乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗对猕猴的体液免疫原性观察

核酸疫苗 ( DNA疫苗 )能够有效地刺激机体的特异性免疫应答已经成为共识。鉴于乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag)是机体细胞毒性 T细胞 ( CTL )识别和攻击 HBV感染肝细胞的主要靶抗原 ,我们构建了 HBc Ag核酸疫苗 ,并已观察到该核酸疫苗经不同接种方法免疫不同品系小鼠均可引起特异性体液免疫和细胞免疫应答。为进一步观察该核酸疫苗对非人灵长类动物的免疫原性 ,我们用该核酸疫苗接种猕猴 ,发现猕猴对该核酸疫苗具有良好的抗体应答反应。1　材料和方法( 1 ) HBc Ag核酸疫苗的制备　 HBc Ag核酸疫苗 ( p JW430 3/HBc)及对照质粒 ( …     

猕猴对乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的特异性细胞免疫应答

目的 观察乙型肝炎病毒核心抗原核心酸疫苗即ＨＢｃＡｇ核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）免疫猕猴的特异性细胞免疫应答。方法 猕猴分别在第０、２、４、６个月肌肉注射法接种核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）或对照质粒（ｐＪＷ３０３）；ＥＬＩＳＡ法检测猕猴外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），经特异性抗原（ＨＢｃＡｇ）刺激后，培养上清中人白细胞介素－４（ＩＬ－４）和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）以及猕猴血清中抗－ＨＢｃｌ     

乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性观察

目的 :观察乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag) DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性。方法 :肌内注射法接种 HBc AgDNA疫苗 ;EL ISA法检测小鼠和猕猴血清抗 - HBc Ig G终点滴度和 Ig G亚类水平 ;51铬释放法测定小鼠脾细胞 HBc Ag特异性细胞毒性T细胞 ( CTL )活性 ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 ( PBMC)培养上清中 IFN -γ及 IL - 4水平 ;3H - Td R掺入法检测猕猴PBMC HBc Ag特异性增殖反应。结果 :小鼠和猕猴经接种该 DNA疫苗后均产生高滴度抗 - HBc抗体 (分别达 1∶ 3 2 80 5 0和1∶ 10 93 5 0 ) ;小鼠抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2 a为主 ,猕猴抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2占优势 ( Ig G1/Ig G2 <1) ;小鼠的 HBc Ag特异性CTL杀伤活性达 5 0 %以上 ;猕猴 PBMC培养上清中 ,IFN-γ水平与 IL - 4相比占明显优势 ( 15 .63 pg/ml vs <3 .13 pg/ml) ,猕猴PBMC抗原特异性增殖反应阳性 (刺激指数 =2 .12～ 3 .83 )。结论 :HBc Ag DNA疫苗对小鼠和猕猴均具有良好的体液免疫和细胞免疫原性。     

乙型肝炎病毒核心抗原基因疫苗对小鼠的体液和细胞免疫原性观察

目的 观察不同品系小鼠（Ｈ－２＾ｂ,Ｈ－２＾ｄ）经乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）基因疫苗免疫后特异性辅助性Ｔ细胞反应类型和特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。方法 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法鉴定该基因疫苗的体外表达产物;基因枪法和肌内注射法接种该基因疫苗;间接ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）水平;＾５１铬释放法测定小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。结果     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。     

乙型肝炎病毒全抗原亚型疫苗的免疫原性实验

本文报告了一种乙型肝炎全抗原亚型疫菌,该疫苗不去除Dane颗粒,它是用HBsAg和HBeAg阳性携带者血清。并且为adr。adw及ayw三种亚型。分别经聚乙二醇沉淀和超速离心纯化。产物在电镜下除HBsag外可见到Dane颗粒,然后除菌、甲醛灭活。稀释并加入氢氧化铝佐剂制成的,每种亚型疫苗分别多部位(脚掌、腹服沟、颌下等),皮下接种豚鼠每次总量1ml,三次免疫后。全部动物均产生抗—HBs。抗—HBc每批动物仅个别阳性。抗—HBe全部阴性,但必须考虑豚鼠对HBV三个抗原系统免疫应答灵敏性远较人类和黑猩猩差,作为全抗原乙肝疫苗研制、本文进行了初步尝试。     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

