大鼠增龄过程中髓核组织Beclin-1和微管相关蛋白轻链3的表达及其意义

目的 探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中Beclin-1和微管相关蛋白轻链3(MAPLC3)的表达及其意义.方法 3个月龄、12个月龄、24个月龄SD大鼠各8只,建立青年组、中年组和老龄组大鼠模型,苏木素-伊红(HE)染色检测椎间盘组织的退变;透射电镜检测髓核细胞中自噬体的表达;免疫组织化学染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定髓核组织中Beclin-1和MAPLC3的表达.结果 大鼠增龄过程可较好地体现椎间盘的退变变化;不同年龄组大鼠髓核细胞中均有自噬体的表达;Beclin-1和MAPLC3在不同年龄组SD大鼠髓核细胞中均有表达(0.42±0.05,0.47±0.06,0.52±0.05;0.34±0.06,0.39±0.05,0.46±0.09),且老龄组表达均较青年组高(P<0.01).Beclin-1和MAPLC3 mRNA在不同年龄组SD大鼠髓核组织中均有表达(0.86±0.12,0.93±0.14,1.01±0.13;1.09±0.06,1.15±0.07,1.33±0.11),且老龄组表达较青年组表达明显增高(分别为P<0.05和P<0.01).结论 自噬存在于椎间盘退变过程中,且MAPLC3与Beclin-1在椎间盘退变过程中的表达增加,提示自噬活性的增加可能与椎间盘退变的发展进程有关.     

大鼠增龄过程中髓核组织HSC70的表达及其意义

目的探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中HSC70的表达及其意义。方法 3月龄、12月龄、24月龄SD大鼠各8只,HE染色检测椎间盘组织的退变情况;RT-PCR法测定髓核组织中HSC70的表达;Western blot检测髓核组织中HSC70的表达。结果大鼠增龄过程可部分反映椎间盘的退变变化;RT-PCR和Western blot均显示HSC70在不同年龄组SD大鼠髓核中均有表达,且24月龄（1.26±0.21;0.56±0.07）表达较3月龄组（1.60±0.30;0.68±0.07）表达明显降低（P〈0.05;P〈0.01）;但与3月龄和24月龄组相比,12月龄组HSC70变化（1.49±0.29;0.61±0.09）无差异（P〉0.05;P〉0.05）。结论 HSC70在椎间盘退变过程中的表达降低,提示HSC70的降低可能与椎间盘退变的发展进程有关。     

Tankyrase 1和自噬与老龄大鼠阴茎勃起功能障碍的相关性

目的 探讨Tankyrase 1和自噬与老龄大鼠阴茎勃起功能障碍的相关性.方法 不同月龄(2、8、16和24月龄)雄性大鼠作为研究对象,神经刺激下阴茎海绵体压力和平均动脉压比值(ICP/MAP)检测用来评价阴茎勃起功能,Masson染色检测大鼠阴茎组织平滑肌细胞和胶原纤维比值(CSMCs/CF),Western blot检测大鼠阴茎海绵体组织中Tankyrase 1、自嗽标记物LC3-Ⅰ/Ⅱ表达和自噬调节蛋白Beclin 1、p70S6K和phospho-p70S6K(Thr389)的表达变化.结果 老龄(24月龄)大鼠组ICP/MAP比值和CSMCs/CF比值较其8龄组显著降低(P<0.01).Western blot检测结果 ,老龄大鼠阴茎海绵体组织中Tankyrase 1、自噬标记物LC3-Ⅰ/Ⅱ及自噬调节蛋白Beclin 1的表达比较8月龄组显著降低(P<0.05).各月龄组自噬调节蛋白p70S6K表达差异无统计学意义(P>0.05),但是,phospho-p70S6K(Thr389)/p70S6K的比值在老龄组表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论 老龄大鼠勃起功能障碍与阴茎海绵体组织CSMCs含量降低密切相关,其发生机制可能与CSMCs中Tankyrase 1表达降低、与自噬功能减弱有关,有待于进一步研究.     

缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α与自噬相关分子的表达及相关性分析

目的探讨缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达及其相关性。方法取健康成年SD大鼠髓核组织,分离培养髓核细胞并传代。取第3代髓核细胞行HE染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定后,随机分为4组。A组细胞于常氧条件下(37℃、5%CO2、20%O2)培养,B组细胞于缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2)培养,C组细胞转染HIF-1α-小干扰RNA后于缺氧条件下培养,D组细胞加入自噬抑制剂3-MA后于缺氧条件下培养。各组细胞培养8 h后,采用Western blot和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达情况。结果经分离纯化的第3代大鼠髓核细胞HE染色后细胞质呈淡粉色,细胞核呈蓝黑色;Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性。Western blot和qRT-PCR检测示,B组HIF-1α、Beclin1和LC3B蛋白及mRNA相对表达量均显著高于A组(P<0.05),C组均显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。D组HIF-1α蛋白和mRNA相对表达量与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),Beclin1和LC3B蛋白和mRNA相对表达量均较B组显著降低(P<0.05)。结论缺氧条件能诱导大鼠髓核细胞中HIF-1α和自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达,且HIF-1α与自噬相关分子的表达具有相关性,即HIF-1α下调能降低自噬相关分子的表达,而缺氧条件下自噬水平下调对HIF-1α的表达无明显影响。     

慢病毒介导的IGF-1与PDGF基因对人退变椎间盘髓核组织的影响

目的观察比较人正常和退变髓核的细胞学和生物学差异,并研究IFG-1和PDGF对人退变髓核的修复作用。方法取患者自愿捐赠的人退变及正常髓核组织,一部分制作成组织切片,进行HE染色观察髓核退变前后形态变化,免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bcl-2 associate X,Bax)蛋白表达;另一部分髓核组织进行细胞培养,倒置显微镜观察细胞形态,Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白表达。然后进行基因转染实验,分为4组,A组为退变髓核细胞;B、C、D组分别用IGF-1基因慢病毒颗粒、PDGF基因慢病毒颗粒和携带IGF-1、PDGF双基因的慢病毒颗粒转染退变髓核细胞。转染21 d,倒置显微镜观察各组细胞形态,流式细胞仪测定各组细胞IGF-1和PDGF阳性率,免疫组织化学染色和Western blot检测各组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达。结果 HE染色示,正常组中央髓核组织可见大量脊索细胞和少量类软骨细胞;而退变组髓核细胞明显减少,且髓核组织内可见大量纤维软骨组织。免疫组织化学染色示,退变组Ⅰ型胶原、Bax蛋白阳性细胞百分比显著高于正常组,Ⅱ型胶原、Bcl-2蛋白阳性细胞百分比显著低于正常组,差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,退变组Ⅱ型胶原蛋白相对表达量显著低于正常组(t=65.493,P=0.000)。基因转染后21 d,与A组比较,B、C、D组细胞活性增加,形态变得较为规则。流式细胞仪检测示B、D组IGF-1阳性率较A组明显增高,C、D组PDGF阳性率较A组明显增高(P0.05)。免疫组织化学染色观察示,A、B、C、D组Ⅱ型胶原蛋白阳性染色情况依次为(±)、(+)、(+)、(++)。Western blot检测示,A、B、C、D组Ⅱ型胶原蛋白相对表达量依次增加,各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 IGF-1与PDGF均能逆转椎间盘髓核细胞的退变且二者具有协同作用,为其今后应用于临床治疗椎间盘退变性疾病提供了实验依据。     

LOX在人体退变椎间盘髓核组织中的表达及临床意义

目的探讨赖氨酰氧化酶(LOX)在人体退变椎间盘髓核组织中的表达及其临床意义。方法选取自2018-01—2018-12诊治的22例腰椎间盘突出症患者作为观察组,将4例同期突发创伤导致腰椎椎体骨折行手术摘除椎间盘的年轻患者作为对照组。按照椎间盘Pfirrmann分级分组,对照组为Ⅰ级(A组);观察组细分为4组,B组为Ⅱ级,C组为Ⅲ级,D组为Ⅳ级,E组为Ⅴ级。取各组椎间盘髓核组织行免疫组化、Western Blot、PT-PCR检测。结果观察组髓核细胞数量及细胞外基质成分明显少于对照组。LOX在髓核细胞中的阳性表达率与Pfirrmann分级、年龄呈负相关。各组LOX蛋白表达量:A组2.69±0.24,B组2.24±0.32,C组1.34±0.19,D组1.30±0.32,E组1.01±0.12。各组LOXmRNA表达量:A组1.06±0.03,B组0.83±0.07,C组0.71±0.09,D组0.53±0.09,E组0.27±0.05。随着椎间盘退变程度加重,髓核组织LOX蛋白表达水平、mRNA表达水平呈逐渐降低趋势。结论 LOX的蛋白及mRNA表达水平随着人体椎间盘退变程度加重而降低,LOX可能参与了人体椎间盘髓核组织退变的发生与发展过程。     

