倍基因组长度C基因型HBV重组载体,体外转染Huh7细胞48h后,培养上清液中检出HBsAg和HBeAg表达;转染72h后,荧光定量PCR检出较高的HBV DNA复制水平(107～109拷贝/ml);Southern杂交检出病毒复制中间体。结论构建的1.1倍长重组载体可以介导高水平的HBV病毒复制和基因表达,为进一步体外瞬时转染HBV表型耐药分析奠定基础。     

乙型肝炎病毒多聚酶区rt229突变的流行特点及其对病毒复制力的影响

目的评价乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶反转录酶(RT)功能域rt229突变对HBV复制力的影响。方法从慢性HBV感染患者血清中提取HBVDNA,使用PCR扩增RT区及前C区基因,采用直接测序法分析耐药相关位点的突变;克隆患者HBV全长基因组,获得S445-3及S869-4克隆并作为定点突变母本,以产生rt229突变的各种模式。使用无载体介导的方法将含有rt229突变的全长HBV基因组转染入HepG2细胞系中,转染3d后采用Real-TimePCR法定量检测HBV复制中间体水平。结果在受检的6000例患者中,394例(6.57%)存在rt229突变,与拉米夫定(LAM)治疗相关的占78.93%,明显高于其他患者[包括接受阿德福韦酯(ADV)治疗、初治和用药不详者]所占的21.07%。其中rtL229V、rtL229W和rtL229M单独突变分别占全部rt229突变的12.44%、1.78%和4.57%,未发现rtL229F单独突变株;rtL229V、rtL229W、rtL229M、rtL229F与LAM耐药突变共存分别占43.65%、9.14%、9.64%和14.97%;rtL229V、rtL229M与ADV耐药突变共存分别占2.54%和1.27%。复制力评价结果显示,相对于前C区G1896A单独突变株(S869-4),rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F突变将HBV复制力降低至2.92%、8.79%、26.04%和34.80%;相对于LAM耐药株(S445-3),伴随有rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F的LAM耐药株的复制力增加了1.18、2.29、2.49和2.51倍。结论 rt229位点的突变可降低HBV的复制力,增强LAM耐药株的复制力;rt229突变可能为LAM耐药突变的补偿突变。     

抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠中的药效学研究

目的研究抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠体内的药效学作用。方法 SPF级TgM(HBV D1.3)小鼠分为Bay41-4109组[30mg/(kg.d)],拉米夫定组[30mg/(kg.d)]和溶媒组(0.5%羧甲基纤维素钠)3组,每组32只。利用免疫组化分析HBV转基因小鼠肝组织HBcAg变化,定量PCR技术研究HBV转基因小鼠肝组织HBV DNA及血清HBV DNA的变化,并从血清转氨酶及体重指标分析该药物体内作用的安全性。结果给药第50天,Bay41-4109组HBcAg阳性细胞核个数、阳性细胞核平均面积、光密度比值三项指标均明显低于溶媒组(P<0.05);用药第64天(停药2周),各组间上述三项指标均无统计学差异。拉米夫定组各时间点上述指标与溶媒组之间均无明显差异(P>0.05)。但Bay41-4109对肝组织及血清HBV DNA未见明显作用。该药未对HBV转基因小鼠血清转氨酶及体重产生明显影响。结论 Bay41-4109可有效抑制HBV转基因小鼠肝组织HBcAg表达,且效果优于拉米夫定。Bay41-4109是一种安全性较好的抗乙肝新药,其作用机制不同于拉米夫定。     

DNA序列测定法与实时荧光PCR法检测YMDD突变结果的比较

目的比较DNA序列测定法与实时荧光法检测YMDD突变的结果,并对除YMDD突变之外的耐药相关基因突变及其意义进行讨论。方法收集89例慢性乙肝患者的92份血清样本,均用实时荧光PCR法做YMDD突变检测。采用巢式PCR法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,采用NTI软件比对结果,并对RT基因上其他11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在37份YMDD突变阴性的样本中,DNA测序法检测结果为33份M204M(未突变)、1份M204I、3份M204V;4份YMDD突变阳性样本均为突变/未突变序列共存;另检出7份样本存在ADV耐药相关突变,占18.9%(7/37)。在55份YMDD突变阳性样本中,DNA测序法检测到52份,阳性结果符合率为94.5%(52/55);另检出5例存在ADV或ETV耐药相关突变,占9.1%(5/55)。结论DNA序列测定法检测HBVRT基因耐药相关突变敏感性高,重复性好,与实时荧光PCR方法的检测结果有较高的符合率,可同时检出YMDD突变以外的各种耐药相关突变,有助于临床全面了解患者对核苷(酸)类似物的耐药情况,合理地制订抗HBV治疗方案。     

