竞争性定量PCR检测TCRVγI-Jγ基因重排方法的建立及应用

目的为提高急性淋巴细胞白血病（ALL）微小残留检测的临床意义。方法建立竞争性定量聚合酶链反应（PCR）检测TCRVγI－Jγ基因重排技术并定量分析16例ALL病人残留白血病细胞。结果建立定量PCR方法的灵敏度为10-5水平。16例ALL缓解期残留白血病细胞为（427±364）×10-5病人。3例病人可检测出寡／亚克隆重排,白血病细胞定量为117×10-5、196×10-5及211×10-5水平,其中1例寡／亚克隆水平在病程中不断增加并导致3月后复发伴克隆演化。结论所建立定量PCR技术简便、快速、灵敏;定量检测ALL缓解期残留白血病有利于预后预测并可应用于寡／亚克隆的定量检测。     

急性淋巴细胞白血病微量残留病的PCR监测

探讨急性淋巴细胞白血病微量残留病检测的临床意义。方法：应用筑巢式多聚酶链反应对３２例ＡＬＬ进行了Ｔ细胞受体Ｖδ２Ｄδ３基因重排检测。结果 １８例Ｂ系ＡＬＬ中有１５例，４例Ｔ系ＡＬＬ中有１例，存在ＴＣＲＶδ２δ３基因重排。同时对１６例进行３９例次微量残留病动态监测，其中６例ＭＲＤ－ＰＣＲ阴性病人随访５．１７－１６．１７年，无１例复发，１０例ＭＲＤ－ＰＣＲ阳性者，２例分别于阳性后０．２５，１．００年骨     

急性淋巴细胞白血病微量残留病的PCR监测

①目的探讨急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）微量残留病（ＭＲＤ）检测的临床意义。②方法应用筑巢式多聚酶链反应（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）对３２例ＡＬＬ进行Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖδ２Ｄδ３基因重排检测。③结果１８例Ｂ系ＡＬＬ中有１５例（７２．２％）、４例Ｔ系ＡＬＬ中有１例（２５．０％）存在ＴＣＲＶδ２Ｄδ３基因重排。同时对１６例进行３９例次微量残留病动态监测，其中６例ＭＲＤ－ＰＣＲ阴性病人随访５．１７～１６．１７年，无１例复发；１０例ＭＲＤ－ＰＣＲ阳性者，２例分别于阳性后０．２５，１．００年骨髓复发，１例有复发倾向，余７例随访４．３３～６．２５年无复发。④结论ＭＲＤ－ＰＣＲ阴性者预后良好，可望长期生存，治疗时应以ＭＲＤ－ＰＣＲ转阴为停止化疗的可靠指标，对ＭＲＤ－ＰＣＲ阳性者应定期监测ＭＲＤ变化，结合病人情况进行综合评价。     

克隆演化与中枢神经系统白血病复发的关系

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测４５份急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）脑脊液标本ＩｇＨ、ＴＣＲＶγＩ－Ｊγ及ＴＣＲＶδ２－Ｄδ３基因重排，从２２份标本（４８．９％）发现基因重排阳性，而用形态学方法检查，阳性率为２４．４％（１１／４５）；２２例阳性病人中的２例（９．１％）脑脊液白血病细胞基因重排类型同骨髓标本不一致，此两例均为中枢神经系统白血病（ＣＮＳＬ）复发。上述结果表明，应用ＰＣＲ技术检测ＡＬＬ脑脊液标本重排基因有助于隐匿ＣＮＳＬ诊断；克隆演化现象可能是某些单独ＣＮＳＬ复发的主要原因     

系列PCR方法检测淋巴细胞白血病克隆性基因重排的选择应用

以１次、半巢式及多重ＰＣＲ方法扩增５８例淋巴细胞白血病ＩｇＨ及ＴＣＲＶγＩ－Ｊγ－克隆性基因重排，结果显示：多重ＰＣＲ和Ｉ次ＰＣＲ的敏感度为１０－１０＾５水平；半巢式ＰＣＲ敏感度可达１０＾－５－１０＾－６水平。ＩｇＨ和ＴＣＲＶγＩ－Ｊγ重排阳性率为６７．２％和６２．０％；半巢式ＰＣＲ检测ＩｇＨ重排阳性率为７０．７％。上述结果表明，多重ＰＣＲ可同时检测两对目的基因，适于初治病例检测，而地缓解病例的检     

宫颈非典型增生组织中HPV16—DNA的定量PCR检测

（１）目的建立定量聚合酶链技术（ＰＣＲ）方法，检测宫颈组织中乳头瘤病毒１６型ＨＰＶ１６的基因含量。（２）方法通过重叠延伸ＰＣＲ构建一含ＥｃｏＲＩ酶切位点的内参照模板，用竞争性ＰＣＲ（ＣＰＣＲ）检测６例ＨＰＶ１６阳性宫颈非典型增生组织标本中ＨＰＶ１６Ｅ６，基因的拷贝数。结果６例阳性标本ＨＰＶ１６Ｅ６基因的拷贝数为每毫克ＤＮＡ中含１．９９×１０＾５～２．５０×１０＾７。（４）结论用ＣＰＣＲ检测宫颈组织     