大鼠睾丸间质tau蛋白和微管结合蛋白表达的变化

目的 :检查老龄和青年大鼠睾丸间质组织中tau蛋白和微管结合蛋白的表达情况 ,籍此评价老龄大鼠睾丸衰退的发生机制。　方法 :应用二步法免疫组化技术检查 6月龄SD雄性大鼠 (10只 ,青年组 )和 2 8月龄同品系大鼠 (10只 ,老龄组 )睾丸组织抗Tau蛋白和抗微管结合蛋白的抗体免疫反应情况。　结果 :老龄大鼠睾丸间质组织中tau蛋白免疫反应阳性细胞数明显高于青年组 (P <0 .0 0 1) ,而青年组大鼠睾丸间质组织中微管结合蛋白免疫反应阳性细胞数明显高于老龄组 (P <0 .0 1)。　结论 :tau蛋白和微管结合蛋白免疫反应阳性细胞数量的变化可能与睾丸衰退有密切关系     

地塞米松对兔髓核细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响

目的 观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞表达增殖细胞核抗原(PCNA)的影响.方法 无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,随机分为4组,实验组给予l～100 nmol/L地塞米松进行培养,对照组给与等量磷酸盐缓冲液(PBS),培养5 d后收集细胞.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测地塞米松对兔髓核细胞内PCNA mRNA表达的影响;并提取蛋白用Western blot方法检测PCNA蛋白表达.结果 RT-PCR及Western blot检测结果表明,1～100 nmol/L地塞米松可增加兔髓核细胞内PCNA的表达,当地塞米松浓度为100 nmol/L时效果最显著,分别增加了0.42和1.37倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内PCNA的表达增高.     

KIF1A过表达对氧糖剥夺-再灌注损伤PC12细胞的作用机制研究

目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,对照组,无处理;B组,氧糖剥夺再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)组,PC12细胞用无糖DMEM培养基,于含混合气体(95%N2和5%CO2)的37℃恒温箱内密闭缺氧培养4h;C组,pcDNA3.1空质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1空质粒48h,进行OGD/R处理;D组,pcDNA3.1-KIF1A质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1-KIF1A质粒48h,进行OGD/R处理。B、C、D组经OGD/R处理后,更换常规培养基,正常孵育24h,收集细胞总RNA及蛋白质,进行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT PCR)和Western blot检测KIF1A mRNA和蛋白的表达情况;CCK8检测细胞存活率变化;凋亡ELISA及Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡及Caspase-3活性;Western blot检测各组自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的蛋白表达变化。结果:与A组(1.00±0.00)相比,B组细胞KIF1A mRNA(0.41±0.05)和蛋白表达水平(0.52±0.07,P<0.05)显著下调;细胞活力[(51.60±7.35)%,P<0.05]显著降低。与B组(1.00±0.00)相比,C组空质粒对KIF1A mRNA(0.91±0.13)及蛋白质(1.08±0.08)表达,细胞活力[(51.60±7.35)%vs(47.30±4.16)%],细胞凋亡(1.95±0.18 vs 2.08±0.16,P>0.05)等无显著影响。而D组KIF1A过表达后能显著上调KIF1A mRNA(2.63±0.16)以及蛋白表达(2.51±0.18,P<0.05),显著缓解OGD/R引起的细胞存活率下降[(51.60±7.35)%vs(86.40±9.03)%]及凋亡[1.95±0.18 vs 1.36±0.12,P<0.05];与B组相比,D组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(1.68±0.14 vs 1.19±0.09,P<0.05)及pmTOR的表达(1.00±0.00 vs 1.26±0.02,P<0.05)显著受抑制,P62表达显著升高(0.53±0.05 vs 0.89±0.09,P<0.05)。结论:KIF1A过表达可促进缺血再灌注损伤诱导的PC12细胞存活、抑制细胞自噬与凋亡,其机制可能与抑制mTOR通路相关。     

γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯与氯喹的交叉对话作用对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡的影响

目的观察胃癌MKN-45细胞中Notch信号通路抑制剂3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)对自噬的影响及自噬抑制剂氯喹(CQ)对Notch信号通道的影响,探讨DAPT联合CQ对MKN-45细胞增殖、凋亡的影响。方法将MKN-45细胞分成4个组,对照组(Control组,RPMI 1640完全培养基培养);氯喹组(CQ组,含40μmol/L氯喹的RPMI 1640完全培养基培养);γ-分泌酶抑制剂组(DAPT组,含80μmol/L DAPT的RPMI 1640完全培养基培养);联合用药组(Comb组,含40μmol/L CQ和80μmol/L DAPT的RPMI 1640完全培养基培养)。应用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡;应用透射电镜、蛋白质印迹法(Western blot)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞自噬水平;应用Western blot检测Notch信号通路表达。两组间比较采用独立样本t检验。结果MTT结果显示,Comb组[(55.09±1.38)%]细胞增殖能力明显低于DAPT组[(78.83±1.74)%]和CQ组[(64.82±1.89)%],差异均有统计学意义(t=18.514、7.185,P<0.01)。流式细胞结果显示,Comb组[(43.43±2.30)%]凋亡率明显高于DAPT组[(27.26±3.02)%]和CQ组[(22.16±2.24)%],差异均有统计学意义(t=7.339、11.415,P<0.01)。Western blot、RT-PCR结果显示,DAPT组自噬相关的微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、苄氯素1(Beclin1)、自噬相关基因7(ATG7)信使核糖核酸(mRNA)、自噬相关基因12(ATG12)mRNA的相对表达量(0.587±0.030、1.503±0.066、1.797±0.110、2.433±0.111)明显高于Control组(0.333±0.002、1.137±0.068、1.000±0.000、1.000±0.000),差异均有统计学意义(t=14.893、6.695、12.527、22.446,P<0.01)。CQ组Notch1蛋白的相对表达量(0.932±0.061)明显高于Control组(0.477±0.031),差异有统计学意义(t=11.590,P<0.01)。结论胃癌MKN-45细胞中自噬与Notch信号通路存在交叉对话,两者相互调节,DAPT联合CQ可以使胃癌MKN-45细胞增殖能力下降、凋亡率提高。     

mTORC1和mTORC2调控前列腺癌雄激素受体和Akt磷酸化

目的 观察mTORC1和mTORC2在前列腺癌C4-2细胞中的作用.方法 噻唑蓝(MTY)比色法检测转染siRNA raptor和siRNA rictor后C4-2细胞增殖改变;流式细胞术(FCM)检测敲除mTORC1(raptor)和mTORC2(rictor)后C4-2细胞凋亡;Western blot检测siRNA raptor和siRNArictor后C4-2细胞雄激素受体(AR)和Akt磷酸化表达.结果 MTT显示敲除raptor生长抑制率无显著变化[(25.37±2.63)%比(27.49±2.96)%,P＞0.05],而敲除rictor组[(25.37±2.63)%比(62.86±5.61)%,P＜0.01]显著地抑制了细胞的生长;FCM显示敲除raptor显著增加了细胞凋亡[(11.76±1.45)%比(38.23±3.71)%,P＜0.01],而敲除rictor对C4-2细胞凋亡无显著性变化[(11.76±1.45)%比(14.25 ±1.68)%,P＞0.05];Western blot检测显示敲除mTORC1显著增加C4-2细胞AR[(0.21±0.04)%比(0.73 ±0.12)%,P＜0.01]和Akt磷酸化表达[(0.23±0.06)%比(0.68±0.11)%,P＜0.01],而敲除mTORC2显著地抑制了C4-2细胞AR[(0.21 ±0.04)%比(0.07 ±0.02)%,P＜0.01]和Akt磷酸化表达[(0.23±0.06)%比(0.06±0.03)%,P＜0.01].结论 mTORC2对前列腺癌C4-2细胞的存活是必须的,mTORC2是治疗前列腺癌有希望的靶目标.

