乙型肝炎病毒前-X蛋白在大肠埃希菌中的表达及多克隆抗体的制备

目的在大肠埃希菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白,纯化、鉴定并制备多克隆抗体。方法通过PCR技术获得HBV前-X编码基因片段,克隆至载体pET32a( ),构建原核表达重组质粒,转化至大肠埃希菌中诱导表达,表达产物进行Ni 亲和层析纯化,经Western blotting证实该蛋白的免疫原性,然后免疫新西兰兔获得多克隆抗体并经ELISA实验测定效价,经Western blotting证实其免疫反应特异性。结果成功构建原核表达载体并在大肠埃希菌中高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,融合蛋白的相对分子量约为25kD,Western blotting结果表明目的蛋白具有特异性的免疫反应识别。成功获得前-X蛋白的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为>1:128000,Western blotting实验证实获得的抗体能发生特异性免疫反应。结论成功完成了HBV前-X蛋白的体外表达及多克隆抗体制备,为检测前-X蛋白在乙型肝炎患者体内的表达及进一步研究其生物学特性奠定了实验基础。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.     

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a( )中构建原核表达载体pET-32a( )-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni 亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a( )-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。     

小鼠附睾分泌蛋白Spink12的原核表达与纯化

目的原核表达带有His标签的小鼠附睾蛋白Spink12,对表达产物进行鉴定和纯化,以研究Spink12的免疫避孕效果。方法提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR扩增不含信号肽的Spink12蛋白编码序列,以NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后,将其连入原核表达载体pET28(a);经酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28(a)-Spink12,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞。融合蛋白经IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blotting免疫印迹鉴定。用Ni-NTA在非变性条件下利用不同的咪唑梯度浓度纯化融合蛋白6×His-Spink12。结果酶切和测序结果显示成功构建出原核表达载体pET28(a)-Spink12。重组质粒转化大肠埃希菌BL21并经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示表达出约9kD的融合蛋白6×His-Spink12,与理论分子量相符。融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的23.5%。用抗His单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹鉴定,检测到同样大小的条带。经纯化获得较高纯度的融合蛋白6×His-Spink12,纯度达91.1%。结论成功表达并纯化了融合蛋白6×...     

人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定.方法 通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM-T Easy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA.将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose 4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank 中的PSCA序列一致.pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD.结论 成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础.     

小鼠固醇载体蛋白2原核表达载体的构建与表达纯化

目的 构建小鼠固醇载体蛋白2(SCP-2)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化获得具有活性的融合蛋白,为进一步研究SCP-2的生物学功能提供基础.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到鼠SCP-2编码序列,然后将该编码序列克隆到带有His标记的载体pET14b上,重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性,然后切取分子量正确的条带用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确.融合蛋白表达纯化后获得了分子量约59kD的融合蛋白,符合预期大小,并经质谱分析证明该融合蛋白的表达正确.结论 成功构建了带His标签的SCP-2原核表达载体,并成功表达及纯化出该融合蛋白,为深入研究SCP-2的相关生物学功能提供了一个重要的工具.     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的 构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能.方法 应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测.结果 利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别.生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽.结论 利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

人PD-L1胞外区基因的克隆、原核表达及抗体制备

目的 克隆人PD-L1胞外区基因并进行原核表达及相应蛋白的抗体制备,为进一步研究PD-1/PD-L1通路及针对该通路进行疾病治疗和药物筛选奠定基础.方法 用PCR方法扩增编码人PD-L1胞外区的基因序列,克隆到原核表达载体pET28a(+)中并进行表达,用His抗体为一抗进行Western blotting鉴定并验证结合活性.用纯化的hPD-L1胞外区蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式法检测抗体滴度及其特异性.结果 原核表达质粒pET28a(+)-hPD-L1成功构建,并可在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导高效表达,得到的hPD-L1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确.用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度可达105.结论 鉴定和纯化了原核表达的hPD-L1蛋白,制备的相应多克隆抗体能够检测真核细胞表达的hPD-L1蛋白,为进一步研究PD-1/PD-L1生物学活性奠定了实验基础.     

