一种大批量制备眼镜蛇毒金属蛋白酶natrahagin的方法

目的　建立从中华眼镜蛇毒 (Najanajaatra)中大批量分离、纯化natrahagin的方法。 方法与结果 10 g眼镜蛇毒经超滤去除小分子组分后 ,再经Heparin -SehparoseCL - 6B亲和层析及SephadexG - 15 0分子筛层析 ,获得 91mgnatrahagin ,产率为0 91% ;SDS -PAGE显示natrahagin呈单一区带 ,相对分子质量约 4710 0 ,并具有水解纤维蛋白原和血小板膜糖蛋白Ib(PlateletmembraneglycoproteinIb ,GPIb)。 结论此实验成功建立的从中华眼镜蛇毒中大批量制备natrahagin的方法具有高效、简便的特点。     

中华眼镜蛇毒F组分对血小板活化时α颗粒膜蛋白的影响

目的：观察中华眼镜蛇毒F组分对血小板α－颗粒膜蛋白表达的影响，确定F组分是否具有抑制血小板活化的功能。方法：实验分成对照组，凝血酶组和各给药组（凝血酶＋F组分），应用酶免疫吸附法（ELISA）测定健康成年人血浆中的α－闰膜蛋白（GMP－140）含量的变化。结果：凝血酶能引起血浆中的GMP－140含量明显升高，中华眼镜蛇毒F组为100、30μg/ml明显降低凝血酶引起的血浆GMP－140含量升高，并呈现一定程度的剂量依赖关系，两组比较P＜0．05），结论：中华眼镜蛇毒F组分能够抑制激动剂引起的血小板活化。     

中华眼镜蛇毒因子与丹参对豚鼠至大鼠异种小肠移植存活作用的比较

目的　探讨中华眼镜蛇毒因子、丹参对异种小肠移植存活的作用。方法　供受体配对随机分为非处理组、中华眼镜蛇毒因子组、丹参组 ,每组 8例。从存活时间、组织病理两方面分析。结果　非处理组移植小肠存活时间为 ( 0 3± 0 1)h ;中华眼镜蛇毒因子将移植小肠存活延长到 ( 65 8± 9 5 )h ,组织病理发现有较多炎性细胞浸润 ;丹参组与非处理组存活时间差异无显著性。结论　中华眼镜蛇毒因子能有效延长异种小肠移植存活 ;丹参对异种小肠移植超急性排斥反应无明显作用。     

中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对人卵巢癌HO-8910细胞的增殖抑制和Fas/FasL表达的影响

目的 探讨中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对人卵巢癌HO-8910细胞株的抑制作用及Fas/FasL表达的影响.方法 用MTT比色法检测不同浓度中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对HO-8910细胞的增殖抑制,RT-PCR和免疫组织化学观察原癌基因Fas/FasL表达的变化.结果 中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对HO-8910细胞增殖抑制作用成剂量依赖性,RT-PCR和免疫组化结果显示,随着中华眼镜蛇毒抗瘤多肽作用剂量的增加,Fas/FasL基因的表达无明显变化.结论 中华眼镜蛇毒抗瘤多肽对人卵巢癌HO-8910细胞系的增殖具有明显的抑制作用,并对原癌基因Fas/FasL的表达无抑制作用.     

中国眼镜蛇毒蛋白酶natrahagin水解血小板膜糖蛋白Ⅰ b和抑制血小板聚集的作用

目的:观察从中国眼镜蛇(Naja naja atra)毒中纯化的蛋白酶natrahagin水解血小板膜糖蛋白Ⅰb(platelet membrane glycoprotein Ⅰb,GPⅠb)和抑制血小板聚集的作用.方法:通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测以及凝胶图像光密度分析系统分析natrahagin对血小板膜糖蛋白的水解作用.比浊法测定血小板聚集率.结果:Natrahagin选择性地水解GP Ⅰb,切除分子量约3.3×104的片段.Natrahagin(0.025～0.1 mg/kg)静脉注射可显著抑制低浓度凝血酶(100 U/L)诱导的兔洗涤血小板聚集,效应呈剂量依赖性.结论:Natrahagin具有水解GPⅠb和抑制后者介导的血小板聚集的作用.     