Abstract：

Objective To investigate the role of mTORC1 and mTORC2 in prostate cancer C4-2 cells. Methods The growth inhibition and apoptosis rate were examined by methyl thiazol tetrazolium ( MTT) assay and flow cytometry ( FCM) after knockouting raptor and rictor in prostate cancer C4-2 cells.The expression of androgen receptor ( AR) and Akt phosphorylation after transfection of siRNA raptor and rictor was detected by Western blotting. Results The growth inhibition of C4-2 cells had no significant change after transfecting siRNA raptor [(25. 37 ± 2. 63) % vs (27.49 ± 2. 96) % , P ＞ 0.05] , and the apoptosis rate was markedly increased [(11. 76 ± 1. 45) % vs (38. 23 ± 3. 71) % ,P ＜0. 01]. The inhibition of mTORC2 (rictor) markedly decreased the growth of C4-2 cells [(25.37 ±2.63)% vs (62.86 ±5.61)% ,P＜0.01] , and the apoptosis rate had no significant change [(11.76 ±1.45)% vs (14.25±1.68)%,P＞0.05]. The expression of AR [(0.21 ±0.04)% vs (0. 73 ±0. 12)% ,P＜0. 01] and Akt phosphorylation [(0. 23 ± 0. 06 ) % vs ( 0. 68 ± 0. 11 ) % , P ＜ 0. 01] were significantly increased after knocking down mTORC1 (raptor) in C4-2 cells, andt the inhibition of mTORC2 (rictor) markedly decreased the expression of AR [( 0. 21 ± 0. 04 ) % vs ( 0. 07 ± 0. 02 ) % , P ＜ 0. 01] and Akt phosphorylation [(0. 23 ± 0. 06) % vs ( 0. 06 ± 0. 03) % , P ＜ 0. 01]. Conclusion mTORC2 not only is required for the survival of prostate cancer, but also a promising therapic target.     

血管内皮生长因子对关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)对体外培养的关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法 体外培养SD乳鼠关节软骨细胞,用白细胞介素(IL)-1β诱导的方法建立骨关节炎(OA)体外模型,实验分为4组,每组加入不同处理因素进行干预,A组:(正常对照组)不加任何处理因素;B组:10 μg/L VEGF;C组:10 μg/L IL-1β;D组:10 μg/L VEGF+ 10 μg/LIL-1β。采用实时荧光定量PCR( Real Time PCR)检测iNOS mRNA的表达,采用蛋白免疫印迹法( Western blot)检测iNOS蛋白的表达。结果 iNOS mRNA的表达:A组iNOS mRNA无表达,B组(9.64±1.64)、C组(17.27±2.01)及D组(28.93±6.63),3组的iNOS mRNA表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平明显高于B组(P＜0.01)及C组(P＜0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P＜0.05)。iNOS蛋白的表达:A组iNOS蛋白无表达,B组(0.44±0.12)、C组(0.74±0.07)及D组(1.38±0.38),3组的iNOS蛋白表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的蛋白表达水平明显高于B组(P＜0.01)及C组(P＜0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P＜0.01)。结论 在OA的发病过程中,VEGF可能通过上调软骨细胞iNOS的表达发挥重要作用。     

bcl-2硫代反义寡核苷酸抑制人恶性黑色素瘤A375细胞bcl-2mRNA及蛋白的表达

目的 观察bcl-2硫代反义寡核苷酸（ASODN）对人恶性黑色素瘤A375细胞bcl-2mRNA及蛋白表达的影响。方法 对ASODN进行硫代修饰、脂质体转染人黑色素瘤A375细胞。实验分反义ASODN组、正义SODN组和对照组,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫组织化学检测bcl-2mRNA及蛋白水平。结果 免疫组织化学检测显示,反义组Bcl-2蛋白表达水平显著低于对照组和正义组（分别为53．14±4．26、138．22±8．45和141．08±7．83,P〈0．01）;RT—PCR结果示,反义组bcl-2mRNA水平明显低于对照组和正义组（分别为0．38±0．1l、0．964-0．13和O．97±0．14,P〈0．01）。结论 bcl-2硫代反义寡核苷酸能下调人黑色素瘤A375细胞bcl-2mRNA基因水平,阻断蛋白表达。     