我国乙型肝炎病毒核心抗原基因突变的发现

乙型肝炎病毒的持续感染导致慢性肝炎、肝硬化甚至发展为肝癌。过去研究发现我国慢性乙型肝炎患者肝内有病毒DNA整合者仅为10％左右,故整合并非致乙肝病毒持续的主要因素。通过对比各组乙型肝炎患者肝内及血内病毒DNA的阳性率,发现在慢性活动性肝炎及肝硬化患者中表现为肝内病毒DNA阳性率显著高于血清病毒DNA阳性率,提示乙型肝炎病毒可能在肝内存在缺陷型而致病毒不能包装、成熟而释放入血。分别用编码乙肝病毒表面抗原的S基因及核心抗原的C基因与慢性乙肝患者的肝活检组织DNA杂交,发现有个别患者的C基因缺失而S基因呈整合状态。用蛋白印迹转移技术还发现肝癌组织内有分子量异常的类似核心抗原蛋白。     

乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的为研究乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)20/21bp部分缺失(nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果变异株分泌到细胞外的HBsAg、HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论HBVCP20/21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。     

乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的：为研究乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）20／21bp部分缺失（nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法：利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果：变异株分泌到细胞外的HBsAg,HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论：HBV CP20／21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。     

乙型肝炎病毒抗原抗体的检测

病毒性肝炎的流行是当前全世界极为关注的公共卫生问题。近年来该病的诊断、治疗、预防已有较大进展,有关乙型肝炎病毒抗原抗体系的免疫学诊断,目前也已有十分灵敏和特异的方法,大大提高了临床的诊断水平。为了满足广大基层读者的要求,就大家比较关心的一些问题,本刊编辑部特地请传染科陈钟英教授和有关专家进行一次笔谈,但愿这些看法和体会对读者在诊治和预防方面能有所帮助。     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的:用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达进行分析与探讨。方法:利用ELISA方法,使得HBcAg基因片段扩增,构建含有HBcAg基因的表达质料与克隆质粒,以IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)plys中蛋白的重组表达,并且,采用酶联免疫测定方法检测重组蛋白。结果:在大肠杆菌中,重组HBcAg得到表达,经过酶联免疫测定方法检测,在预期位置显示有特异性条带。结论:采用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达,成功构建了HBcAg原核表达系统,并获取重组HBcAg,有效地推进了重组蛋白的相关功能研究,具有很高的研究推广价值。     

中草药对乙型肝炎病毒抗原抑制试验的实验观察(附4541例人员乙型肝炎病毒抗原阳性检出率的调查)

在有关文献的启发下,我们对乙型肝炎病毒抗原 HBsAg(以前称 HAA)进行了中草药的药物抑制试验,寻找在实验研究方面给临床提供一些对乙型肝炎防治工作的参考。现将我们对 HBsAg 阳性检出率的调查以及中草药对 HBsAg 抑制试验的实验观察的初步结果简述如下:一、对4541例人员 HBsAg 阳性检出率的检查几年起,我们无选择的对本院工作人员、局直属单位的工人、干部,学校、幼儿园的学生和儿童以及输血者进行 HBsAg 阳性检出率的调查,结果如下表:     