眼镜蛇伤家兔模型凝血功能动态变化的观察

目的 :探讨眼镜蛇毒中毒模型凝血功能的动态变化。方法 :用中华眼镜蛇毒于家兔制作眼镜蛇伤模型 ,并设蛇伤药酒组和生理盐水组作为对照 ,分别于注蛇毒前 1d ,注蛇毒后 6h、2 4h和 7d从家兔耳缘静脉采抗凝血作凝血指标和血细胞检测。结果 :眼镜蛇毒组PT在注毒后 6h明显缩短 (P <0 .0 1) ,PT、Fbg和PLT在注毒后 2 4h均有显著变化(均为P <0 .0 1)。生理盐水组没有这些变化 ,蛇伤药酒组这些变化亦不明显。结论 :中华眼镜蛇毒在家兔模型中可影响外源凝血系统 ,导致家兔在中毒后数小时至 2 4h产生急性DIC而使血液呈高凝状态。蛇伤药酒可防止急性DIC的发生。     

中华眼镜蛇毒C组分诱导U251细胞凋亡及P53基因表达的实验研究

目的以人神经胶质瘤细胞系U251为实验对象，研究中华眼镜蛇毒c组分诱导细胞凋亡的机制。方法将中华眼镜蛇毒c组分分为1．5ug/mL（A组），3ug/mL（B组），4．5ug／mL（C组），15ug／mL（D组）和30ug／mL（E组）5个浓度组，以顺铂（DDP）40ug／mL为阳性对照组，另设一阴性对照组，观察光镜下细胞的形态变化，采用DNA凝胶电泳检测法，观察FC诱导细胞凋亡的情况；采用SP免疫组化法和R．T—PCR法检查P53基因的表达。结果中华眼镜蛇毒c组分对U251细胞具有诱导凋亡的作用．FC诱导U251细胞凋亡率与药物浓度密切相关（P〈0．01）。使用FC前后，P53表达有显著增高。结论FC有诱导U251细胞凋亡的作用，但其诱导凋亡依赖于P53基因的改变。     

中华眼镜蛇毒活性组分抑血管内皮细胞增殖和黏附实验研究

目的:研究眼镜蛇毒在抗血管生成方面的生物活性。方法:采用Sephadex阳离子交换柱和分子筛分离中华眼镜蛇毒原毒,以MTT法评价和筛选分离各蛋白峰对培养内皮细胞的抑生长活性;MTT快速测定法测定活性峰对内皮细胞与纤维蛋白原(Fbg)、纤连蛋白(Fn)、Matrigel的黏附作用的影响。结果:经两步分离后从中华眼镜蛇毒中获得一可特异性抑制内皮细胞生长的活性蛋白峰,该活性组分可抑制内皮细胞的黏附功能,对细胞黏附Fn、Fbg和Matrigel等3种物质的作用从1.2μg/ml浓度起即有抑制效应(P<0.05),且均呈浓度依赖性;组分对细胞黏附Fbg和Hatrigel的抑制作用较其对Fn的作用强(P<0.05)。结论;眼镜蛇毒中可能含有可抑制血管生成的活性物质,在抗血管生成方面有良好的研究价值。     

中华眼镜蛇毒致局部组织损伤模型血小板参数的变化

目的:探讨中华眼镜蛇毒致局部组织损伤后对凝血系统的影响。方法:用中华眼镜蛇毒制作家兔局部组织损伤模型。于家兔耳缘静脉采血,于血球仪进行血小板计数(BPC)、血小板比积(PCT)、平均血小板体积(MPV)和血小板体积分布宽度(PDW)检测。结果:与注射蛇毒前相比,注毒后家免有DIC及微血栓形成表现,且BPC和PCT显著减少(均为P<0.001),MPV和PDW明显增大(均为P<0.001)。结论:中华眼镜蛇毒在导致家兔局部组织损伤后可产生急性DIC_o血小板参数检测可用来初步判断DIC及血栓形成的发生和发展。     

中华眼镜蛇蛇毒磷脂酶A2的提纯

目的:探索从中华眼镜蛇蛇毒中快速分离提纯磷脂酶A2(PLA2)的方法方法:应用ARG-CY仿生配基,用亲和层析一步法从中华眼镜蛇蛇毒粗毒中纯化PLA2,用SDS-PAGE进行纯度鉴定及相对分子质量测定,并测定其溶血活性.结果:纯化后获得的PLA2电泳图谱呈单一区带,相对分子质量为14 000,活性为182 μmol/(min·mg).产物具有溶血活性.结论:仿生亲和层析法提纯LPA2操作简单,纯度高,为一高效实用的方法.     

