体外培养的成年兔眼色素上皮细胞屏障功能的研究

目的 研究体外培养的成年兔眼视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的血-视网膜外屏障功能.方法 对成年兔眼RPE 细胞进行原代培养,免疫组织化学通过MNF116和S-100鉴定细胞纯度.将细胞接种于铺有层粘连蛋白的Transwell滤膜上,分别于培养过程中不同时间点进行跨膜电阻测定,待电阻达到平台期后对膜切面行透射电子显微镜观察;并通过细胞ZO-1免疫荧光化学法了解紧密连接的形成情况.结果 成功原代培养了兔眼RPE 细胞并且无其他细胞污染.接种于Transwell后,RPE 细胞TER值3周达到最高值约88.14 Ω·cm2,维持1周并开始下降.透射电镜可见细胞表面有大量微绒毛并形成紧密连接.ZO-1免疫荧光化学结果可见细胞形态基本呈多边形,紧密连接基本形成.结论 成年兔眼RPE细胞通过培养于铺有层粘连蛋白的Transwell滤膜上可以成功建立细胞屏障功能模型.     

视网膜色素上皮细胞的体外培养

视网膜色素上皮细胞培养技术是研究其生理功能，生化特征和病理过程的一个重要手段，本文介绍了视网膜色素上皮细胞的分离、培养、纯化和鉴定技术。细胞分离以机械分离和酶消化为主。细胞贴壁培养是目前最常使用的方法。细胞的鉴定以开矿学鉴定和免疫组化鉴定方法。     

人胚眼色素上皮细胞的培养

准备可供植入的人色素上皮细胞。方法将１２－２４周人胚眼的视网膜色素上皮细胞自脉络膜毛细血管床上撕离,置入培养皿中作贴壁培养。结果培养的ＲＰＥ细胞可在培养皿中存活２－３个月。顺极性和反极性培养不影响细胞的形态和存活时间。培养的ＲＰＥ细胞具有吞噬视细胞外节的功能。结论培养的胚眼ＲＰＥ上皮片可作为同种异体ＲＰＥ移植的良好供体。     

兔眼虹膜色素上皮细胞的培养与鉴定

目的:体外培养和观察兔眼虹膜色素上皮细胞(IPEC),为临床和实验研究IPE细胞提供基础。方法:采用酶消化加酶辅助机械分离法分离IPE细胞,观察培养细胞的生长情况,并采用免疫荧光法对其进行鉴定。结果:原代培养的IPE细胞多数呈圆形或六边形,细胞内充满黑色颗粒。传代培养的IPE细胞呈梭形或纤维细胞样生长,细胞中的色素颗粒也逐渐减少。免疫荧光法对培养细胞进行cytokeratin染色显示IPE细胞成阳性反应,阳性率达100%。结论:采用酶消化加酶辅助机械分离法可成功地分离培养出IPE细胞。     

猪视网膜色素上皮细胞间连接与通讯功能的关系

目的：探讨体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞间连接与通讯功能的关系。 方法：用5，6-碳氧荧光素醋酸盐进行细胞染色，光淬灭某些细胞中的荧光分子，激光扫描共聚焦显微镜观察不同连接状态的RPE细胞内的荧光恢复速率，评价缝隙连接的通讯功能。 结果：光漂白后的ＲＰＥ细胞中的荧光强度得以恢复，与之紧密相连的细胞则有荧光下降，分别与1, 2, 3个细胞相连的每分钟荧光恢复速率依次是1.997±0.665，4.378±0.811，8.736±2.084。 结论：体外培养的猪RPE细胞缝隙连接通讯功能的强弱与细胞的连接状况有关。 (中华眼底病杂志,1998,14:41-42)     

视网膜色素上皮细胞培养技术及其应用

细胞培养技术已在生物学和医学各研究领域得到广泛应用。本文简要介绍这一技术，重点阐述视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞的分离、收集和培养等方法。对培养ＲＰＥ细胞的生物学特征进行了描述。强调ＲＰＥ细胞培养技术在研究眼生理和眼疾病等方面的应用价值。     

