DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联

[目的]为了研究DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联,我们分析了缺失型DMD病人的连接片段的断裂点并研究了DMD基因内含子结构与内含子不稳定性之间是否存在相关.[方法]多重引物PCR法鉴定缺失型DMD患者,分别克隆46和51号外显子缺失后形成的连接片段,测定连接片段的序列;并用计算机分析DMD基因可以获得的全部内含子的结构特点.[结果]对46号和51号外显子缺失后形成的连接片段的序列分析表明,5'和3'端的断裂点均位于重复顺序,断裂点附近无小插入、小缺失或点突变.对连接片段的二级结构分析表明,所有的断裂点均位于单链发夹结构的非匹配区.对DMD基因可以获得的全部内含子的结构分析表明,在DMD基因全长内含子中重复序列占大约34.8%.大量重复序列的存在是许多内含子的重要结构特征.[结论]重复序列是DMD基因多数内含子的关键结构,与内含子的不稳定性相关.在原有DNA序列的基础上,单链发夹结构的形成增加了DMD基因的不稳定性,形成了基因断裂的基础,单链发夹结构的形成导致两个断裂点的靠近,最终导致了基因缺失.     

DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联

【目的】为了研究DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联，我们分析了缺失型DMD病人的连接片段的断裂点并研究了DMD基因内含子结构与内含子不稳定性之间是否存在相关。【方法】多重引物PCR法鉴定缺失型DMD患者，分别克隆46和51号外显子缺失后形成的连接片段，测定连接片段的序列；并用计算机分析DMD基因可以获得的全部内含子的结构特点。【结果】对46号和51号外显子缺失后形成的连接片段的序列分析表明，5’和3’端的断裂点均位于重复顺序，断裂点附近无小插入、小缺失或点突变。对连接片段的二级结构分析表明，所有的断裂点均位于单链发夹结构的非匹配区。对DMD基因可以获得的全部内含子的结构分析表明，在DMD基因全长内含子中重复序列占大约34．8％。大量重复序列的存在是许多内含子的重要结构特征。【结论】重复序列是DMD基因多数内含子的关键结构，与内含子的不稳定性相关。在原有DNA序列的基础上，单链发夹结构的形成增加了DMD基因的不稳定性，形成了基因断裂的基础，单链发夹结构的形成导致两个断裂点的靠近，最终导致了基因缺失。     

Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的 通过对抗肌萎缩蛋白（dystrophin）因3～5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法 先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3～5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果 获得2113bp PCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5’端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3’端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复（GGCTTATATTTAA）连接断裂点两端。结论 推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。     

Duchenne型肌营养不良症患者32例基因缺失分析及产前诊断

目的:探讨Duchenne型肌营养不良症(DMD)基因缺失突变的类型,建立基因诊断技术平台.方法:应用寡核苷酸引物扩增DMD基因18个外显子区域,对27例家系32例DMD患者进行基因缺失分析,用4对二核苷酸重复序列多态引物对DMD家系进行扩增片段长度多态性连锁分析.并对10例先证者有DMD基因缺失的家系进行产前诊断.结果:27例DMD家系中19例(70.4%)有至少1个外显子缺失,且缺失热点区域集中在外显子12、13、45、47、48、49和50,所有携带者至少有1个或1个以上多态性位点为杂合态,缺失诊断结合多态分析进行诊断,10例男性胎儿中2例具有外显子缺失.结论:基因缺失诊断结合连锁分析可快速、准确地进行DMD的产前诊断.     

基因缺失与DMD的关系研究及携带者筛查

目的:为了解国内Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者基因缺失的分布特点;探讨STR位点多态性对DMD基凶携带者的连锁分析.方法:根据DMD基因中外显子缺失的多发位点,在内标引物参照下,建立一个多重PCR体系对40例DMD患者进行多位点检测,同时用4个STR多态位点进行连锁分析.结果:40例患者中有32例为基因缺失.缺失率为80％.在本研究中,所选外显子45、48、51缺失率较高,分别占检出人数的56％、56％、16％.通过STR多态位点连锁分析检测出6名DMD患者母亲均为携带者.结论:本实验所选外显子对确定中国地区DMD患者的基因突变位点具有重要的临床参考价值,应用PCR-STR技术进行连锁分析可对DMD携带者进行筛查.     