WWOX在胆管癌组织中的表达及其对胆管癌细胞生物学行为的影响

目的 研究抑癌基因WWOX表达对胆管癌RBE细胞生长的影响.方法 采用免疫组化方法检测2005年7月至2010年5月54例胆管癌组织、12例正常胆管组织中WWOX蛋白表达水平.将携有WWOX基因的真核表达载体转染胆管癌细胞系RBE细胞(RBE/WWOX组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(RBE/con组)及未经转染(自然生长组)的RBE细胞作为对照.荧光定量RT-PCR和Western Blot法检测WWOX在RBE细胞中的表达情况;噻唑蓝实验检测转染前后各组细胞增殖活性;FCM法检测各组细胞的凋亡;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位;Transwell小室侵袭实验检测各组肿瘤细胞侵袭力;荧光定量RT-PCR和Western Blot法检测胆管癌细胞bcl-2、bax、FasL、caspase-3表达的变化.结果 WWOX在胆管癌中的表达低于正常胆管组织(P＜0.05),蛋白表达的缺失频率为40.7%.建立稳定表达WWOX基因的RBE/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.转染后的RBE细胞噻唑蓝吸光度明显下降(P＜0.05).与自然生长组和RBE/con组比较,FCM显示RBE/WWOX组细胞的凋亡率明显增高(P＜0.01),JC-1显示转染后的线粒体膜电位下降(P＜0.01),侵袭实验显示转移至下室滤膜的细胞数明显减少(P＜0.01).荧光定量RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA表达是自然生长组的0.12倍,bax、caspase-3 mRNA分别是自然生长组的4.72和2.57倍,FasL mRNA的表达无明显变化;Western Blot法检测发现bcl-2蛋白的表达降低,bax、caspase-3蛋白表达升高,FasL无明显变化.结论 抑癌基因WWOX通过诱导胆管癌细胞凋亡发挥抗肿瘤增殖的作用.

Abstract：

Objective To study the effects of anti-oncogene WWOX on cell growth of cholangiocarcinoma. Methods The expression of WWOX protein was detected with immunohistochemical method-SP in 54 patients with cholangiocarcinoma from July 2005 to May 2010 and 12 samples of normal bile duct tissues. The recombinant WWOX eukaryotic expression plasmid was introduced into RBE cells by liposome-mediated transfection and positive cell clones were selected and amplified. The mRNA and protein expressions in RBE cells stably transfected with WWOX were investigated by quantitative RT-PCR and Western Blot before and after transfection. Cell proliferation was tested by MTT, cell apoptosis was assessed by FCM, the alteration of mitochondria membrane potential (△Ψm) was detected by JC-1 staining method,cell invasion was determined by Transwell chamber assay. The expression change of bcl-2, bax, FasL,caspase-3 mRNA and protein was detected by quantitative RT-PCR and Western Blot. Results The expression of WWOX protein was significantly lower in cholangiocarcinoma than that in normal bile duct tissues and loss of WWOX protein expression was found in 40. 7% of cholangiocarcinoma specimens ( P ＜0.05). RBE cells with stable transfection of WWOX were established. Quantitative RT-PCR showed that the expression of WWOX mRNA was significantly enhanced and Western Blot demonstrated that WWOX protein expression was markedly increased. MTT showed that WWOX gene transfection significantly decreased the proliferation of RBE cells ( P ＜ 0. 05 ). FCM analysis showed that the apoptosis rate after transfection was significantly promoted [( 1.1 ± 0. 6 ) % vs. ( 1.7 ± 0. 5 ) % vs. ( 35.2 ± 4. 4 ) %, P ＜ 0. 01], JC-1 staining method indicated that the experimental group was loss of △Ψm [( 12. 6 ± 1.9 ) % vs. ( 13.6 ± 1.8 ) % vs.(48. 7 ± 2. 9 ) %, P ＜ 0. 01], transwell chamber assay showed that the number of transfected cells that passed the transwell membrane was significantly less than those of control groups ( 77 ± 6 vs. 72 ± 8 vs. 48 ±6, P ＜0. 01 ). Quantitative RT-PCR and Western blotting showed that the expression of bcl-2 mRNA and protein was markedly decreased and the expression of bax, caspase-3 were significantly increased. There was no significant change in the expression of FasI. Conclusion WWOX exerts its antitumor effect against proliferation through inducing cell apoptosis in cholangiocarcinoma.     