PCR检测急性淋巴细胞白血病T细胞抗原受体γ基因重排

应用多聚酶链反应技术体外扩增２０例初治或复发的急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）Ｔ细胞抗原受体，（ＴＣＲγ）基因重排，结果显示：１５例病人出现约４００ｂｐ的扩增产物，阳性检出率为７５％（１５／２０），产物电泳带位置略有差异提示其重排亚型的多样性。标准人急性Ｔ淋巴细胞白血病细胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ细胞携带ＴＣＲγ基因重排，为阳性对照；而正常骨用及Ｒａｊｉ细胞检测阴性，为阴性对照。用系列稀释法证明本实验敏感性在１０－５水平以上。我们还探讨了该法在急性淋巴细胞白血病基因诊断、微量残留白血病细胞的监测及自体骨髓移植物体外净化效果的评价上的应用价值。该法不需寡核苷酸探针杂交、无需对扩增产物进行测序、且费时短、检出率高，提示有重要的临床意义。     

筑巢式PCR等多项指标对小儿急性白血病微量残留病的监测

①目的　探讨采用筑巢式聚合酶链反应（Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ）等多项指标监测小儿急性白血病（ＡＬ）微量残留病（ＭＲＤ）的临床意义。②方法　对１５２ 例ＡＬ在形态学、免疫学和细胞遗传学（ＭＩＣ）分型诊断的基础上,结合Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ,姐妹染色单体交换（ＳＣＥ）、染色体核型分析方法进行ＭＲＤ监测。③结果　对５８ 例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）进行了Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖδ２Ｄδ３ 基因重排监测,其中８３％ 的Ｂ－ＡＬＬ和２５％ 的Ｔ－ＡＬＬ具有此基因重排,检测灵敏度为１０－ ５～１０－ ６ ．对４４ 例ＡＬＬ进行了ＭＲＤ动态监测,结果显示化疗期间ＰＣＲ由阴性转为阳性或持续阳性者,易引起骨髓复发、死亡。ＰＣＲ转阴时间有明显个体差异性。持续完全缓解３ 年以上的ＡＬＬ病儿ＰＣＲ持续阴性可作为停药治疗的可靠指标。对７６ 例ＡＬ进行了ＳＣＥ动态监测,结果表明ＳＣＥ频率变化与疾病的严重程度呈平行关系。对６１ 例ＡＬ进行了染色体核型动态监测,结果表明初发ＡＬ染色体核型正常者亦有ＤＮＡ 严重损伤。④结论　在ＭＩＣ分型诊断的基础上,采用Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ,ＳＣＥ,染色体核型分析等多项指标进行ＡＬ的ＭＲＤ动态监测、综合分析评价,对指导治疗、预测复发及判断     

系列PCR方法检测淋巴细胞白血病克隆性基因重排的选择应用

以１次、半巢式及多重ＰＣＲ方法扩增５８例淋巴细胞白血病ＩｇＨ及ＴＣＲＶγＩ－Ｊγ克隆性基因重排。结果显示：多重ＰＣＲ和１次ＰＣＲ的敏感度为１０￣（－４）～１０￣（－５）水平；半巢式ＰＣＲ敏感度可达１０￣（－５）～１０￣（－６）水平。ＩｇＨ和ＴＣＲＶγＩ－Ｊγ重排阳性率为６７．２％和６２．０％；半巢式ＰＣＲ检测ＩｇＨ重排阳性率为７０．７％。上述结果表明：多重ＰＣＲ可同时检测两对目的基因，适于初治病例检测，而对缓解病例的检测则需采用敏感度较高的半巢式ＰＣＲ方法。     

急性白血病钙素基因甲基化的PCR检测

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术检测了１０例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）和２２例急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）降钙素（ＣＴ）基因的甲基化程度。结果表明,７例ＡＬＬ与１６例ＡＭＬ的ＣＴ基因都发生了高度甲基化。临床完全缓解的３例ＡＭＬ和２例ＡＬＬ中有１例ＡＬＬ为阳性,另有１例阴性的ＡＭＬ于１个月后转为阳性,随后出现临床复发。提示急性白血病ＣＴ基因高度甲基化的ＰＣＲ检测,对ＡＬＬ与ＡＭＬ微小残留病有很重要的诊断价值,特别为缺乏恒定肿瘤细胞标志的ＡＭＬ提供了一个新的分子基因标志。     