胚胎发育中神经视网膜对血视网膜外屏障结构形成的作用

目的 研究胚胎发育中神经视网膜对血视网膜外屏障结构形成的作用。 方法 将孵化7、10、14 d的鸡胚眼各150、120和90只，分批分别剥离视网膜神经上皮层（RNE）和色素上皮层（RPE）。RNE用来制备不同条件的培养液（7drcS F3、10drcSF3和14drcSF3），将7 d和14 d的RPE细胞分别培养到12 mmTranswell滤膜上,其顶房分别用SF3或上述条件培养液，底房均用SF2培养液。形成单层RPE细胞后，测定此上皮层的电阻(TER)。最后固定细胞，用细胞免疫组织化学方法和透射电子显微镜检测RPE细胞间紧密连接形成的情况。 结果 不同培养液(SF3/S F2, 7drcSF3/SF2,10drcSF3/SF2, 14drcSF3/SF2)培养7d和14d鸡胚眼的RPE细胞TER之间的差异有非常显著性的意义(P＜0.01)。电子显微镜结果显示神经视网膜条件培养液可以使RPE细胞产生细胞极性，有效地促使紧密连接条带形成连续的网状结构。 结论 神经视网膜对血视网膜外屏障结构的形成起积极的促进作用。 （中华眼底病杂志，2004，20：237-240）     

曲安奈德对人视网膜色素上皮细胞活性与 屏障功能的影响

目的观察曲安奈德 (TA)对人视网膜色素上皮（RPE）细胞活性与屏障功能的影响。方法用ARPE-19细胞，96孔板中培养至４周，加入不同浓度的TA（0.02、0.05 mg/ml），继续培养3 d或7 d，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞活性；将细胞培养在多聚酯滤膜上，４周时记录跨上皮电阻（TER），然后分别在培养液中加入0.02、0.05 mg/ml TA继续培养１周，再次测量TER，并以辣根过氧化物酶（HRP）作示踪剂、酶联免疫吸附试验（ELISA）法评价不同浓度TA组ARPE-19细胞的通透性。结果在含0.02 mg/ml TA培养液中培养3 d或7 d，细胞平均存活率分别为93.70%和90.63%，其细胞活性与对照组相比，差异无统计学意义（P=0.147，0.091）；在含0.05 mg/ml TA培养液中培养相同时间后，细胞活性较对照组显著降低（平均存活率为87.75%、88.98%；P=0.025，0.043）；经过1周培养，2个处理组的TER与对照组相比均有极显著降低（P 均＜0.001）；两个处理组HRP的通透性均显著高于对照组（0.001＜P＜0.05）。结论TA可以使ARPE 19细胞的活性降低，并破坏其屏障功能的完整性。(中华眼底病杂志,2005,21:237-239)      

新生小牛视杆细胞体外发育过程中细胞形态及视色素分子分布的极性特征

目的 明确新生小牛视网膜视杆细胞体外发育过程中细胞形态及视色素分子分布的变化规律。 方法 分离培养新生小牛视网膜神经细胞，培养10、20、30和40 d的神经元用于免疫细胞化学染色，采用rho4D2抗体标记视网膜视杆细胞，观察不同培养时期的阳性细胞的形态特征及视色素分子分布的特点。用图像分析系统定量测量阳性细胞的免疫反应强度。 结果 rho4D2阳性细胞呈现两种形态，一种为无突起的小圆形细胞，另一种为带有顶端突起的细胞。体外培养10 d时，视色素弥漫地分布于整个细胞膜及顶端突起；培养20 d时视色素逐渐向顶端突起或细胞的一端集中；到培养30、40 d时，视色素聚集于顶端突起或细胞的一端，呈现极性分布特征。定量分析显示，体外培养20 d的阳性细胞，免疫反应强度较培养10 d时明显增强，培养20、30、40 d的阳性细胞的免疫反应强度没有明显差异。 结论 体外培养30、40 d的视杆细胞具备细胞结构及视色素分子分布的极性特征，并有高水平的蛋白质表达能力，是发育成熟的神经元。 (中华眼底病杂志, 2005, 21: 394-396)     