维生素K2对肝癌细胞株内的肝癌衍生生长因子表达的抑制作用

目的 检测维生素K2对肝癌细胞株内的肝癌衍生生长因子(HDGF)表达的作用。方法 半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测0、10、30μm维生素K2干预后肝癌细胞中HDGF的mRNA表达,Western blot法检测不同浓度维生素处理后的肝癌细胞中HDGF蛋白表达。结果 RT-PCR结果示96 h后10、30μm维生素K2干预组能呈剂量依赖性抑制肝癌细胞中HDGF的mRNA表达。Western blot法检测结果示96 h后的10、30 μm维生素K2干预组中HDGF的蛋白表达分别为无药对照组的(0.915±0.025)倍和(0.530±0.030)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 维生素K2可下调肝癌细胞中的HDGF表达。     

细胞凋亡、细胞增殖在人颈椎间盘退变过程中的作用

目的 探讨细胞凋亡、细胞增殖在人颈椎间盘退变过程中的作用以及人颈椎间盘细胞凋亡可能涉及的信号转导途径.方法 收集手术切除的33份突出颈椎间盘组织,以22份正常人颈椎间盘组织作为对照,组织形态学和TUNEL法检测凋亡细胞,免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、bax及Caspase-3的表达.结果 实验组的细胞密度低于对照组(髓核内:6.30±1.54比8.96±1.14;软骨终板内:17.27±1.82比25.41±1.89);实验组的TUNEL阳性细胞率高于对照组(髓核内:11.73±1.36比7.02±1.26;软骨终板内:13.04±1.75PC6.86±1.42);实验组髓核内PCNA阳性细胞率高于对照组(8.38±1.98比4.55±1.54);实验组髓核内bax阳性细胞率和Caspase-3阳性细胞率分别高于对照组(bax:19.32±1.95比10.94±1.72;Caspase-3:15.05±1.74比8.92±1.48);TUNEL阳性细胞率与细胞密度之间呈负相关(P＜0.01);实验组髓核内PCNA阳性细胞率与细胞密度之间呈正相关(P＜0.01);两组髓核内bax阳性细胞率、Caspase-3阳性细胞率均与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关(P＜0.01).结论 细胞凋亡与细胞增殖间的不平衡可能是人退变颈椎间盘内细胞密度下降的原因,人颈椎间盘髓核细胞的过度凋亡可能与bax和Caspase-3的表达上调有关.     

环氧合酶-2、前列腺素E2在突出腰椎间盘中的表达及其意义

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)在突出腰椎间盘组织中的表达及其在坐骨神经痛发病机制中的作用。方法病变组42个突出椎间盘标本取自42例因腰椎间盘突出并具有坐骨神经放射性疼痛症状行手术治疗的患者,包括突起型12例,破裂型15例,游离型15例,取材部位为紧贴神经根突入椎管的椎间盘组织(A部位)和椎间隙内残存的椎间盘组织(B部位)。对照组5个标本取自1例新鲜年轻尸体的L1~S1椎间盘组织,取材部位为椎间盘边缘(A部位)和中央髓核(B部位)。术前对所有患者的坐骨神经痛严重程度进行视觉模拟疼痛评分(VAS)。应用ELISA方法检测各组标本中COX-2和PGE2的含量。结果 COX-2和PGE2在腰椎间盘突出组中的含量明显高于对照组(P0.01);突出组A部位COX-2和PGE2的含量从突起型到→破裂型→游离型均逐渐升高,差异有统计学意义(P0.01)。突出组A部位COX-2和PGE2的含量要高于B部位(P0.01);突出腰椎间盘组织中COX-2和PGE2的含量之间存在明显相关性(r=0.863,P0.01);PGE2的含量与患者坐骨神经痛的VAS评分存在明显相关性(r=0.848,P0.01)。结论 COX-2与PGE2的含量密切相关,并参与对PGE2表达的调控;PGE2的含量与坐骨神经痛的严重程度密切相关。