ALL病人P16基因的失活与mRNA表达的关系

目的：探讨ＡＬＬ和各亚型中Ｐ１６基因失活和纯合缺失的发生率及ｍＲＮＡ表达。方法：对４０例ＡＬＬ（Ｂ－ＡＬＬ２８例,Ｔ－ＡＬＬ７例,前Ｂ－ＡＬＬ５例）和１５例对照组骨髓标本,采用ＰＣＲ法检测Ｐ１６基因的纯合缺失,ＲＥＰ法检测Ｐ１６基因的高度甲基化,ＲＴ－Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ法检测其ｍＲＮＡ的表达。结果：ＡＬＬ Ｐ１６基因高度甲基化;Ｂ－ＡＬＬ中高度甲基化多于纯合缺失。５例Ｐ１６基因高度甲基化尚有ｍＲＮＡ     

IgH超基因家族及其相关基因在急性淋巴细胞白血病微小残留病检测中的应用

探讨免疫球蛋白超基因家族及其相关基因在急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）微小残留病（ＭＲＤ）检测中的应用。方法应用免疫学和聚合酶链反应技术。对１５例ＡＬＬ进行免疫表型测定。结果发现其中１１例为Ｂ－ＡＬＬ，３例为Ｔ－ＡＬＬ。ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ分析发现，１１例Ｂ－ＡＬＬ均有ＩｇＨ基因的重排，且有ＩｇＨ基因重排的病例均能用ＩｇＨ基因ＣＤＲ３区及Ｊ区引物得到聚合酶链反应扩增条带。对其中３例Ｂ－ＡＬＬ的ＩｇＨ基因Ｖ－Ｄ－Ｊ结合部区域进行了顺序分析，并合成了２个针对ＩｇＨＶ－Ｄ－Ｊ结合部的寡核苷酸作为探针用来检测ＭＲＤ，显示其灵敏度为１０－４。另外还对１例Ｔ－ＡＬＬ病例同时进行了ＴＣＲγ基因和ＳＩＬ－ＴＡＬ－１融合基因在ＭＲＤ检测中的比较研究，显示二者具有相同的ＭＲＤ阳性检出率，但后者的敏感度更高。结论ＩｇＨ基因重排及其ＴＣＲ基因重排、肿瘤融合基因等均可作为ＡＬＬ患者ＭＲＤ检测的特异性标记     

CD-10的B-ALL和NHL以及CLL免疫表型检测结果分析

目的 比较急性Ｂ淋巴细胞性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）,非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）和慢性淋巴细胞性白血病（ＣＬＬ）免疫表型表达的区别。方法 采用ＡＢＣ－ＡＰ法结合多种Ｂ淋巴细胞相关单克隆抗体,对７８例初发Ｂ－ＡＬＬ（均为ＣＤ＾－１０的病例）、２１例初发ＮＨＬ和２５例初发ＣＬＬ患者进行免疫表型检测。结果 ＣＤ＾－１０的Ｂ－ＡＬＬ患者的白血病细胞以ＣＤ１９和ＨＬＡ－ＤＲ呈高阳性率表达;ＮＨＬ患者的肿瘤细胞以ＣＤ     

急性淋巴细胞白血病中T细胞受体δ基因Vδ2－Dδ3及Dδ2－Dδ3重排结合部顺序的研究

为了探讨中国人Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）δ基因的Ｖ－Ｄ－Ｊ结合部顺序（Ｎ顺序）的组成，及其在急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）患者中的重组规律，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对４６例ＡＬＬ标本进行了ＴＣＲδ基因重排的研究，发现１６例患者出现Ｔ细胞受体δ基因不完全重排，其中１３例为Ｖδ２－（Ｄ）－Ｄδ３重排，３例为Ｖδ２－（Ｄ）－Ｄδ３合并Ｄδ２－Ｄδ３重排。进而应用ＤＮＡ直接测序技术，对这１６例ＡＬＬ标本ＴＣＲδ基因重排结合部进行了分析，证实由于Ｖδ２或Ｄδ２的３＇端和Ｄδ３的５＇端碱基缺失、部分Ｄδ１或Ｄδ２顺序存在、Ｎ顺序的插入以及未发生缺失的Ｖδ２，Ｄδ２或Ｄδ３编码顺序端Ｐ核昔酸的非随机插入，使得每例患者的结合部顺序均存在高度个体特异性。此外，对Ｎ顺序碱基成份的分析表明，其脱氧鸟嘌呤和脱氧胞嘧啶含量大于７０％，而脱氧腺嘌呤和脱氧胸腺嘧啶小于３０％，说明碱基插入并非完全随机。本文结果提示ＴＣＲδ基因重排是淋巴细胞发育中的一个早期事件，其结合部顺序的测定，可作为检测ＡＬＬ患者微小残留病变的特异性克隆标志。     