Y27632体外诱导视网膜色素上皮细胞转分化为神经元样细胞的初步研究

目的 探讨Y27632在体外诱导成人视网膜色素上皮(RPE)细胞转分化为神经元样细胞的可行性.方法 取生长良好的第3～6代成人RPE接种于6孔培养板,细胞贴壁生长后分为对照组和实验组.对照组培养基为2%胎牛血清(FBS)+Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12培养液,实验组在此培养基中加入10 μmol/L Y27632.于诱导3、6 h和1、3、5、7 d观察细胞形态,并用细胞免疫荧光染色法鉴定诱导后3 d对照组和实验组角蛋白CK18、微管相关蛋白Map2、神经丝蛋白NF200、Pax6的阳性表达率,两组间的比较采用x2检验.结果 实验组经诱导后RPE细胞发出轴突样突起并相互连接成网状,呈现典型的神经元细胞形态,占50.1%.对照组RPE和实验组细胞角蛋白表达阳性率分别为93.97%和43.88%,两组比较差异有统计学意义(x2=64.763,P＜0.01);Map2对照组和实验组阳性率分别为4.49%和31.90%,两组比较差异有统计学意义(x2=23.634,P＜0.01);NF200对照组阳性表达率为22.37%,但阳性表达细胞形态为类圆形,实验组阳性率表达为57.45%,大量细胞发出轴突样突起,两组比较,差异有统计学意义(x2=21.261,P＜0.01);Pax6对照组和实验组细胞阳性率分别为8.33%和65.79%,两组比较,差异有统计学意义(x2=25.946,P＜0.01).结论 Y27632体外诱导成人RPE细胞出现神经元样细胞,是一种可行的诱导方法.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of Y27632 to induce transdifferentiation from human retinal pigment epithelial(hRPE)cells into neuron-like cells in vitro.Methods The third to sixth generation of primary hRPE cells were cultured with 2% fetal bovine serum+Dulbecco's modified eagle medium/F12 culture solution,with(experimental group)or without(control group)10 μmol/L Y27632.At 3,6 hours and 1,3,5,7 days after induction,the morphologic changes of RPE cells were observed by inverted microscope.The expression rate of CK18,Map2,NF200 and Pax6 at 3 days after induction in the experimental and control group were detected by immunofluorescent staining.χ2 test was employed for comparison between the two groups.Results 50.1% cells of the experimental group formed axon-like processes and interconnected each other with typical neuron-like appearance.The expression rates of CK18,Map2,NF200 and Pax6 in the experimental group were 43.88% ,31.90% ,57.45% and 65.79% .while the above indexes in the control group were 93.97% ,4.49% ,22.37% and 8.33% respectively.Compared the expression rate of CK18(χ2=64.763),Map2(χ2=23.634),NF200(χ2=21.261)and Pax6(χ2=25.946)between the two groups,the differences were significant(P＜0.01).Conclusion The hRPE cells can be trans-differentiated into neuron-like cells in vitro bv Y27632.     

蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的 观察蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡的影响。 方法 用蓝光照射体外培养的人RPE细胞，分为3组，A组：不同光照强度；B组：同一光照强度，不同光照时间；C组：同一光照强度和光照时间，不同细胞培养终止时间。利用末端脱氧核酸转移酶介导的原位缺口末端标记（TUNEL）、荧光素标记的连接素V/碘化吡啶（Annexin V-FITC/PI）双染流式细胞检测、透射电子显微镜等手段观察细胞凋亡。 结果 TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆，细胞核浓缩，边聚成新月形或帽状，细胞核碎裂成数个，细胞膜出胞。透射电子显微镜观察发现细胞内线粒体肿胀，线粒体内膜嵴消失；粗面内质网扩张；溶酶体增加，内含代谢产物。A组低于一定阈值［（500±100）lx］的蓝光光照对RPE细胞损伤较轻，细胞凋亡及坏死随光照强度的增强而增加；B组随着光照时间延长，RPE细胞凋亡数量没有增加，而细胞坏死逐渐增加；C组光照后6、12h，损伤以细胞凋亡为主，但随着光照时间延长，凋亡继发坏死细胞和坏死细胞明显增加。 结论 蓝光照射可引起体外培养的人RPE细胞损伤，损伤形式有凋亡、凋亡继发坏死及坏死；损伤程度呈光照强度和光照时间依赖性。 (中华眼底病杂志, 2005, 21: 384-387)     

Y27632体外诱导视网膜色素上皮细胞转分化为神经元样细胞的初步研究

Objective To investigate the feasibility of Y27632 to induce transdifferentiation from human retinal pigment epithelial(hRPE)cells into neuron-like cells in vitro.Methods The third to sixth generation of primary hRPE cells were cultured with 2% fetal bovine serum+Dulbecco's modified eagle medium/F12 culture solution,with(experimental group)or without(control group)10 μmol/L Y27632.At 3,6 hours and 1,3,5,7 days after induction,the morphologic changes of RPE cells were observed by inverted microscope.The expression rate of CK18,Map2,NF200 and Pax6 at 3 days after induction in the experimental and control group were detected by immunofluorescent staining.χ2 test was employed for comparison between the two groups.Results 50.1% cells of the experimental group formed axon-like processes and interconnected each other with typical neuron-like appearance.The expression rates of CK18,Map2,NF200 and Pax6 in the experimental group were 43.88% ,31.90% ,57.45% and 65.79% .while the above indexes in the control group were 93.97% ,4.49% ,22.37% and 8.33% respectively.Compared the expression rate of CK18(χ2=64.763),Map2(χ2=23.634),NF200(χ2=21.261)and Pax6(χ2=25.946)between the two groups,the differences were significant(P＜0.01).Conclusion The hRPE cells can be trans-differentiated into neuron-like cells in vitro bv Y27632.     

