人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库     

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研究人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞,提取总ＲＮＡ逆转录后,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ特异性引物扩增。结果 克隆和表达了８株人源抗甲型肝炎病毒抗体Ｆａｂ段基因,经ＥＬＩＳＡ检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ段抗体。结论 该８株人源抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,选其中的２株做体外中和实验,证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

噬菌体呈现抗体库的构建及抗Fas—Fab抗体的研究

目的构建噬菌体抗体库,获得具有功能的抗Fas-Fab噬菌体抗体。方法以Fas重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠。取其脾细胞提取mRNA,采用RT-PCR方法扩增抗体基因,构建重链和κ链基因库,用重组Fas抗原对所构建的抗体库进行4轮筛选,并以ELISA法鉴定其功能。结果获得抗体重链Fd基因和κ链基因长度约700bp。构建的重链Fd基因为3.5×106的抗体重链基因库。构建的重链和κ链基因库的容量均为3.1×106。经VCSM13感染得到噬菌体的滴度为8.9×1016cFu/L的噬菌体抗体库,含有抗体重链和κ链基因的噬菌体占27％。用重组人Fas抗原进行4轮筛选,得到100％的富集,说明Fas重组抗原富集了抗Fas-Fab噬菌体抗体,经ELISA检测均有抗Fas抗体的特异性。结论制备的可溶性抗Fas-Fab抗体具有抗Fas抗体的特异性,为进一步的研究奠定了基础。     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的:构建人天然Fab段噬菌体抗体库,为人源抗体的制备建立技术平台。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,构建噬菌体抗体库,酶切鉴定有无插入片段并测序分析,用IL-2和地高辛进行富集筛选。结果:最终构建的抗体库库容约为8.4×107,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率是70%,DNA测序分析证实抗体重链属IgG亚类,轻链为λ链。用IL-2和地高辛进行三轮筛选,抗体库均得到了不同程度的富集。结论:成功构建了一个天然的人源化噬菌体抗体库,可用于下一步胰淀素人源化抗体的筛选、纯化和表达。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac蛋白单链抗体

目的:从Tomlinson J噬菌体抗体库中筛选人源化抗Cry1Ac蛋白单链抗体(scFv)并进行鉴定.方法:以Cry1Ac蛋白为抗原包被固相,经4轮"吸附-洗脱-扩增"过程后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对其进行基因序列测定.结果:经过4轮筛选,获得了2株能与Cry1Ac蛋白特异性结合的阳性克隆.结论:利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Cry1Ac蛋白scFv,为Cry1Ac毒素蛋白检测提供了条件.     

从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体,对其抗原结合活性的序列进行分析鉴定。结果;经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

将抗体库所获抗-HBs Fab转换为全长人IgG

目的 将大肠杆菌表达的抗－乙肝表面抗原（ＨＢｓ）人Ｆａｂ转换为真核表达的全长人ＩｇＧ１。方法 用重叠ＰＣＲ法将人工合成的人Ｖｋ前导序列拼到抗－ＨＢｓ的ＶＨ和ＶＫ上,构建人ＩｇＧ１真核表达载体。转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结果 用轻链和重链同时表达的单一载体在ＣＨＯ细胞中获得了抗－ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结论 通过噬菌体抗体库所获Ｆａｂ段可经拼接人     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADA ScFv）,为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体。方法：①以改良法制备Dig-BSA偶联物②以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选,通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性,通过ELIS竞争抑制实验分析其特异性,对阳性克隆的DNA进行测序分析。结果：①在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集;②获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆;③阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群。结论：利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADA ScFv,经过一步分析及抗体工程改造后,有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体。     

人源化抗HCMV噬菌体ScFv库的构建

目的　构建抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库 ,以探索制备巨细胞病毒感染治疗用单克隆抗体。方法　巨细胞病毒感染患者外周血淋巴细胞为材料 ,建立噬菌体单链抗体库 ,并对其进行鉴定。结果　构建完成了一个滴度为 6 .5×10 6 CFU mL的抗体库。结论　源化抗巨细胞病毒噬菌体单链抗体库的建立为下一步抗体的筛选、表达奠定了基础     

从人源天然ScFv噬菌体抗体库中筛选A型肉毒毒素特异性抗体

目的:以不同形式的A型肉毒毒素或类毒素为靶抗原,对已经构建的人源天然ScFv噬菌体抗体库进行特异性抗体的筛选及特异性抗体的序列分析。方法:制备3种不同形式的A型肉毒毒素或类毒素,抗原梯度包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行筛选,经过3轮"吸附-洗脱-扩增"淘选富集,制备单克隆噬菌体抗体颗粒,用ELISA验证ScFv的结合活性,并对获得的阳性克隆进行基因序列分析。结果:用3种不同形式的抗原进行筛选,各挑180个克隆进行单克隆噬菌体抗体颗粒的ELISA分析,其中以A型肉毒类毒素筛选获得52个阳性克隆,阳性率为28.8%,随机挑取12个克隆测序,结果表明7个ScFv序列正确且各不相同;以纯化后A型肉毒神经毒素(BONT/A)筛选获得18个阳性克隆,阳性率为10%,测序结果表明获得的14个ScFv序列正确且各不不同;以原核表达的A型肉毒毒素重链C段筛选获得122个阳性克隆,阳性率为68%,随机挑取55个克隆测序,结果表明30个正确的ScFv序列中14个系列完全相同,16个序列各不相同;结论:应用固相筛选的方法,从人源天然ScFv噬菌体抗体库可以获得肉毒毒素特异性抗体,为抗肉毒毒素马血清的更新替换提供了研究依据与应用基础。     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

应用噬菌体肽文库筛选McAb F3特异性结合肽

目的：应用噬菌体展示肽文库筛选可与抗汉坦病毒囊膜蛋白单抗F3特异性结合的配体肽。方法：采用protein-A亲和层析纯化的F3单抗为筛选配基，对噬菌体展示的随机12肽文库进行生物亲和淘洗，夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果：通过3轮生物淘洗，能被抗体捕获的噬菌体克隆为91．7％（11／12）；ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽能与F3单抗特异性结合；序列分析表明7个阳性克隆氨基酸序列相同，均为－MHGPTKNQMWHT，同源性分析显示该序列与HTNV／SEOV M蛋白G2区第750－759位氨基酸有较高的同源性，结论：获得了具有良好结合活性的模拟表位肽，为基于表位水平的HFRSV（肾病综合征出血热病毒）特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要依据。     

应用噬菌体随机肽库技术筛选SARS-CoV S蛋白模拟表位

目的筛选SARS病毒(Severe acutere spiratorysyndromeas sociated coronavirus,SARSCoV)结构蛋白S(Spike)特异性的模拟表位,为抗SARS疫苗研究提供基础。方法以抗SARS病毒S蛋白的单克隆抗体为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附洗脱扩增”的筛选,随机挑选30个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附(ELISA)法和交叉反应实验鉴定阳性克隆,再进行DNA序列分析和竞争抑制结合实验,以确定SARS病毒S蛋白的模拟表位。结果经噬菌体富集后,从随机挑选的30个克隆中得到了29个编码8种12肽的阳性克隆,8条肽与S蛋白的320～350氨基酸序列有较高同源性,确定YF、W、E和K氨基酸残基为模拟表位的骨架结构。结论用噬菌体12肽库成功筛选到了SARS病毒S蛋白的模拟表位,为基于S蛋白的肽疫苗研制提供了基础。     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。