应用10对引物多重PCR方法检测DMD基因缺失

目的 建立适合于Duchenne型进行性肌营养不良(DMD)临床基因诊断的10对引物多重PCR方法,并探讨其临床应用价值.方法 抽提55例DMD患者及正常对照者外周血DNA,选取肌营养不良蛋白基因的10对外显子引物,应用多重PCR反应方法,同时扩增10个特异性片段,扩增产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 55例DMD患者中,28例(50.9%)存在外显子缺失.27例(49.1%)未检测到缺失;25例缺失片段集中于第45～53外显子,3例缺失片段集中于第12-19外显子.第50外显子缺失频率最高;其次为外显子45、47、51、52,再次之为外显子12、53.结论 DMD基因缺失片段主要分布于第45-53、12-19外显子2个缺失热点区域.该方法具有临床应用价值,是检测DMD基因缺失的首选方法.     

产前基因检测杜氏肌营养不良

目的 产前基因检测杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)家系胎儿.方法 利用性别决定基因SRY引物PCR和羊水细胞培养染色体核型分析确定3例DMD家系胎儿性别,采用mPCR技术对3个DMD家系成员外周血及胎儿羊水和脐静脉血进行DMD基因内18个外显子位点扩增,STR-PCR结合聚丙稀酰胺凝胶技术对DMD基因3'端及基因内的44、45、49、50内含子的(CA)n短串联重复序列引物进行扩增,进行家系连锁分析和产前基因诊断.结果 共检出4例胎儿,其中2例单胎和1例双胎之甲胎为男性,之乙胎为女性.3个DMD家系2个检出为非缺失型,1个为缺失型.4例胎儿均继承了与同代先证者相同的母源致病单体型,除1例双胎之女胎为风险基因携带者外,其余3例男胎均为DMD风险胎儿,3例患儿母亲均为杂合型.结论 STR多态连锁分析不仅适用于常见缺失突变检测未发现缺失的DMD患者,同样适用于缺失型DMD患者的产前基因检测.     

60例DMD／BMD患者用抗肌营养不良cDNA探针的基因分析

使用14kb的抗肌营养不良cDNA,在60例不相关的肌营养不良DMD/BMD(杜氏/贝氏肌营养不良)患者中检测到31例基因片段缺失及1例基因部分区域重复。缺失的主热点区位于基因中心区域,这一区域涉及cDNA次级片段5b-7检测范围3’区的4个外显子及C8检测范围的全部外显子。末观察到缺失的位置或长度与临床症状的严重性之间存在明确关系。     

常染色体显性遗传帕金森病家系1例基因缺失序列分析

目的:分析常染色体显性遗传帕金森病家系的基因缺失.方法:根据Parkin基因外显子和内含子DNA序列合成14对引物,以人基因组DNA为模板,巢式PCR扩增,扩增产物纯化后直接测序.通过与正常人相应的DNA序列比较,检测1例常染色体显性遗传帕金森病家系基因缺失位点.结果:该家系检测到染色体6q25.2-q27Parkin基因外显子3中110 bp的缺失,第4和第5外显子检测到部分碱基的变异.结论:Parkin基因外显子3缺失的检出对常染色体显性遗传帕金森病的早期诊断和基因治疗具有指导意义.     

