恶性疟原虫裂殖子表面抗原MSA1第二区基因在大肠杆菌中的表达

目的 :在大肠杆菌中高效表达恶性疟原虫裂殖子表面抗原 MSA1- R2 ,进一步研究其生物学功能。方法 :将 MSA1- R2基因重组于 p WR4 50 I半乳糖苷酶融合蛋白表达载体中 ,转化大肠杆菌 ,酶切鉴定重组克隆。用 IPTG诱导 MSA1- R2融合蛋白的表达 ,对表达产物进行 SDS- PAGE、β-半乳糖苷酶活性、dot- ELISA和 Western- blot鉴定。结果 :表达产物占菌体总蛋白的 35%— 4 0 % ,相对分子量为 70 k Da,与半乳糖苷酶 - MSA1R2融合蛋白的理论分子量相符。IPTG诱导 4 h后 ,β-半乳糖苷酶活性可增高 10倍— 14倍 ,用 dot- EL ISA和 Western- blot均证实表达产物具有恶性疟原虫抗原表位。结论 :p WR4 50 -大肠杆菌表达系统可以高效表达具有免疫学活性的疟原虫蛋白。     

恶性疟原虫裂殖子表面抗原MSA1第二区基因在大肠杆菌中的表达

目的 :在大肠杆菌中高效表达恶性疟原虫裂殖子表面抗原 MSA1- R2 ,进一步研究其生物学功能。方法 :将 MSA1- R2基因重组于 p WR4 50 I半乳糖苷酶融合蛋白表达载体中 ,转化大肠杆菌 ,酶切鉴定重组克隆。用 IPTG诱导 MSA1- R2融合蛋白的表达 ,对表达产物进行 SDS- PAGE、β-半乳糖苷酶活性、dot- ELISA和Western- blot鉴定。结果 :表达产物占菌体总蛋白的 35%— 4 0 % ,相对分子量为 70 k Da,与半乳糖苷酶 - MSA1R2融合蛋白的理论分子量相符。IPTG诱导 4 h后 ,β-半乳糖苷酶活性可增高 10倍— 14倍 ,用 dot- ELISA和 Western- blot均证实表达产物具有恶性疟原虫抗原表位。结论 :p WR4 50 -大肠杆菌表达系统可以高效表达具有免疫学活性的疟原虫蛋白。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫FCC1/HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达

目的　克隆恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)株糖酵解醛缩酶 (ALD)编码区基因。　方法　利用已知ALD基因序列设计一对特异性引物,从基因组DNA中用PCR扩增ALD基因,将其克隆入pQE30载体,阳性克隆经酶切鉴定后测序,在此基础上将重组质粒转化大肠埃希菌M15进行表达。　结果　PCR扩增后获得特异性扩增片段,测序结果显示我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与恶性疟原虫3D7株ALD基因序列完全相同。重组融合蛋白通过镍 次氮基三乙酸(NiNTA)亲和层析及阳离子交换层析进行纯化。　结论　我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与文献报道的恶性疟原虫3D7株ALD编码区基因序列相同,该融合蛋白在大肠埃希菌中获得表达     

恶性疟原虫海南株CSP3’末端基因的克隆及序列分析

目的构建恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)CSP3’末端基因的原核表达载体，并对CSP3’末端基因进行序列测定。方法根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物，采用PCR技术扩增出CSP3’末端基因，将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌JM109；阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定，用双脱氧链末端终止法进行序列测定。结果从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3’末端基因，其片段大小为225bp，构建的阳性重组质粒pGEX-4T-1／CSP3’末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致，测序结果进一步确认了插入片段的正确性。结论成功地构建了CSP3’末端的原核重组质粒，为进一步研究其功能奠定了基础。     

化学合成恶性疟原虫杂合45肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

为了使化学合成的人恶性疟原虫杂合45肽抗原基因(HPFAG)在大肠杆菌中表达,我们将HPFAG与表达载体pWR450.1质粒重组连接,转化大肠杆菌,获得一批转化子。这些转化子经质粒DNA斑点杂交试验,蛋白质SDS—PAGE和DNA酶解分析,表明化学合成的HPFAG与表达载体质粒发生了重组,且有6个重组子在大肠杆菌中与p—半乳糖苷酶呈融合蛋白形式表达。     