人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10在大肠埃希菌中的诱导表达与鉴定

目的 构建稳定表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C/UbcH10)蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导其表达,纯化并鉴定该重组蛋白. 方法 通过PCR扩增获得UbcH10基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体,经EcpRI/Xho 1双酶切及测序验证止确后,转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG(终浓度Immnol/L)诱导表达4h.采用SD6-PAGE、Westernblotting等方法鉴定表达产物,用Ni-Sepharose亲和层析和Sephadex G-50分子筛纯化UbcH10蛋自. 结果 成功构建UbcH10基因的原核表达载体,经IPTG诱导后在大肠埃希菌B121中获得大量重组蛋白.该重组蛋白以町溶形式表达,表观分子量约为29kD,表达量约占黹体蛋白总量的40%.Westem blotting检测在29kD附近出现预期条带,与目的 蛋白的理论计算值相吻合.纯化后的UbcH10蛋白终浓度为8.82mg/ml,纯度达90%以上. 结论 成功表达并纯化了 UbcH10重组蛋白,为进一步研究其结构、功能以及该蛋白在肿瘤发生发展过程中的作用奠定了基础.     

二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达

目的：构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素(hEnS)融合基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法：利用RCR的方法扩增hEDN基因，克隆人含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS后，以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PACE及Westen-blot分析及鉴定。结果：成功构建了抗肝癌HdsFv-hEDN融合基因原核表达载体；SDS-PACE和wbsten—blot分析显示，诱导表达产物出现一条Mr约为45．0KD的新生蛋白带，表达量占菌体总蛋白量的x％，主要以包涵体形式存在。结论：抗肝癌hdsFv—hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达，为其进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

牛结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的原核表达和纯化

构建牛结核分枝杆菌ESAT-6基因的原核表达载体,诱导表达、纯化并初步鉴定该蛋白。方法:以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-22b(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)polys菌体,经IPTG诱导表达蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果:所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现在6kDa处有特异性蛋白条带。纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论:成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

东部马脑炎病毒E2基因的克隆与表达

目的 :克隆表达东部马脑炎病毒 (easternequineencephalomyelitisvirus ,EEEV)E2基因 ,研究重组蛋白的抗原性 ,为研制东部马脑炎病毒基因工程诊断试剂奠定基础。方法 :由病毒感染的鼠脑制备总RNA ,利用RT_PCR技术扩增EEEVE2基因全长序列 ,并将其克隆至pGEM_Teasy载体测序 ,再将E2基因克隆至谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体pGEX_5x_2中表达。采用免疫印迹试验 (Westernblotting)和ELISA法分析表达的重组蛋白的抗原性。结果 :经过RT_PCR扩增和测序 ,证明得到的E2基因片段的序列是正确的 ,并且在原核载体中得到表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白的 2 4 .5 % ,主要以包涵体形式存在。Western印迹分析表明GST_E2蛋白有良好的抗原性 ;包涵体经Tri tonX_10 0 ,1mol L和 2mol L尿素洗涤 ,初步纯化后 ,用表达的E2融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA法 ,结果表明与兔抗EEEV血清起特异反应 ,但与兔抗WEEV血清无交叉反应。结论 :东方马脑炎病毒的E2基因在大肠杆菌中得到稳定表达 ,表达的GST_E2蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,为从分子水平上对EEEVE2蛋白的功能性研究和发展EEEV基因工程诊断试剂奠定了基础     

原核表达基质金属蛋白酶-2的催化域

 目的 体外表达人基质金属蛋白酶－2(MMP－2)的催化域,为进一步研究其在肿瘤侵袭和转移中的作用打下基础。方法 通过PCR方法获得了编码MMP－2催化域(MMP－2－C)的cDNA序列,并构建了重组质粒pGEX－5X－3／MMP－2－C,由IPTG诱导在大肠杆菌中表达,表达产物被复性后鉴定酶活性。结果表达产物为68－Kda的融合蛋白且具有明胶酶活性。结论 体外表达的具有催化活性的融合蛋白可用于研究抗肿瘤转移药物。     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的 克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平.方法 应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Western blot证实表达蛋白的特异性.应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析.结果 RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Western blot证实了表达的重组蛋白的特异性.HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达.结论 成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平.     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的重组表达及纯化

目的：构建L32-pQE32重组质粒，诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32，对重组蛋白进行纯化。方法：采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段，构建重组克隆载体pGEM-T／L32和表达载体L32-pQE32，转化受体茵E.coli DH5α和E．coli M15，IPTG诱导表达重组LipL32蛋白。Ni-NTA亲和层析纯化重组LipL32蛋白。结果：扩增出约750bp的LipL32成熟蛋白基因，LipL32基因插入pQE32表达载体，表达产物6个组氨酸与LipL32蛋白的融合蛋白相对分子质量约为31000，与预期大小一致。Western印迹显示能与钩体抗血清特异结合。结论：LipL32蛋白能在大肠杆菌中表达，Ni-NTA亲和层析可有效纯化重组LipL32蛋白，重组LipL32蛋白具有结合活性。