PCR扩增IgH和TCR_β基因重排在检测淋巴细胞白血病微小残留病中的应用

利用ＩｇＨ和ＴＣＲ＿β克隆性基因重排原理，用多聚酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ．ＰＣＲ）技术检测小儿急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）骨髓和外周血共１３例。结果：ＡＬＬ初治的２例患儿ＰＣＲ检测全部呈现阳性特异性单带。ＡＬＬ完全缓解（ＣＲ）的１１例患儿中阳性７例，阴性４例，其中２例骨髓移植（ＢＭＴ）患儿移植前ＰＣＲ阳性，移植后转为阴性。１例自体骨髓移植（ａｕｔｏ－ＢＭＴ）患儿于移植后２个月时ＰＣＲ检测又重新出现阳性，但临床无复发现象。４例对照者ＰＣＲ均为阴性。结果表明ＰＣＲ技术具有简便、快速、敏感、特异性强等优点，在检测微小残留（ＭＲＤ）中具有广阔前景。     

应用PCR技术检测急性淋巴细胞白血病T细胞受体γ基因重排

目的寻找可作为急性淋巴细胞白血病恶性克隆的基因标记。方法应用ＰＣＲ技术扩增Ｔ细胞受体γ链基因重排，选用四种限制性核酸内切酶消化扩增产物。结果初诊或复发１０例急性淋巴细胞白血病病人中，有５例出现清晰扩增带，约４００ｂｐ，扩增物经四种限制性核酸内切酶消化后形成的限制性核酸内切酶图谱各具特色；５例处于缓解期的急性淋巴细胞白血病病人，有４例被检出清晰扩增带。结论应用ＰＣＲ扩术扩增Ｔ细胞受体γ链基因重排，能用于检测急性淋巴细胞白血病微小残留病，如果结合限制性核酸内切酶图谱分析，则能用于研究白血病细胞的克隆演化     

急性白血病人P_(16)基因结构的研究

为了解急性白血病中Ｐ１６基因突变的情况，应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术检测了３１例急性髓细胞性白血病人（ＡＭＬ）和１４例急性淋巴细胞性白血病人（ＡＬＬ）Ｐ１６基因结构。结果：３１例ＡＭＬ中有７例存在突变，突变率２２．６％，１４例ＡＬＬ中有２例突变，突变率为１４．４％，治疗达到缓解病人Ｐ１６基因突变消失，恶化病例突变出现，提示Ｐ１６基因的突变在ＡＭＬ和ＡＬＬ的发生、发展中起一定作用。     

白血病中P16基因突变的检测

用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）、ＤＮＡ直接测序和多重ＰＣＲ法，检测了１８例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ），１例Ｋ５６２细胞株，９例急性粒细胞性白血病（ＡＭＬ），６例急性淋巴细胞性白血病（ＡＬＬ），２例多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者外周血／培养细胞ＤＮＡ中Ｐ１６基因的点突变和基因缺失。用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ共筛查出５例ＣＭＬ中Ｐ１６基因的异常，突变率为２７．８％（５／１８），对其中１例外显子２异常者经测序证实为第１５１密码子ＣＣＣ→ＣＧＣ的转换，导致Ｐｒｏ→Ａｒｇ的错义突变；并检出１例ＭＭ中Ｐ１６基因外显子３的异常；受检的ＡＬＬ，ＡＭＬ，Ｋ５６２细胞株中，未检出突变。各病例中均未检出Ｐ１６基因的缺失。本文探讨了白血病中Ｐ１６基因突变的意义。     

成人急性淋巴细胞白血病分子生物学改变与临床治疗及预后关系的初步研究

应用多聚酶链反应技术检测了１４例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）患者的ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因、ＴＣＲγ基因重排及ＩｇＨ基因重排，结果发现，ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因阳性５例，阳性率３５．７％，其中４例为Ｂ－ＡＬＬ，１例ＴＣＲγ及ＩｇＨ基因重排均阴性。ｂｃｒ／ａｂｌ（＋）患者与ｂｃｒ／ａｂｌ（－）患者在临床表现方面无显著性差异，但ｂｃｒ／ａｂｌ（＋）患者治疗效果比ｂｃｒ／ａｂｌ（－）患者差。     

急性白血病复发时克隆演化的研究

为研究克隆演化在急性白血病复发发病机制中作用，应用聚合酶锭反应（ＰＣＲ）联合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测７５例及其中３６例复发急性非淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ）ＩｇＨ重排基因，ＰＣＲ检测８１便及其中３５例复发急性淋巴细胞病（ＡＬＬ）ＩｇＨ、ＴＣＲＶｘ２－Ｊｘ、ＴＣＲＶδ－Ｄδ３重排基因及ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ，配合形态学和免疫学检查发现８例ＡＬＬ（２２．９％）和４例（１１．１％）ＡＮＬＬ复发时形态学，免