低氧条件下M2型巨噬细胞外泌体对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响及机制

目的 探究低氧条件下M2型巨噬细胞外泌体对卵巢癌细胞生物学功能的影响及机制。方法 人单核细胞系THP1诱导分化为M2型巨噬细胞，提取并且鉴定正常培养条件下M2型巨噬细胞外泌体(N-M2 exo)以及缺氧培养条件下M2型巨噬细胞外泌体(H-M2 exo)。SKOV-3细胞分为PBS组、N-M2 exo组和H-M2 exo组，分别与PBS、10μg/ml的N-M2 exo和H-M2 exo共孵育48 h, CCK-8法检测各组细胞增殖能力，Transwell小室检测各组细胞迁移和侵袭能力，流式细胞术检测各组细胞凋亡水平，Western blot检测各组细胞MEK和ERK的磷酸化水平。结果 相比于PBS组，N-M2 exo组和H-M2 exo组SKOV-3细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均显著增加(P<0.05),细胞凋亡水平显著下降(P<0.001),MEK和ERK的磷酸化水平显著增加(P<0.001)。相比于N-M2 exo组，H-M2 exo组SKOV-3细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均显著增加(P<0.05),细胞凋亡水平显著下降(P<0.001),M...     

肿瘤相关巨噬细胞外泌体调控肝癌细胞生长、转移及衰老的功能

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞外泌体对肝癌细胞生长、转移及衰老的影响及机制。 方法 提取并鉴定M0和M2型巨噬细胞外泌体（M0 exo和M2 exo）,肝癌细胞HepG2和SMMC-7721细胞分为PBS组、M0 exo组和M2 exo组,CCK8法检测各组肝癌细胞的增殖能力,Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力,SA-β-Gal染色检测细胞衰老,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测各组细胞P16、P21、HMGA1的表达水平。〖HTH〗结果 M0 exo和M2 exo均符合外泌体的结构和生物学特征,相较于PBS组,M2 exo组HepG2和SMMC-7721细胞增殖能力显著增加,迁移和侵袭能力显著增加,细胞周期G1期降低,SA-β-Cal染色阳性率显著降低,衰老相关蛋白P16、P21、HMGA1表达显著下调（均P＜0.05）,而M0 exo组上述指标与PBS组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论 M2型巨噬细胞外泌体可诱导肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖、迁移和侵袭能力的增加,其机制可能为抑制细胞衰老     

两种不同细胞培养方法对破骨细胞分化及Notch2基因表达的影响

目的:探讨两种不同培养方法对体外破骨细胞分化的影响,分析破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平的差异,为进一步破骨细胞功能实验奠定基础。方法:单独培养:从4周龄的小鼠腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和破骨细胞生成因子(RANKL)诱导大鼠骨髓细胞形成破骨细胞;共培养:从4周龄的小鼠大腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,与原代成骨细胞共培养,VitD3和前列腺素E2(PGE2)诱导。对获得的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和细胞计数,并测定破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平。结果:两种培养方法获得的破骨细胞均为TRAP染色阳性的多核巨细胞;共培养方法得到的破骨细胞数目为(240±36)个/孔,而单独培养法为(160±23)个/孔。共培养组Notch2分子mRNA表达水平为4.1±1.2,单独培养组为2.4±0.6,共培养组高于单独培养组(P<0.05),共培养组Notch2蛋白表达水平亦高于单独培养组。结论:与通过RANKL和M-CSF诱导破骨细胞分化的培养方法相比,利用成骨细胞和破骨前体共培养可诱导出更多的破骨细胞和高水平的Notch2表达。培养方法影响破骨细胞的数量和Notch2基因的表达水平。     

血浆外泌体介导脓毒症ARDS炎性因子的机制研究

目的：初步探讨血浆来源的外泌体对脓毒症急性呼吸窘迫综合征(ARDS)炎性因子分泌的影响。方法：采用盲肠结扎穿刺（CLP）方式对小鼠造模,将36只C57BL/6J小鼠随机分为3组：对照组（n=12）,CLP组（n=12）和CLP+外泌体抑制剂GW4869组[n=12;在术前1 h给予外泌体抑制剂GW4869(2.5μg/g)]。造模24 h后,取小鼠的肺组织进行HE染色观察急性肺损伤的程度;ELISA检测小鼠血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。qRT-PCR检测小鼠肺组织炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平。将健康人和脓毒症ARDS患者血浆来源的外泌体与THP-1细胞共培养48 h后,ELISA和qRT-PCR检测炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达变化。结果：在小鼠肺组织中,与对照组相比,CLP组炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平（P<0.05）显著升高。然而CLP术前注射外泌体抑制剂GW4869后,会明显抑制IL-6、IL-1β、TNF-α的表达（P<0.05）。在细胞水平,与对照组和加入健康人血浆外泌体组（H-...     

血管内皮细胞来源外泌体miR-214对H2O2诱导血管内皮细胞损伤的影响

探讨血管内皮细胞来源外泌体miR-214对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,并转染miR-214抑制物（in-miR-214）及其阴性对照（in-miR-NC）,分离并鉴定外泌体,同时检测miR-214表达。再次培养HUVEC,分为正常对照组（Control组）、氧化损伤组（H2O2组）、空白外泌体+氧化损伤组（exo NC+H2O2组）、in-miR-NC外泌体+氧化损伤组（exo in-miR-NC+H2O2组）和in-miR-214外泌体+氧化损伤组（exo in-miR-214+H2O2组）。qRT-PCR检测细胞中miR-214表达水平;MTT和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡;划痕愈合实验检测细胞迁移;Western blot检测细胞增殖、凋亡、迁移相关蛋白水平。结果 成功从HUVEC 细胞中分离出外泌体,且转染in-miR-214可抑制外泌体中miR-214表达（P＜0.05）。H2O2诱导后,HUVEC细胞增殖活力和划痕愈合率降低,凋亡率增高;同时,细胞中miR-214表达水平增高,Cyclin D1、PCNA、Bcl2、MMP2和MMP9蛋白水平降低,Bax蛋白水平增高（P＜0.05）。添加HUVEC外泌体和外泌体来源的in-miR-214可部分削弱H2O2 对HUVEC细胞的损伤,且后者的效果要明显优于前者（P＜0.05）。结论 HUVEC来源外泌体通过低表达miR-214保护HUVEC免受H2O2诱导的细胞损伤     