乙型肝炎病毒核心抗原肝细胞结合新蛋白的功能研究

目的为探讨乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)在乙型肝炎发病机制中的作用,筛选、克隆出人肝细胞中与HBcAg相互作用的未知蛋白基因C12并进一步对其功能作初步研究.方法应用酵母双杂交系统-3筛选到与肝细胞蛋白结合的蛋白编码基因C12,克隆该基因并用再次用重回交实验证实作用可靠后,将基因与荧光蛋白基因融合表达,分析该基因表达产物在哺乳动物细胞中的定位;用MTT代谢实验了解C12表达对哺乳动物细胞生长代谢的影响作用;酵母双杂交实验寻找肝细胞中与之相互作用的蛋白;基因芯片技术了解C12基因表达对其他基因表达的影响.结果成功地筛选并克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白C12基因,经回交实验再次证实C12基因的表达产物C12蛋白与HBcAg确切的结合作用.该基因与荧光蛋白基因融合表达转染293细胞、L02细胞后48 h细胞呈现均匀分布的强绿色荧光信号,提示C12蛋白可能主要定位在细胞质内;通过在Bel7402、L02细胞系中进行MTT检测,发现C12在上述细胞中表达没有对细胞的生长繁殖产生明显影响;用酵母双杂交系统-3筛选出肝细胞中与C12蛋白相互作用的蛋白基因16种;基因芯片技术在1 152个基因中筛选出17个差异表达的基因.结论 C12蛋白主要定位在细胞质内,对哺乳动物细胞生长繁殖无明显影响,能与肝细胞中多种蛋白结合,在细胞内的过表达引起的生物过程涉及许多不同基因表达的变化.     

黄芪提取物对乙型肝炎病毒抗原表达的抑制作用

目的探讨黄芪提取物对乙型肝炎病毒（HBV）病毒抗原表达的抑制作用。方法用MTT法测定黄芪提取液在不同浓度下对HepG2．2．15细胞的细胞毒性,ELISA法检测黄芪提取物对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg颗粒的影响。结果黄芪提取物对HepG2．2．15细胞4d和8d的半数毒性浓度（TC50）分别为88．914μg／ml和85．209μg／ml（P〉0．05）,对HBeAg4d和8d的治疗指数（TI）分别为1．018和1．342（P〉0．05）,对HBsAg4d和8d的治疗指数分别为0．065和0．089（P〉0．05）。结论黄芪提取物抑制HepG2．2．15细胞分泌HBeAg的作用为低效有毒,黄芪提取物对HBsAg抗原分泌无明显抑制作用。     

miR-122对乙型肝炎病毒抗原表达的影响

目的:探讨miR-122对乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg表达的影响.方法:设计合成2务miR-122的反义寡核苷酸(anti-miR-122,LNA-antimiR-122)、hsa-miR-122以及阴性对照anti-GFP,脂质体介导转染HepG2.2.15细胞.取细胞转染24h、48 h后的培养液,时间分辨荧光免疫法检测anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组、hsa-miR-122组以及anti-GFP组HBsAg和HBeAg的表达,定量PCR检测各组HBV DNA的表达.转染48 h后,提取细胞内总RNA,Taqman技术实时荧光定量PCR检测各组miR-122的表达.结果:①转染48 h后anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组miR-122表达明显受抑制,低于阴性对照组(P ＜0.001).hsa-miR-122组miR-122水平较阴性对照组升高(P＜0.001).②hsa-miR-122组HBsAg、HBeAg表达均低于阴性对照组(P ＜0.001);anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组HBsAg、HBeAg表达均高于阴性对照组(P ＜0.001).③转染24 h与48 h后各组HBV DNA表达与阴性对照组比较无统计学意义(P＞0.05).结论:miR-122可调节乙型肝炎病毒抗原表达.     

乙型肝炎病毒(HBV)前S1抗原与乙型肝炎病毒

目的:探讨乙型肝炎病毒前S1抗原,研究其临床意义,基本共识乙型肝炎病毒前S1出现在急性HBV感染的最早期,前S1抗原的转阴是病毒清除的最早迹象,前S1病毒持续存在者将发展至慢性乙型肝炎,前S1病毒与HBV-DNA、HBeAg高度相关,与肝内HBV-DNA、HBeAg检出高度相关.     

乙型肝炎病毒特异性抗原抗体的临床意义

在肝病当中，尤其在急、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌患者中，有时可在血清中发现某种特异的抗原和抗体。这些抗原和抗体的发现，不仅对于肝病的特异性做出早期诊断、甚至对许多毫无临床症状、体征和肝功能异常表现的“正常人”，即肝炎病毒的携带者的发现和诊断具有重要意义，而且对于上述各类肝癌的病毒推断、传染力的大小，预后的好坏以及病变实质的转变，均有临床意义。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.