恶性疟原虫传播阻断抗原的化学拼接与克隆

采用缺口填补法将恶性疟原虫有性期Pfs230和Pfs48／45抗原中的2个T细胞表位，3个B细胞表位以及人白介素-Ⅰ中的一个T细胞激活位点按预设方案，拼接成复合多价基因PfSI。复合基因全长147bP，编码43肽复合抗原，经分离、纯化后，插入质粒pcDNA3的多克隆位点，构建重组载体pcDNA3／PfSI。再将重组载体转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素和PCR扩增法筛选阳性克隆，最后用限制性内切酶对阳性克隆进行鉴定。复合基因PfSI拼接、克隆的成功为在体外高效表达恶性疟原虫传播阻断抗原创造了条件。     

间日疟原虫MSP1C端基因亚克隆及在肠埃希菌中的融合表达

目的　在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因 ,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST PvMSP1C。　方法　以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得间日疟原虫MSP1C端编码基因片段 ,柱纯化后 ,插入表达质粒载体的多克隆位点 ,构建重组体 pGEX 4T 2 /PvMSP1C ,并转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后 ,以IPTG进行诱导表达 ,表达产物以SDS PAGE电泳与免疫印迹分析。　结果　双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得 1119bp的PvMSP1C编码基因片段 ,与预期片段大小相符 ;所构建的 pGEX 4T 2 /PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致 ;SDS PAGE电泳显示 ,GST PvMSP1C融合表达蛋白的大小约 63ku ,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别。　结论　成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1C端编码基因 pGEX 4T 2 /PvMSP1C表达质粒 ,诱导表达了GST PvMSP1C融合蛋白 ,表达蛋白具有一定免疫活性。     

间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在大肠埃希菌中的融合表达

目的 在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1 C端编码基因，以获得能作为检测抗原的重组蛋白GSTPvMSP1 C。方法 以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切质粒pMD／PvMSP1C，获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段．柱纯化后，插入表达质粒载体的多克隆位点，构建重组体pGEX-4T-2／PvMSP1C，并转化大肠埃希菌BL21(DE3)，阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析。结果 双酶切质粒pMD／PvMSP1C，获得1 119bp的PvMSP1 C编码基因片段，与预期片段大小相符；所构建的pGEX-4T-2／PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致；SDS-PAGE电泳显示，GST-PvMSP1C融合表达蛋白的大小约63 ku，且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别。结论 成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2／PvMsP1C表达质粒，诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白，表达蛋白具有一定免疫活性。     

恶性疟原虫海南株子孢子期SSU rRNA编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株子孢子期小亚基核糖体核糖核酸(SSU rRNA)编码基因片段,分析其序列特征.方法 根据恶性疟原虫基因库相关核酸序列设计1对引物,采用PCR方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSU rRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接,构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆经双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAST软件分析其特征.结果 恶性疟原虫子孢子期SSU rRNA基因扩增片段大小约为347bp;阳性克隆重组质粒双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSU rRNA基因扩增片段含有347个核苷酸,与GenBank中的恶性疟原虫3D7株相同序列进行比对,其同源性为100%,而与7G8株的同源性则为98.0%,其中第153位碱基发生了缺失,第184位碱基由C取代了T,而第188位T碱基与第189位A碱基为插入碱基,第243位碱基则由T取代了C.结论 成功克隆恶性疟原虫海南株孢子期SSU rRNA编码基因序列,该序列相对保守,不同地理株间存在单核苷酸多态性.     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

恶性疟原虫疫苗研究Ⅹ.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因在大肠杆菌中的表达及其产物的初步鉴定

目的克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原,为疟疾疫苗研究奠定基础。方法将恶性疟原虫MSP1中类表皮生长因子1（EGF—1）基因与人工化学合成的抗原复合基因PfCMR串接,插入高效非融合型蛋白表达载体PBV220,转化大肠杆菌DH5a．转化菌经42℃热诱导表达,表达产物用Westernblot和Dot—ELISA分析。结果构建成功重组质粒PBV220／PfCMR—EGF─1,经热诱导后表达出合外源基因产物的非融合蛋白质,分子量为16．5kDa,表达产物与恶性疟原虫抗原免疫鼠血清产生特异免疫反应。工程菌连续传代,未见重组质粒丢失,表达效率无明显改变。结论用表达载体pBV220表达出的恶性疟原虫重组复合抗原具有一定的免疫活性。该重组质粒可在宿主菌DH5a内长期稳定存在。     

恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的　构建恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)CSP3′末端基因的原核表达载体 ,并对CSP3′末端基因进行序列测定。方法　根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物 ,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因 ,将其克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,转化大肠杆菌JM10 9;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因 ,其片段大小为 2 2 5bp ,构建的阳性重组质粒pGEX 4T 1 CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致 ,测序结果进一步确认了插入片段的正确性。　结论　成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒 ,为进一步研究其功能奠定了基础。     

T载体的构建及在恶性疟原虫RAP2基因克隆中的应用研究

目的　构建PCR产物高效克隆载体T载体 ,并应用于克隆恶性疟原虫RAP2基因。方法　PUC18用SmaI酶切纯化后 ,与dTTP在 70℃孵育 3h ,构建T载体。另设计一对特异引物 ,采用PCR方法从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中特异扩增RAP2基因 ,并将其克隆入T载体 ,重组克隆经蓝白斑初筛后 ,再用双酶切及PCR法进行鉴定。结果　从恶性疟原虫基因组DNA中特异扩增出大小为 12 15bp基因片段 ,与预期长度相符。克隆入T载体后的重组克隆经双酶切及PCR鉴定均正确无误。结论　成功构建T载体 ,并获得阳性重组克隆T -RAP2 ,为进行该RAP2基因的序列测定及研究该基因的结构与功能奠定基础     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

恶性疟原虫cDNA克隆(CO111)的序列测定和分析

目的: 测定和分析cDNA 克隆(CO111)与抗恶性疟原虫兔血清和1株单克隆抗体呈阳性反应的序列。方法:采用PCR扩增CO111 克隆的cDNA 片段,纯化后经Klenow 酶补平,与M13m p18 载体连接,转化到大肠杆菌(E.coli) JM109。PCR筛选和鉴定M13单链,PEABI373ADNA自动测序仪测序,PC/GENE和GenBank (EM-BL)等软件进行序列分析和比较。结果:CO111 cDNA克隆含有233对核苷酸对。与GenBank 数据库中恶性疟原虫DNA比较,未发现与该cDNA相同的序列。结论:分离出1 个新的与抗恶性疟原虫抗体呈阳性反应的抗原cDNA克隆     

恶性疟原虫复合抗原重组真核表达质粒的构建与表达

目的　构建编码恶性疟原虫不同发育期抗原表位的复合抗原基因HGFSP的重组真核表达质粒。　方法　将HGFSP亚克隆于真核表达载体pcDNA3构建重组真核表达质粒 pc HGFSP ;琼脂糖凝胶电泳和限制性内切酶分析鉴定 ;脂质体介导转染HepG2细胞。取经G418筛选的阳性细胞克隆进行免疫学鉴定。 　结果　酶切及电泳鉴定证实pc HGFSP含有HGFSP。间接免疫荧光试验 (IFAT)、SDS PAGE及Westernblotting结果显示 ,pc HGFSP转染细胞含有可与HGFSP原核表达蛋白免疫血清产生特异性免疫反应的蛋白 (包含恶性疟原虫MSA1、MSA2、RESA和CSP中的抗原表位 ) ,其分子量与按HGFSP长度推算的蛋白分子量接近。　结论　用HGFSP成功构建恶性疟原虫复合抗原真核表达质粒 pc HGFSP ,其表达产物具免疫反应性。     

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白2真核表达重组质粒的构建

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（FCC1／HN）裂殖子表面蛋白2（MSP2）融合HBsAg基因片断真核表达质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS及重组真核表达质粒pVXORF1-PfMSP2，为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。方法 （1）采用PCR技术对恶性疟原虫FCC1／HN株MSP2原核表达质粒PET28α-MSP2的MSP2基因进行扩增，扩增产物经纯化后用Bam H I酶切；质粒pVXORF1-PvMSP1.19-HBS用相同的酶酶切，经纯化后用T4DNA连接酶将其与酶切后纯化的MSP2基因连接；（2）分别用BamHI Xho双酶切PET28α-MSP2质粒DNA和pVXORF1质粒DNA，纯化后2将目的基因片段用T4DNA连接酶连接；将（1），（2）连接产物分别转化大肠杆菌DH5α。于氨苄青霉素阳性LB培养平板上筛选阳性克隆，酶切电泳鉴定。结果 筛选出的重组子为编码FCC1／HN MSP2基因片段的重组质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS及pVXORF1-PfMSP2。结论 编码FCC1／HN MSP2基因片断真核表达质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS和pVXORF1-PfMSP2的构建为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8％,但与人的4型HK的同源性只有23.2％~26.6％。 结论 获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。