两步多重PCR技术快速检测杜氏肌营养不良基因缺失

杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是男性最常见的X连锁致死性遗传病之一,临床上较轻型的BMD(Becker muscular dystrophy)是其等位基因型。DMD和BMD的发病率分别为30/10万和3/10万。三分之一的新生男婴患者由新生突变所引起。DMD基因定位于Xp~(23),是已知的最大基因,约有2300kb。由于该基因太大,用传统的限制性内切酶片段长度多态性(RFLPs)进行家系连锁分析,或应用cDNA探针进行Southern印迹杂交检测基因缺失均较繁琐费时,在临床上不易推广。PCR技术自1985年问世以来,已广泛应用于遗传病的基因诊断。Chamberlain等在DMD基因的两个缺失热点内,以9个易缺失外显子的旁侧顺序为引物进行多重PCR扩增,快速检测出DMD基因的绝大部分缺失型。本实验参照其多重PCR合成9对引物,并选用缺失率较高的5对引物和另外4对引物进行两步多重PCR,对中国人群中的DMD患者进行筛查,获得满意结果。     

Gene deletion analysis of a Chinese boy with Xp21 contiguous gene deletion syndrome

Xp21 contiguous gene deletion syndrome, sometimes called complex glycerol kinase deficiency, is associated with variable size Xp21 deletions that usually include the glycerol kinase gene and span multiple Xp21 disease gene loci in the region. The order of the potentially affected loci are as follows: Xpter-Aland Island eye disease ( AIED ), congenital adrenal hypoplasia ( AHC ),     

线粒体DNA缺失与心肌病

研究线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）缺失与心肌病发生的关系。方法用大片段ＤＮＡ体外扩增技术，扩增心肌病患者心肌、骨骼肌血液标本的ｍｔＤＮＡ，并与冠心病患者、正常人的标本对照。结果在１例肥厚型心肌病（ＨＣＭ）患者心肌中发现ｍｔＤＮＡ缺失，缺失片段长度为４００个碱基对（４００ｂｐ），心肌中缺失ｍｔＤＮＡ的相对含量超过５０％。结论ｍｔＤＮＡ缺失可能是心肌病发病的一个重要病因。     

Gene deletion of X-linked ichthyosis]

The characterization of steroid sulfatase (STS) gene mutation from seven X-linked ichthyotic patients was performed by multiple polymerase chain reaction (MPCR) which amplified two specific regions at the 5' and 3' end of STS gene. The results indicated that five out seven patients were found to have entire STS gene deletion. Two other cases and five patients' mothers showed two amplification fragments. So did two cases of dominant ichthyosis vulgaris. It was further ascertained that entire gene deletion is the main mutation of STS locus in Chinese population. MPCR is a rapid and simple method for gene diagnosis of X-linked ichthyosis.     

clpP基因缺陷对肺炎链球菌毒力表达降低的研究

目的 探索clpP基因缺陷对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力的影响.方法 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法 失活clpP基因,用PCR、Western blot鉴定缺陷菌株,通过RT-PCR分析白溶素(major autoly-sin A,lytA)、表面黏附A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)和胆碱结合蛋白A(cholinebinding protein A,cbpA)的表达,并通过动物实验观察clpP基因缺陷株毒力改变情况.结果 RT-PCR显示clpP缺陷株的4个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异(P<0.05);小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间为22 h,而缺陷株半数致死时间为8 d,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌株(P<0.05).结论 clpP基因缺陷使S.pn多种毒力因子表达减弱,毒力降低.     

Partial deletion 9p syndrome in Malaysian children

We report the first two Malaysian children with partial deletion 9p syndrome, a well delineated but rare clinical entity. Both patients had trigonocephaly, arching eyebrows, anteverted nares, long philtrum, abnormal ear lobules, congenital heart lesions and digital anomalies. In addition, the first patient had underdeveloped female genitalia and anterior anus. The second patient had hypocalcaemia and high arched palate and was initially diagnosed with DiGeorge syndrome. Chromosomal analysis revealed a partial deletion at the short arm of chromosome 9. Karyotyping should be performed in patients with craniostenosis and multiple abnormalities as an early syndromic diagnosis confers prognostic, counselling and management implications.     