一种国产基因芯片用于乙型肝炎病毒P基因突变的检测

目的：验证国产基因芯片检测HBV—P基因突变的准确性和敏感性。方法：选择14例服用拉米夫定48周时HBV—DNA定量检测仍阳性的慢性乙型肝炎病人的血清标本，用HBV基因突变检测基因芯片检测患者血清中HBV—DNA聚合酶基因，观察发生YMDD变异的情况。同时用聚合酶链反应(PCR）技术扩增上述血清标本中编码HBV—DNA聚合酶的P基因片段并直接测序，以对比检查P基因发生YMDD变异的情况。结果：14例患者血清标本用基因芯片均检出HBV—DNA，9例为野生株，5例发生YMDD变异，其中3例为M552I(YIDD)变异，2例为M552V(YVDD)变异，同时均伴有L528M变异。与用PCR扩增产物直接测序的结果完全相同。结论：国产HBV基因突变检测芯片具有特异性强、灵敏性高、快速、简便等优点，可以替代繁琐的DNA序列测定和分析，可作为临床监测HBV—DNA变异的常规方法。     

血清HBV-DNA定量水平与拉米夫定抗HBV感染中YMDD变异的相关性研究

观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎 (CHB)YMDD变异的产生与血清HBV DNA水平的关系。方法　选择应用拉米夫定治疗并产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 ,分析血清HBV DNA水平与YMDD变异类型、产生时间的关系。另选择具有可比性的应用拉米夫定治疗但并未产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 (1:1配对 )对比分析治疗前血清HBV DNA定量水平。结果　YMDD变异组治疗前血清HBV DNA定量水平显著高于未产生YMDD变异组 (P <0 .0 1)。YMDD变异类型与血清HBV DNA定量水平不相关 (P >0 .0 5 ) ,但YMDD变异产生时间与血清HBV DNA定量水平相关 (P <0 .0 5 )。结论　CHB患者血清HBV DNA水平越高 ,应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异 ,且产生时间越早。血清HBV DNA水平可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标。YMDD变异类型与血清HBV DNA水平不相关。     

拉米夫定治疗中国乙型肝炎患者中发现YMDD耐药变异株

为了监测拉米夫定临床治疗过程中耐药性的产生,更好地指导临床用药。采用ＰＣＲ产物克隆后测序的方法,对２０例服用拉米夫定病人进行随访观察,检测其体内乙型肝炎病毒聚合酶基因酷氨酸－蛋氨酸－天门冬氨酸－天门冬氨酸区域变异情况,同时观察其ＨＢＶＤＮＡ定量和肝功能指标变化。     

HBV转基因小鼠血液生理生化指标检测分析

目的研究HBV基因整合对转基因小鼠代谢和血液指标的影响。方法以28只同一窝乙肝表面抗原(HBsAg)阴性小鼠和50只HBsAg阳性的HBV转基因小鼠为研究对象,鼠龄6~8周,眼眶静脉丛采血,检测血液常规指标白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)及淋巴细胞百分比(L%)、中间细胞百分比(M%)、分叶细胞百分比(G%),血液生化指标葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、总蛋白(ALB)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)等,并对有差异的指标进行品种(HBsAg阳性鼠和阴性鼠)内及性别间比较分析。结果转基因小鼠血糖、尿素氮、肌酐、红细胞、血红蛋白、血小板指标与正常小鼠之间有显著差异(P<0.05),而其余指标无明显差异(P>0.05)。上述6项指标在不同性别正常小鼠之间没有差异,而在不同性别转基因小鼠之间仅血糖存在差异,雄鼠血糖高于雌鼠(P<0.05)。转基因雄鼠血糖、肌酐、尿素氮明显高于正常雄鼠,而转基因雌鼠红细胞、血红蛋白、血小板指标明显高于正常雌鼠(P<0.05)。结论 HBVDNA对小鼠的生理生化指标有一定影响。     

Radiation-induced mutations in the spleen and brain of lacZ transgenic mice

PURPOSE: To study the dose-response and molecular nature of radiation-induced mutations in the spleen and brain of lacZ transgenic mice. MATERIALS AND METHODS: Line 60 transgenic mice containing the bacterial lacZ gene in a plasmid background were used. Mutants were selected using phenyl-beta-D-galactoside. The nature of mutants was determined by sequencing DNAs of mutant lacZ genes found in control and irradiated tissues. RESULTS: X-ray irradiation at 50 and 100 Gy showed linear dose-responses for mutation induction in both tissues. The slope, however, was about twice as steep in spleen than in brain. DNA sequence analyses showed that the predominant type of mutation induced by radiation in both tissues were large deletions. CONCLUSIONS: Radiation induces mutations in spleen and brain at different efficiencies but the molecular nature of the induced mutations are similar in the two issues.     