眼镜蛇神经毒的分离、纯化及其镇痛作用

中华眼镜蛇粗毒经二次CM-Sephadex C25柱层析分离、纯化获得眼镜蛇神经毒。聚丙烯酰胺圆盘电泳显示一条区带。在小鼠热板模型及大鼠电尾嘶叫模型,眼镜蛇神经毒显示有镇痛作用,并有剂量-效应关系。     

中华眼镜蛇毒组份M抑制血小板聚集作用机制初探

探讨中华眼镜蛇毒组份Ｍ抑制血小板聚集作用机制;方法：运用卵磷脂法、剩余可凝纤维蛋白原法、纤维蛋白平板法等分别测定了中华眼镜蛇毒组份Ｍ中磷脂酶Ａ_２（ＰＬＡ_２）,纤维蛋白原溶解酶及纤维蛋白溶解等与血小板聚集相关的酶活性,并运用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析了组份Ｍ对血小板内细胞骨架蛋白的影响;结果：组份 Ｍ不含 ＰＬＡ_２活性,无纤维蛋白（原）溶解酶活性,亦无ＡＤＰ酶和 ５’－核苷酸酶活性,不影响正常人血浆乳酸脱氢酶的含量,但对ＡＤＰ诱导的血小板细胞内肌动蛋白微丝聚合物的形成有明显抑制作用;结论：中华眼镜蛇毒组份Ｍ对血小板聚集所依赖的血小板内细胞骨架系统的功能有抑制作用。     

中华眼镜蛇毒心脏毒素—13对猪离体冠脉的作用

探讨中华眼镜蛇毒中分离纯化获得的心脏毒素－１３对离体冠脉血管平滑肌的作用和机制。用离子交换和凝胶过滤法从中华眼镜蛇毒中分离纯化出心脏毒素。以不同浓度ＣＴＸ－１３分别作用于猪冠脉环，观察记录其所诱发的血管环收缩。普萘洛尔，哌唑嗪和尼群地平分别与冠脉环预作用５ｍｉｎ，再分别给予不同浓度的ＣＴＸ－３，观察记录其收缩强度的变化。     

中华眼镜蛇蛇毒因子的简易提纯及鉴定

目的 勃勃从中华眼镜蛇（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｏｂｒａ,Ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ）蛇毒中一镒性快速分离提纯具有抗补体活性及溶血生的中华眼镜晕 毒因子（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｏｂｒａ ｖｅｎｏｍ ｒａｃｔｏｒ,ＣＣＶＦ）的方法。方法 用倒流法将粗毒９经ＤＥＡＥ－ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０柱层析分离提纯。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行纯度鉴定及相对分子质量测定,并鉴定其活性与毒性。结果 本法ＣＣＶＦ得率高于２％,     

中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL-7402细胞凋亡及端粒酶活性的影响

目的 :研究中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL 74 0 2细胞凋亡和端粒酶活性的影响 ,以探讨其抗肿瘤的作用机制。方法 :用不同浓度的中华眼镜蛇毒组分C分别处理人肝癌细胞株BEL 74 0 2 ,采用MTT法、流式细胞仪法、TRAP -ELISA、透射电镜等观察其对肝癌细胞的细胞毒、细胞凋亡、细胞周期及端粒酶活性的影响。结果 :中华眼镜蛇毒组分C对人肝癌细胞株BEL 74 0 2有明显的抑制作用 ,且呈时间依赖性及剂量依赖性。用流式细胞仪分析发现中华眼镜蛇毒组分C可诱导BEL 74 0 2肝癌细胞发生凋亡 ,肝癌细胞明显阻滞于G0 /G1 期 ,在G1 峰前出现明显的亚二倍体凋亡峰 ,且其凋亡率随蛇毒浓度的升高而呈上升的趋势。用TRAP ELISA法同步测得蛇毒作用BEL 74 0 2肝癌细胞 8h后的端粒酶活性值明显下降 ,其抑制作用与剂量呈正相关 (r =0 .96 4 ,P <0 0 5 )。在电镜下 ,可观察到肝癌细胞出现明显的凋亡特征性改变 :细胞膜完整、核染色质固缩 ,核碎裂、凋亡小体形成。结论 :中华眼镜蛇毒组分C可显著抑制人肝癌细胞株 (BEL 74 0 2 )的增殖 ,在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时也下调瘤细胞的端粒酶活性 ,这可能是FC抗肿瘤的重要机制之一。     

眼镜蛇毒对大鼠丘脑腹内侧核c-jun表达的影响

目的:探讨眼镜蛇毒对大鼠丘脑腹内侧核(VM)c-jun表达的影响。方法:将18只SD大鼠随机分为正常对照组、生理盐水组、眼镜蛇毒组,每组6只。采用免疫组织化学方法观察VM的c-jun表达。结果:与正常对照组和生理盐水组相比,眼镜蛇毒组大鼠VM的c-jun表达增加(P<0.01)。结论:眼镜蛇毒对大鼠VM的c-jun表达有上调作用。     

眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球瘤内注射对裸鼠人肝癌皮下移植瘤的影响

目的：评价眼镜蛇毒细胞毒素（cytotoxin,CTX）-聚乳酸-羟基乙酸（polylactic-co-glycolic acid,PLGA）微球经皮瘤内注射治疗裸鼠肝癌的安全性和有效性。 方法：采用甲基噻唑基四唑法检测分离纯化得到的眼镜蛇毒CTX体外细胞毒活性,复乳-溶剂挥发法制备眼镜蛇毒CTX-PLGA缓释微球。40只BALB/c裸小鼠皮下接种人肝癌细胞系BEL-7404细胞建立裸鼠皮下移植瘤肝癌模型,分为生理盐水组、空白微球组、游离CTX组和CTX-PLGA微球组。瘤内注射相应药物,治疗后每周用高频超声观察肿瘤内部回声和血流情况;治疗后第26天,剥离肿瘤称取质量并计算抑瘤率;取肿瘤组织和心、肝、肾等重要脏器,观察其病理学改变。 结果： 眼镜蛇毒CTX对体外培养的人肝癌BEL-7404细胞具有较强的毒性作用。眼镜蛇毒CTX-PLGA缓释微球粒径约（34.45±9.85）μm,具有较高的包封率和较好的缓释效果。瘤体内一次性注射眼镜蛇毒CTX-PLGA微球后,肿瘤体积增长缓慢,抑瘤率达52.36%;光学显微镜观察显示肿瘤组织大部分坏死,但心、肝、肾等重要脏器在形态学上无明显改变。 结论：眼镜蛇毒CTX-PLGA微球瘤内注射可抑制裸鼠肝癌的生长,且具有较高的安全性。     

~(125)Ⅰ眼镜蛇毒及抗眼镜蛇毒血清在小白鼠体内分布的比较观察

用氯胺-T法125I标记眼镜蛇毒示踪液及抗眼镜蛇毒血清。小白鼠分二组，用125I-眼镜蛇毒、125I-抗眼镜蛇毒血清分别给小白鼠尾静脉注射，于注射后的不同时间测定血、颈部肌肉、肝、肺、肾、心等脏器放射性分布。结果发现：125I-眼镜蛇毒在肌肉及肝、肺等器官中于注射后2小时过高峰，在肾脏中浓度高，在脑未见放射性分布，抗眼镜蛇毒血清与眼镜蛇毒分布相似但在肌肉及肺脏有更高的分布。证明抗眼镜蛇毒血清能跟踪分布眼镜蛇毒。     

中国眼镜蛇毒蛋白酶（natrahagin）的抗凝作用

目的 观察具有纤维蛋白原水解活性的中国眼镜蛇毒蛋白酶（natrahagin)在动物体内的抗凝作用。方法 将不同浓度的natrahagin分别静脉注射入大鼠体内,观察其在动物体内的抗凝作用并与生理盐水对照。凝血仪上直接测定血浆凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）,双缩脲法测定血浆纤维蛋白质水平。结果 与对照组比较,不同剂量natrahagin静脉注射给药后,大鼠PT、TT和APTT显著延长,效应呈浓度依赖性。剂量为0.1mg/kg.b.w.时,PT、TT和APTT分别为对照组的1.5、1.5和1.9倍;兔血浆纤维蛋白质水平也显著降低,血浆纤维蛋白原水平降至对照组的33.3%。结论 Natrahagin在体内具有抗凝活性。     

小量眼镜蛇毒对大白鼠垂体—甲状腺轴的作用研究

眼镜蛇是我国主要常见毒蛇,眼镜蛇毒中含有心脏毒为主的混合毒,眼镜蛇毒(即神经毒及心脏毒)及其提纯的神经毒早已在国内临床上用于镇痛、治疗风湿关节炎及小儿麻痹症。而眼镜蛇毒及其心脏毒对内分泌的影响,特别是小剂量时对垂体——甲状腺轴的作用国内外研究甚少。Larsenp R等最早报告较大剂量眼镜蛇毒、心脏毒(眼镜蛇A及B)抑制甲状腺切片中碘的积蓄,推测此可能是增加细胞膜对碘离子的通透性的结果。本文主要用安全量(大鼠最大耐受量)的眼镜蛇毒研究其