重组工业红色糖多孢菌优化红霉素发酵液组分

本文对代谢工程改造红色糖多孢菌ZL1004进行了摇瓶发酵试验,摇瓶发酵结束时重组菌红霉素生物效价与工业生产菌HL3168相比提高20%.红霉素A组分比例由84%提高到94%,红霉素A浓度3.98mg/ml,相比出发菌3.25mg/ml提高22%,重组菌中红霉素B、C与出发菌相比分别减少了51%和58%,实现了红霉素组分的优化.对重组菌摇瓶发酵过程生理代谢进行了初步的研究,表明重组菌生理代谢特性与原出发菌没有明显差异.对重组菌发酵过程中红霉素组分的变化规律进行分析,发现红霉素A、B、C组分的变化规律与eryK和eryG基因转录水平能较好地对应.     

红色糖多孢菌变温发酵生产红霉素的研究

考察了不同温度(29~34℃)对红色糖多孢菌(Saccharopolyspora     

vgb在红色糖多孢菌表达及生物活性的研究

利用基因工程技术对红色糖多孢菌进行改造，提高红霉素产率。用PCR技术克隆vgb，采用电穿孔法与红色糖多孢发酵菌染色体整合，鉴定采用Western blot与Southern blotting分析。VHb活性分析采用一氧化碳（CO）差示光谱法，红霉素效价测定采用管碟法。结果克隆了含vgb的红色糖多孢菌表达质粒（pBlueV），筛选了重组红色糖多孢菌株。与原始菌株比较，重组菌株细胞发酵密度分别为1．37与2．82，红霉素效价分别为3．8与5．1，相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29％。重组红色糖多孢发酵菌提高了红霉素产率，对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。     

用遗传工程法改良红霉素工业生产菌—红色糖多孢菌

红霉素是一种由发酵法生产的高效抗生素,全世界年生产能力为几千吨.虽然长期采用传统的诱变和筛选方法改良菌种,但它的最终发酵效价仍只达到其他次级代谢产物如青霉素的1/10～1/5.由此可见,传统的菌种改良方法已基本无效,必须用新的方法如遗传工程方法来进一步提高红霉素效价.然而,任何新方法都必须考虑形成菌丝球的微生物在粘稠、丰富的复     

柔红霉素的发酵研究

利用TLC、HPLC技术鉴定了柔红霉素产生菌SIPl 1482发酵过程中间产物ε—紫红霉酮、副产物13—双氢柔红霉素、13—双氢柔红霉酮,柔红霉酮、7—脱氧—13—双氢柔红霉酮和7—脱氧柔红霉酮等组份的变化。研究了外源添加试验,发酵条件包括发酵培养pH、温度及通气等条件对柔红霉素生物合成的影响,对副产物及中间体ε—紫红霉酮的转化。玉米粉—麸皮培养基能提高柔红霉素发酵效价,且降低发酵过程中副产物的生成。 在高氏一号合成培养基上不产柔红霉素的突变株SIPI 1482 NS-4通过加入玉米粉或玉米粉酸解液、或经纯化的酸解液组份1-B,能够使其恢复产生柔红霉素。在柔红霉素生产菌株SIPI1482和SIPIPF-25原来的玉米粉—麸皮培养基中添加一定浓度的玉米粉酸解液能够提高柔红霉素发酵效价10％和30％以上。     

红霉素生产及其有效组分转化的优化

以红霉素生产菌红色链霉菌HB为研究对象．根据红霉素生物合成机理，以促进甲基化转化和强化基础代谢为主要手段，在利用摇瓶和50L罐发酵生产红霉素的过程中，在大约127h的时候，向发酵液中流加ATP、L—Met、MgSO4和柠檬酸，采用高效液相色谱仪(HPLC)对最终发酵液进行检测，红霉素的有效组分A的相对百分含量由原来的73％提高到88％以上。对最终发酵液进行生物测定，其生物效价亦得到明显提高。实现了红霉素发酵生产的优化。     

