复制型HBV转基因小鼠的建立与应用

尽管有了有效的疫苗,但乙肝病毒(HBV)感染依然是全球性公共卫生问题,在我国形势尤为严峻。由于HBV的自然宿主仅限于人和黑猩猩,现有的模型都有不同的缺陷,因此关于其生物学及治疗方法研究的诸多问题依然没有解决。复制型HBV转基因小鼠模型的建立,极大地提高了我们对HBV生活史、免疫生物学和肝脏病变的免疫发病机制的认识。本文简要介绍国际上由Francis V.Chisari实验室和国内由本实验室建立的复制型HBV转基因小鼠,以及利用该模型开展抗病毒药物和乙肝发病机制的研究工作。     

HBV转基因小鼠血液生理生化指标检测分析

目的研究HBV基因整合对转基因小鼠代谢和血液指标的影响。方法以28只同一窝乙肝表面抗原(HBsAg)阴性小鼠和50只HBsAg阳性的HBV转基因小鼠为研究对象,鼠龄6~8周,眼眶静脉丛采血,检测血液常规指标白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)及淋巴细胞百分比(L%)、中间细胞百分比(M%)、分叶细胞百分比(G%),血液生化指标葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、总蛋白(ALB)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)等,并对有差异的指标进行品种(HBsAg阳性鼠和阴性鼠)内及性别间比较分析。结果转基因小鼠血糖、尿素氮、肌酐、红细胞、血红蛋白、血小板指标与正常小鼠之间有显著差异(P<0.05),而其余指标无明显差异(P>0.05)。上述6项指标在不同性别正常小鼠之间没有差异,而在不同性别转基因小鼠之间仅血糖存在差异,雄鼠血糖高于雌鼠(P<0.05)。转基因雄鼠血糖、肌酐、尿素氮明显高于正常雄鼠,而转基因雌鼠红细胞、血红蛋白、血小板指标明显高于正常雌鼠(P<0.05)。结论 HBVDNA对小鼠的生理生化指标有一定影响。     

YMDD突变株HBV转基因小鼠的制备及检测

目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR检测外源基因的整合和传代情况,采用ELISA和免疫组化等方法检测HBsAg在肝、肾中的复制和表达情况。结果注射受精卵3401枚,产269只F0代仔鼠,PCR阳性33只,外源基因的整合率12.3%。9只转基因鼠血清HBVDNA弱阳性,拷贝数低于103拷贝/ml;免疫组化结果显示肝组织和肾组织均有HBsAg表达,且肾组织中的表达强于肝组织。经传代产下47只F1代转基因鼠,目的基因PCR阳性率为27.6%,且肝组织和肾组织中HBsAg均有表达,分布特性与F0代一致。结论成功制备出体内有复制表达而且可以传代YMDD耐药突变株HBV的转基因小鼠。     

1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测

目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。     

抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠中的药效学研究

目的研究抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠体内的药效学作用。方法 SPF级TgM(HBV D1.3)小鼠分为Bay41-4109组[30mg/(kg.d)],拉米夫定组[30mg/(kg.d)]和溶媒组(0.5%羧甲基纤维素钠)3组,每组32只。利用免疫组化分析HBV转基因小鼠肝组织HBcAg变化,定量PCR技术研究HBV转基因小鼠肝组织HBV DNA及血清HBV DNA的变化,并从血清转氨酶及体重指标分析该药物体内作用的安全性。结果给药第50天,Bay41-4109组HBcAg阳性细胞核个数、阳性细胞核平均面积、光密度比值三项指标均明显低于溶媒组(P<0.05);用药第64天(停药2周),各组间上述三项指标均无统计学差异。拉米夫定组各时间点上述指标与溶媒组之间均无明显差异(P>0.05)。但Bay41-4109对肝组织及血清HBV DNA未见明显作用。该药未对HBV转基因小鼠血清转氨酶及体重产生明显影响。结论 Bay41-4109可有效抑制HBV转基因小鼠肝组织HBcAg表达,且效果优于拉米夫定。Bay41-4109是一种安全性较好的抗乙肝新药,其作用机制不同于拉米夫定。     

中国流行株C基因型HBV稳定复制表达小鼠模型的建立

目的 构建稳定复制中国流行株C基因型HBV的小鼠模型.方法 将携带1.3倍C基因型HBV基因组(adr血清型)的重组腺相关病毒rAAV8-1.3HBV-C转导人肝癌细胞HuH7,采用ELISA法评估HBV抗原(HBsAg、HBeAg)在肝癌细胞中的表达.筛选高表达的重组病毒,经尾静脉注射入6～8周龄C57BL/6小鼠体内,建立HBV-C复制小鼠模型(实验组,n=8);同时建立文献已报道HBV-D复制小鼠模型(对照组,n=7,rAAV8-1.3HBV-D,ayw血清型).动态监测两组小鼠血清(眼底静脉丛采血)HBV DNA载量和HBsAg、HBeAg的抗原表达量;于第9周处死小鼠,HE染色观察肝组织病理改变,免疫组化染色分析HBsAg和HBcAg的表达.结果 重组病毒rAAV8-1.3HBV-C体外转导人肝癌细胞HuH7,72h后细胞上清中可检测到HBsAg和HBeAg的表达.小鼠注射重组病毒后第2、3、5、7、9周,血清HBV DNA存在稳定复制,血清HBeAg表达水平较稳定,但血清HBsAg表达存在波动.两组小鼠肝组织未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常,但可检测到HBsAg和HBcAg蛋白.结论 利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3倍C基因型HBV基因组体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了稳定复制并持续表达C基因型HBV的小鼠模型.     

Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

在2.2.15细胞中siRNA对HBV复制和表达的抑制

目的：检测设计的siRNA对HBV复制和表达的影响。方法：选择针对乙型肝炎病毒（HBV）的siRNA基因序列，化学修饰合成3种stealth siRNA，脂质体转染带有HBV的2．2．15细胞，EMSA法及荧光定量PCR检测其对HBV复制和表达的影响。结果：3种stealth siRNA对HBV的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用。结论：HBV在2．2．15细胞中的复制和表达被stealth siRNA抑制。     

慢性乙肝患者石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

目的建立慢性乙肝患者微量石蜡包埋肝组织共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)定量检测方法。方法以37例慢性乙肝患者甲醛固定石蜡包埋肝组织为研究对象,提取肝组织HBV DNA,经不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化后,利用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR扩增技术检测肝组织中HBV cccDNA含量,以β-actin为内参照。通过已知浓度的模板DNA进行梯度稀释鉴定该方法的灵敏度,并对该方法进行批内和批间重复性检测。应用该方法分析37例慢性乙肝患者肝组织HBV cccDNA与血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA的关系,以及肝组织HBV cccDNA和HBV DNA与血清HBeAg表达之间的关系。结果成功建立了微量石蜡包埋肝组织HBV cccDNA的定量检测方法,该方法具有较好的特异性、灵敏度和稳定性。HBeAg阳性者肝组织中cccDNA含量明显高于HBeAg阴性者,HBV cccDNA水平与血清总HBV DNA水平(R2=0.48,P=0.042)及肝组织总HBV DNA水平(R2=0.63,P=0.001)呈正相关。结论该方法可特异灵敏地定量检测微量石蜡包埋组织切片中的HBV cccDNA。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1相互作用蛋白的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节蛋白(HBVDNAPTP1)相互作用的蛋白.方法 将HBVDNAPTP1基因片段插入酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达,与含有白细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,利用营养缺陷型培养基筛选阳性克隆.提取单个阳性文库质粒进行酶切鉴定,测序后回复验证其在酵母中的相互作用.利用免疫共沉淀方法进一步验证HBVDNAPTP1与成对免疫球蛋白受体α(PILRα)在体外的相互作用.结果 经RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,成功构建HBVDNAPTP1基因的酵母细胞"诱饵"表达质粒,获得了与HBVDNAPTP1具有相互作用的已知功能蛋白4种,分别为PILRα、酶原颗粒蛋白16、羧酸脂酶1、β转导素样蛋白2.免疫共沉淀结果表明HBVDNAPTP1与PILRα在体外存在相互作用.结论 获得了4种可与HBVDNAPTP1相互作用的候选蛋白,HBVDNAPTP1可能参与了肝细胞的增殖分化、信息传递和生长代谢.     

表达SARS冠状病毒受体人ACE2转基因小鼠的建立

目的:建立表达SARS冠状病毒的功能性受体人ACE2的转基因小鼠.方法:克隆人2型血管紧张素转换酶(hACE2)的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,以显微注射的方法将5.6 kb的转基因片段引入小鼠的受精卵.采用PCR、Southern印迹、RT-PCR、Western印迹、免疫荧光染色的方法对转基因小鼠进行鉴定.结果与结论:获得了在小鼠肺组织中表达有SARS病毒功能性受体hACE2的两个转基因小鼠系,证明了SARS病毒的S蛋白能很好地和转基因小鼠肺组织中表达的hACE2受体结合,这将为SARS的研究提供一种良好的感染动物模型.     

心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。方法：构建了心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因载体。该载体通过显微注射被导入小鼠受精卵中，通过胚胎移植，获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Cre重组酶整合情况。通过Northern杂交检测Cre重组酶表达的组织特异性。结果：构建了含有心肌细胞特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体α-MHC—Cre—hGH。将转基因载体进行显微注射，共注射了215枚小鼠受精卵，其中202枚移植入13只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠42只。PCR检测发现有1只小鼠在其基因组上整合有Cre重组酶基因。Northem杂交检测结果显示该转基因小鼠只在心脏组织中特异性地表达Cre重组酶基因。结论：成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，为利用条件基因打靶技术研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

乙型肝炎患者不同血清标志物HBV DNA的表达及意义

 目的探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式的相关性.方法血清HBV DNA定量检测采用PCR ELISA法,HBVM采用ELISA法.结果在HBVM阳性的366例血清中,有199例HBV DNA阳性,占54.4%.血清HB-/ml占65.2%;HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性者HBV DNA-HBc阳性者HBV DNA阳性率占95.2%,≥106 copiessAg、HBeAg、抗阳性率占29.1%,≥106 copies/ml占17.6%.结论血清HBVM阳性患者中约55.0%的血清HBV DNA阳性,且HBeAg阳性患者中HBV DNA含量及阳性率均明显高于抗-HBe阳性者;在抗-HBs、抗-HBc阳性或HBsAg阴性者血清内也有HBV DNA阳性者.     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因

目的构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因。方法通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列。结论筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础。