乙型肝炎患者血清HBV前C区A1896变异的检测分析

目的了解HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝病人血清乙肝病毒(HBV)DNA前C区A1896的变异情况及其与临床关系。方法对所有试验对象检测肝功能指标,根据检测结果分为丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高组和ALT正常组。用聚合酶链反应杂交(PCR-ELISA)定量检测HBV-DNA并进一步检测HBV前C区A1896位点的变异情况。结果 38例患者中有18例HBV-DNA阳性,其中15例发生A1896位点变异,变异率为83.3%(15/18)。ALT升高组的18例中,血清HBV-DNA阳性13例,阳性率72.2%,平均浓度为9.62×106(1.10×103～1.09×108)拷贝/ml,A1896变异13例,变异率为100%(13/13)。ALT正常组的20例中,HBV-DNA阳性5例,阳性率25.00%,平均浓度2.55×104(3.28×103～4.61×104)拷贝/ml。A1896变异2例,变异率为40%(2/5)。两组比较无论在HBV-DNA阳性率,还是A1896位变异率都具有统计学差异(P<0.05)。结论 HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝患者存在较高的A1896变异率,ALT升高组HBV-DNA阳性率和变异率均高于ALT正常组(P<0.05),提示HBV A1896位点变异与肝脏病变活动加重和ALT升高有关。     

重型肝炎病人的乙肝病毒前C基因变异研究

对１１例重型肝炎病人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ直接序列进行分析以阐述变异特点。一次或套式ＰＣＲ扩增到的ＨＢＶＤＮＡ，以不对称ＰＣＲ法制备成单链模板后直接作序列分析。结果１１个病例中，９例有１～２个氨基酸替代变异：Ｇ１８９６→Ａ的替代，产生一个终止密码，见于１例抗－ＨＢｅ阳性的病人，第１７位（ＡＡ１７）缬氨酸被苯丙氨酸替代，见于１例ＨＢｅＡｇ阴性的病人，ＡＡ１５和ＡＡ２９的丝氨酸替代变异见于２例ＨＢｅＡｇ阴性、ＨＢＶ含量甚低的病例，１８５８Ｃ→Ｔ替代见于４例病人，与ＨＢｅＡｇ表型无关，无一伴有终２８变异，呈相互排斥现象。说明重型肝炎病人的ＨＢＶ前Ｃ基因存在多种变异类型。这些变异点只见于１～２例病人，似乎不是引发重型肝炎的重要原因，Ｇ１８９６→Ａ替代变异和ＡＡ１７的苯丙氨酸替代与ＨＢｅＡｇ阴性表型相关     

慢性乙型肝炎血清学标志、HBV DNA定量分析及HBV前C/C变异的临床研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者血清学标志、HBVDNA载量及HBV前C/C变异与临床病变的关系。方法 :随机选取慢性乙型肝炎患者 2 4 6例 ,其中轻度 10 2例、中度 88例、重度 5 6例 ,分别应用ELISA、实时PCR法检测其血清中的HBV免疫学标志及HBVDNA含量。同时对HBeAg阴性而HBVDNA含量高拷贝的 3例轻度、6例中度及 8例重度患者血清 ,应用巢式PCR方法分离前C/C区全长基因 ,纯化后克隆入T载体 ,鉴定后进行序列测定。结果 :10 2例轻度、88例中度及 5 6例重度患者中血清学标志HBsAg ,HBeAg,抗 -HBc阳性模式分别为 5 3例 (5 1.9% )、4 6例(5 2 .3% )、33例 (5 8.9% ) ;HBsAg ,抗 -HBe,抗 -HBc阳性模式分别为 37例 (36 .3% )、32例 (37.5 % )、2 1例 (37.5 % ) ;单独HBsAg阳性为 8例 (7.8% )、5例 (5 .6 % )、1例 (1.7% ) ;其他模式分别为 4例、5例、1例。HBVDNA含量平均值分别为 10E 5 .5 3拷贝 /ml、10E 6 .0 3拷贝 /ml、10E 6 .5 8拷贝 /ml。HBeAg阴性而HBVDNA含量 >10E 6拷贝 /ml的病例数分别为 3例、6例、8例。统计分析表明 ,轻、中、重慢性乙肝患者间血清学标志及HBVDNA含量差异均不具统计学意义 ,而HBeAg阴性HBVDNA含量高拷贝的患者出现频率差异具有统计学意义。序列测定结果显示 17例患者血清的HBV分离株的前C/C