柔红霉素产生菌SIPI89068的选育及发酵

柔红霉素(Daunorubicin)是一种有效的抗肿瘤药物,由它半合成而制备的阿霉素(Adriamycin)是当前首选抗肿瘤药物之一。我院经过几年的生产工艺和劳动保护研究,已将天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubioluszhengdingsis nov .sp.)SIPI1482于浙江海门药厂投入生产。陈代杰等亦作了它的发酵研究报道。但该菌株效价不高,作者以SIPI1482菌株为出发菌,采用传统的物理化学方法处理及柔红霉素耐药处理,选育出一株遗传性能稳定、耐柔红霉素浓度高的新菌株SIPI89068,用于生产上发酵效价高3～4倍。     

红霉素发酵液中污染细菌的分离与鉴定及其对红霉素发酵的影响

作者从红霉素发酵污染液中分离出了４５株污染细菌，对其进行了分类鉴定，其中有３９株属于芽孢杆菌属的８个种，有５株属于微球菌属，１株为无芽孢的杆菌。利用芽孢杆菌属８个种的污染细菌进行了人为模拟污染的红霉素发酵试验，其结果表明：其中凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌等５种芽孢杆菌对红霉素发酵有显著影响；其危害极大。短芽孢杆菌对红霉素发酵影响不大，而巨大芽孢杆菌和短小孢杆     

红霉素发酵培养基优化研究

对红霉素发酵培养基进行了优化，选用A粉和B粉代替原工艺中的淀粉及部分葡萄糖和豆饼粉。采用正交试验设计方法。确定最佳发酵培养基配方，并考察了中间补料方案。经10吨发酵罐连续8批验证，平均发酵效价提高6．11％，产品质量全部合格。原材料消耗成本可降低20％以上。     

添加Triton-X100及氯化胆碱对红霉素组分的影响

以红霉素生产菌红色链霉菌HD为研究对象,根据红霉素生物合成机理,以促进羟基化和甲基化为主要手段,在利用摇瓶生产红霉素的过程中,96h添加Triton-X100,可使最终发酵液的EM B组分百分含量降低7.1%.但EM C与对照相比增加.120h添加甲基化试剂氯化胆碱0.8g/l,可使最终发酵液的EM C组分百分含量降低6.4%,但EM B有所积累.继而添加Triton-X100的同时加入甲基化试剂氯化胆碱,发现EM B、EM C分别降低6.4%、8.9%,红霉素有效组分EM A比对照提高13.2%     

供氧对红霉素基因工程菌ZL1004发酵液组分的影响

本文研究了供氧条件对红霉素基因工程菌ZL1004发酵液组分的影响。摇瓶条件下考察了不同形式的摇床和摇瓶装液量对发酵液组分的影响,发现供氧能力好的双层敞开旋转摇床有利于组分改善,发酵终点时发酵液中有效组分A为93．93％,副产物B为4．59％,C为1．48％;500ml摇瓶装液量最少时（35ml）发酵液组分最好（A组分为92．13％,B组分为1．73％,C组分为6．14％）。进一步在50L发酵罐中的研究表明,高溶氧（全程溶氧高于40％）时B组分含量一直为0％,与低溶氧（全程溶氧低于40％）相比,发酵液中A组分提高13．51％,C组分降低71．3％。研究结果说明对于红霉素基因工程菌ZL1004,发酵过程较好的供氧条件是提高发酵液有效组分的重要条件。     

产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G^-突变体的构建

糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3"-O-甲基转移酶(EryG),失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成,积累其中间产物红霉素C。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版,用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bp DNA片段(ΔG),其中去除了EryG上S-腺苷甲硫氨酸结合区域对应的290bp DNA片段。将该片段克隆于质粒pWHM3,构建了同源重组质粒pWHMΔG。PEG介导原生质体转化法将pWHMΔG转入糖多孢红霉菌A226中,通过染色体同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体,此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿,糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G 可以恢复红霉素A的合成能力。     