Y27632体外诱导视网膜色素上皮细胞转分化为神经元样细胞的初步研究

Objective To investigate the feasibility of Y27632 to induce transdifferentiation from human retinal pigment epithelial(hRPE)cells into neuron-like cells in vitro.Methods The third to sixth generation of primary hRPE cells were cultured with 2% fetal bovine serum+Dulbecco's modified eagle medium/F12 culture solution,with(experimental group)or without(control group)10 μmol/L Y27632.At 3,6 hours and 1,3,5,7 days after induction,the morphologic changes of RPE cells were observed by inverted microscope.The expression rate of CK18,Map2,NF200 and Pax6 at 3 days after induction in the experimental and control group were detected by immunofluorescent staining.χ2 test was employed for comparison between the two groups.Results 50.1% cells of the experimental group formed axon-like processes and interconnected each other with typical neuron-like appearance.The expression rates of CK18,Map2,NF200 and Pax6 in the experimental group were 43.88% ,31.90% ,57.45% and 65.79% .while the above indexes in the control group were 93.97% ,4.49% ,22.37% and 8.33% respectively.Compared the expression rate of CK18(χ2=64.763),Map2(χ2=23.634),NF200(χ2=21.261)and Pax6(χ2=25.946)between the two groups,the differences were significant(P＜0.01).Conclusion The hRPE cells can be trans-differentiated into neuron-like cells in vitro bv Y27632.     

人视网膜色素上皮细胞与T淋巴细胞的激活

目的 观察人视网膜色素上皮（RPE）细胞人类白细胞抗原(HLA)-DP、-DQ、-DR抗原和CD40抗原的表达，以确定它们在免疫应答过程中的分子表达和刺激T淋巴细胞活化的能力。方法 人RPE细胞分别在γ-干扰素诱导和无诱导的条件下培养，免疫组织化学染色方法测定HLA-DP、-DQ、-DR抗原和CD40抗原在RPE细胞中的表达。体外共同培养人RPE细胞和外周血单个核细胞，荧光活化细胞分类仪测定其中活化的T淋巴细胞CD69的表达。结果 γ-干扰素能够诱导HLA-DP、-DQ、-DR抗原表达升高和CD40在人RPE细胞上的表达，CD69阳性的T淋巴细胞，在人RPE细胞与外周血单个核细胞的共同培养系统中的含量增加。结论 人RPE细胞能够激活外周血中T淋巴细胞，是一种具有免疫学特性潜能的抗原递呈细胞。     

玻璃体液诱导视网膜色素上皮细胞间质转分化作用

目的 观察人玻璃体液体外培养诱导人视网膜色素上皮(RPE)细胞间质转分化作用.方法 将3～5代传代人RPE细胞分为普通培养组和玻璃体液培养组,分别应用普通培养液和25％玻璃体液进行培养.采用相差显微镜观察两组细胞形态变化,细胞爬片检测肌动蛋白细胞骨架的变化.分别用细胞划痕法、Transwell小室侵袭法及Ⅰ型胶原凝胶收缩实验检测细胞迁移、侵袭及收缩力的变化.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Snail1 mRNA的表达.结果 相差显微镜观察发现,普通培养组细胞保持扁平形态,细胞接触广泛;玻璃体液培养组细胞一端呈扇形,另一端呈锥形拖尾形或梭形,细胞生长呈彼此分离的方式.细胞爬片结果显示,普通培养组肌动蛋白骨架主要分布于RPE细胞周边部,形如细胞周边的条带状;玻璃体液培养组肌动蛋白纤维在细胞的一端重排,形成扇形扁平状伪足突起,而在细胞另一端形成锥形拖尾改变.玻璃体液培养组与普通培养组比较,RPE迁移及侵袭能力显著增强(t=14.190、22.630)、细胞收缩能力显著下降(t=6.221),差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,玻璃体液培养组与普通培养组比较,Snail1 mRNA表达显著上升(t=3.218,P=0.032),α-SMA mRNA表达显著下降(t=3.990,P=0.016),差异均有统计学意义.结论 玻璃体液培养可诱导RPE细胞间质转分化.这一作用通过增强RPE细胞迁移及侵袭能力,抑制RPE细胞收缩力;提高RPE细胞Snail1 mRNA表达,下调α-SMA mRNA表达实现.     