PCR扩增法检测DMD患者的基因缺失

目的 探讨Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）患者基因缺失的突变特点并进行基因诊断。方法 用一对特异引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因ｅｘｏｎ４８附近的ＤＮＡ片段。结果 在２１例ＤＭＤ患者中，检出１６例患者的ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因在该处存在缺失突变。ｅｘｏｎ４８是ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因发生缺失突变“热点”区的观点。结论 该方法可用于ＤＭＤ的遗传咨询、基因诊断及产前基     

Cochlear mitochondrial DNA3867bp deletion in aged mice

目的　探讨老龄小鼠耳蜗mtDNA缺失情况 ,明确老龄小鼠耳蜗mtDNA缺失的位置。方法　应用套式PCR和DNA测序技术对不同月龄 12 9/CD1杂交小鼠耳蜗 31个 (2月龄 7个 ,7- 10月龄 16个 ,17- 19月龄 8个 )进行定性及定量检测。结果　 1 小鼠耳蜗mtDNA386 7bp大片缺失 ,缺失发生在nt910 3-nt12 970之间 ,其两侧nt90 89-nt910 3和nt12 95 6-nt12 970为核苷酸完全相同的 15bp重复序列。 2 随着小鼠月龄的增加 ,耳蜗mtDNA386 7bp缺失发生率有明显增加的趋势 ,2月龄小鼠未发现缺失 (0 /7) ;17- 19月龄小鼠 (7/8)明显高于 7- 10月龄小鼠 (4/16 ) (P <0 0 1)。 3 缺失mtDNA/总mtDNA比值 ,17- 19月龄小鼠明显高于 7- 10月龄小鼠 (P <0 0 1)。结论　老龄小鼠耳蜗出现mtDNA386 7bp大片缺失可能与老年性聋发生相关     

人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因敲除促进小鼠动脉血管钙化的机制研究

目的 研究人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)在小鼠动脉血管钙化形成过程中的作用.方法 ①构建血管特异性PTEN敲除小鼠(PTEN△/△),对照组小鼠为PTENf/f;②免疫组化检测ApoE全敲除小鼠钙化血管中PTEN的表达水平;③体外通过钙化培养基诱导血管钙化;④Alizarin Red染色和Von Kossa染色评估PTEN敲除后小鼠血管钙化程度;⑤实时荧光定量PCR检测血管钙化标志物Runx2、骨钙蛋白和BMP2的表达水平.结果 ①与普通饮食组相比,高脂饮食诱导的ApoE基因敲除小鼠血管钙化明显,而钙化后的血管中PTEN的表达水平显著下降(P＜0.01);②经体外诱导后,PTEN△/△小鼠血管明显钙化,而PTENf/f小鼠血管几乎无钙化;③与PTENf/f组相比,PTENⅣ△小鼠血管钙化标志物Runx2、骨钙蛋白和BMP2的表达均明显升高(P＜0.05).结论 血管特异性PTEN基因敲除促进小鼠血管钙化的形成.     

人ETV4蛋白截短体的构建与其在结直肠中的功能分析

目的：研究ETV4转录因子各保守结构在转录调节结直肠癌细胞增殖以及迁移过程中的作用以及机制。方法：利用PCR介导的克隆技术,在前期构建的ETV4载体基础上,构建含不同ETV4结构域的蛋白截短体ETV4（1~339）（包含酸性结构域）与ETV4（340~484）（含DNA结合结构域）。利用CCK-8试剂盒检测不同截短体对结直肠癌细胞增殖的影响,利用细胞划痕实验检测不同截短体对结直肠癌细胞迁移的影响。进一步利用定量PCR技术检测表达不同截短体过表达细胞中上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志物的变化情况。结果：CCK-8实验结果显示截短体ETV4（1~339）无明显促进结直肠癌细胞增殖的作用,而截短体ETV4（340~484）和全长蛋白都可明显促进结直肠癌细胞增殖（P<0.01）。细胞划痕实验显示截短体ETV4（340~484）和全长蛋白可促进结直肠癌细胞迁移而截短体ETV4（1~339）却无此作用。进一步对EMT标志物检测发现ETV4（340~484）和全长蛋白可导致E-cadherin表达下降,N-cadherin、Vimentin和Twist表达上调（P<0.01）,而ETV4（1~339）中EMT标志物无明显变化。结论：本实验首次证明,ETV4促进结直肠癌细胞增殖和迁移主要是通过ETV4中的ETS结构域起作用,并且可能通过介导EMT标志物来调控结直肠癌细胞转移。