工业羽毛蛋白胨对红霉素基因工程菌ZL1004发酵过程的影响

本文在50L发酵罐上研究了工业羽毛蛋白胨对红霉素基因工程菌ZL 1004发酵过程的影响,结果表明发酵培养基中加入较多的羽毛蛋白胨不利于红霉素的合成,而加入适量的羽毛蛋白胨可有效提升整个发酵过程的摄氧率(OUR)水平、促进菌体对碳氮源的利用和红霉素的合成.进一步对培养基进行优化,采用0.6%羽毛蛋白胨、3.3%黄豆饼粉,发酵结束时红霉素效价达12487U/mL,A组分达9774μg/mL,分别比对照高18.21%和19.94%.利用显微图像及形态分析软件对发酵周期内的菌丝形态进行了跟踪定量研究,分析表明培养基中加入适量羽毛蛋白胨可优化菌丝形态,使其朝有利于红霉素合成的方向进行分化.     

超滤去除红霉素发酵液乳化现象的研究

目的开发一种超滤法去除红霉素发酵液处理过程中乳化现象的新工艺。方法采用自制的三种中空纤维超滤膜（UF-1、UF-2和UF-3）对红霉素发酵液去除乳化现象进行了试验。结果在优化的操作条件下，UF-3膜能够去除红霉素发酵液中蛋白质等引起乳化的杂质，超滤膜可以再生使用。结论超滤法可达到去除乳化的目的，同时提高了萃取的收率和质量。     

以脂肪酶活为指标快速筛选红霉素摇瓶发酵培养基

筛选红霉素链霉菌的摇瓶培养基需要将红霉素链霉菌在摇瓶中培养 6 d,然后测定红霉素链霉菌的效价 ,使用该方法需要至少 6 d的时间。而测定红霉素链霉菌在摇瓶中 d1脂肪酶的活力 ,并与对照样品比较 ,则只使用 1d的时间就能够推测红霉素链霉菌在 6 d后的效价 ,使用这一新方法 ,我们快速筛选出红霉素链霉菌 d1的酶活力比对照培养基高的两组新培养基 ,并且确认了新培养基中 6 d后的最高效价为 9313μg/ ml,比对照培养基提高了 78.38%。     

透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响

目的利用已含有血红蛋白基因(vgb)的红色糖多孢基因工程重组菌,探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的影响。方法用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定血红蛋白,用葡萄糖浓度与总蛋白质含量比较原始菌株与重组菌株的差别。结果红色糖多孢基因工程重组菌与原始菌株比较,重组菌株发酵过程葡萄糖浓度的变化出现在第二时段(约38h),原始菌株达到了0.4g/L,而重组菌株只有0.25g/L;第三时段原始菌株出现了游离葡萄糖浓度高峰而重组菌株未出现。在两个菌株中生物物质浓度[以总蛋白质(g/L)表示]存在不同,重组菌株比原始菌株约低27%。红霉素效价,原始菌株和重组菌株分别为3.98和5.15g/L,相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%。结论重组红色糖多孢菌表达了透明颤菌血红蛋白,提高了红霉素产率,对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。     

Synthesis and biological evaluation of new amino acids structurally related to the antitumor agent acivicin

A set of racemic conformationally constrained analogues of the antitumor antibiotic acivicin (+)-1 has been prepared through a strategy based on 1,3-dipolar cycloaddition of bromonitrile oxide to suitable dipolarophiles. The bromo analogue (2) of acivicin was also synthesized and tested as a reference compound, together with its stereoisomer 3. The antitumor properties of novel amino acids 4-7 were evaluated in vitro against human tumor cell lines. Their efficacy to inhibit glutamate synthase (GltS) from Azospirillum brasilense was also assayed. None of the studied compounds, but 2, showed significant activity.