人玻璃体液对培养的视网膜色素上皮细胞形态及骨架蛋白表达的影响

目的 观察人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞体外培养时的形态及相关细胞骨架蛋白变化规律，进而研究人玻璃体液对RPE细胞形态及细胞骨架蛋白表达的影响，探讨玻璃体液在增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)中的调控作用。 方法 行人RPE细胞原代培养并传代扩增，采用Western blot法，分别检测角蛋白18(cytokeratin 18, CK18)、平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)在第2、5、8代细胞中的表达情况。用1∶4玻璃体液培养RPE细胞6 d后，观察细胞形态及超微结构改变，采用免疫细胞化学及Western blot法，检测CK18、α-SMA表达变化。 结果 人RPE细胞在体外培养时，会逐渐丧失上皮样形态，向成纤维样转变，CK18在2代表达量中等，5代最高，而在8代明显下降，而α-SMA逐渐升高。与对照组相比，人玻璃体液促进RPE细胞在形态上向成纤维样细胞转变。同时细胞内CK18表达低于对照组，差异具有显著性的意义(P＜0.05)；α-SMA表达高于对照组，差异具有显著性的意义(P＜0.01)。 结论 人RPE细胞在玻璃体液与血清的作用下向具有收缩性能的间质细胞转变，同时细胞移行能力可能发生改变，结果提示玻璃体液可能促进RPE细胞参与的PVR的发展。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 289-292)     

蓝光诱导大鼠视网膜色素上皮细胞复制衰老

目的 探讨蓝光光照强度、时间与大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞复制衰老的关系.方法 将36只鼠龄12～14周的Wistar大鼠置于悬有波长为(450±10)nm的医用蓝光灯管的自制光照架中.随机分为4组,每组9只大鼠,1组:无光照对照组;2组:自然光照组;3组:500 lx光照组;4组:1000 lx光照组.每组按照照射时间再分为1、2、3个月组3个亚组,分别在1、2、3个月时行10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取出眼球,将右眼球行石蜡切片,苏木精伊红(HE)染色;左眼球行冰冻切片,采用衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色方法观察RPE细胞染色阳性情况.采用SPSS 11.5统计软件对结果数据进行统计学分析.结果 不同光照强度组、不同光照时间组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异有统计学意义(F=510.309,55.016;P=0.000);组间两两比较,除1组与2组之间差异无统计学意义外(P=0.154),其它各组之间差异均有统计学意义(P=0.000).在单一光照强度条件下,除1组大鼠RPE细胞SA-β-Gal染色阳性细胞个数差异无统计学意义外(P=0.897),其余各组差异均有统计学意义(P＜0.01);在单一时间条件下,各组差异均有统计学意义(P=0.000).结论 同一蓝光光照强度下,随着时间的增加大鼠视网膜RPE细胞逐渐出现复制衰老改变;同一时间条件下,随光照强度增加大鼠视网膜RPE细胞也逐渐出现复制衰老改变.     

视网膜色素上皮细胞诱导活化淋巴细胞的凋亡

目的 观察视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞对体外抗原特异性活化淋巴细胞的影响,探索RPE细胞在眼免疫赦免中的作用。 方法 建立RPE与抗原特异性T淋巴细胞系和静止淋巴细胞之间的共培养系统。使用基因组DNA电泳、DNA末端标记和流式细胞技术检测凋亡的诱导情况。 结果 与RPE共培养的抗原特异性活化淋巴细胞出现凋亡征象。随着时间的延长,凋亡细胞的数量逐渐增加。定量分析表明：共育24小时的凋亡细胞占5.95％;48小时占9.38%;72小时占17.95%。与此相反,RPE对于静止的T细胞则不具有显著诱导凋亡的作用。 结论 RPE细胞具有诱导入侵淋巴细胞凋亡的能力。这种现象作为免疫反应的限制机制,在眼后节免疫赦免的维持和保护眼免受免疫性炎症反应中可能具有重要的意义。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 241-244)