全反式维甲酸联合粒细胞集落刺激因子对骨髓瘤细胞生长、分化及RARα2表达的影响

目的：观察粒细胞集落刺激因子（G CSF）与全反式维甲酸（ATRA）对骨髓瘤细胞生长、分化及RARα2表达的影响,探讨两药联合用于临床治疗骨髓瘤的可能性。方法：以人骨髓瘤细胞RARα2阳性细胞株（OPM2）和RARα2阴性细胞株（U266）为研究对象,设对照组、G CSF单药组（1000、2000 U/ml）、ATRA单药组（10 μmol/L）及两药联合组共6个平行组。采用MTT法检测细胞活力,倒置显微镜动态观察细胞凋亡过程,Annexin V/PI双染法检测早期凋亡;瑞氏姬母萨染色观察细胞形态学,流式细胞术分析CD49e表达;逆转录PCR检测RARα2 mRNA表达。结果：ATRA可抑制OPM2细胞的生长（P<005）,联合用药组生长抑制率均大于单药组（P<005）;而在U266细胞这种作用不明显（P>005）。瑞氏 姬母萨染色显示在含ATRA的处理组中,OPM2细胞有细胞核缩小、染色质聚集浓缩、核仁数量减少、胞浆量增加并呈深蓝色改变;此类改变在U226细胞不明显。U266、OPM2细胞均弱表达CD49e。在OPM2细胞中,联合用药组较对照组、ATRA单药组RARα2表达均增加（P<005）,对照组与G CSF单药组RARα2表达无明显差别（均P>005）。U226细胞的对照组、G CSF单药组不表达RARα2,ATRA单药组及G CSF+ATRA联合组弱表达RARα2。结论：ATRA对RARα2阳性骨髓瘤细胞有抑制细胞增殖作用;ATRA对RARα2阳性骨髓瘤细胞的分化也有一定促进作用。     

唑来膦酸影响单个核细胞向破骨细胞分化及RANK表达的研究

目的 研究唑来膦酸(zoledronate,ZLN)对破骨细胞分化及相关信号分子组织蛋白酶K (capthsin K)、细胞核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor kappa-B,RANK)表达的影响,初步探讨唑来膦酸对破骨细胞分化的影响和机制。 方法 采用核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)诱导小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7向破骨细胞分化。在诱导开始时即分成2组:G1组为空白对照组,采用50 ng/ml RANKL诱导;G2组为实验组,从诱导开始就加入1×10-6 mol/L唑来膦酸处理,诱导4 d后收获并进行抗酒石酸磷酸酶(TRAP)染色观察、计算破骨细胞数量并检测TRAP酶活性;采用Real-Time PCR和Western Blot分析组织蛋白酶K、RANK的表达水平。 结果 唑来膦酸组生成的TRAP阳性的破骨样细胞较对照组少且核的数目也较少,唑来膦酸组较对照组破骨细胞生成的数目下降[(62.0±10.2)%,P＜0.05];唑来膦酸组TRAP活性较对照组下降[(31.0±4.1)%,P＜0.05];唑来膦酸组的组织蛋白酶K、RANK基因表达较对照组分别下降[(78.0±4.2)%、(49.0±1.9)%,P＜0.05]。 结论 唑来膦酸通过抑制破骨前体细胞RANK的表达来抑制体外破骨细胞分化。      

蛋白酶体抑制剂PS-341诱导骨髓瘤细胞凋亡的 蛋白质组学研究

目的：比较蛋白酶体抑制剂PS-341处理多发性骨髓瘤细胞U266前后蛋白质组的差异,探究PS-341潜在的药物靶点,为多发性骨髓瘤的临床治疗提供理论依据。方法：用蛋白酶体抑制剂PS-341处理骨髓瘤细胞U266,应用双向凝胶电泳技术分离PS-341处理前后的U266细胞的蛋白质,ImageMaster 2D Platinum图像分析软件识别药物处理前后U266细胞的差异表达蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质。Western印迹法检测差异蛋白质BAG-2在药物处理前后U266细胞中的表达水平。结果：建立了PS-341处理前后U266细胞蛋白质的双向凝胶电泳图谱,找到55个差异表达的蛋白质点,鉴定了31个差异表达的蛋白质,有27个蛋白质在PS-341处理后下调。Western 印迹分析证实BAG-2在药物处理前后U266细胞中的表达水平存在差异。结论：处理后下调的一些蛋白可能是蛋白酶体抑制剂PS-341潜在的药物靶标。     

单甲基亚砷酸联合隐丹参酮抑制多发性骨髓瘤U266细胞增殖作用机制的研究

目的研究单甲基亚砷酸(MMAIII)联合隐丹参酮(CPT)对多发性骨髓瘤U266细胞的协同抑制效应,阐明其诱导多发性骨髓瘤凋亡的作用机制。方法多发性骨髓瘤U266细胞用含10%gibco胎牛血清的RPMI1640培养液培养,按隐丹参酮单药组、MMAIII单药组和联合组分别加药处理。cell-counting-kit-8(CCK8)法检测细胞存活率;AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot检测凋亡标记蛋白PARP的总蛋白和剪切表达水平;酶标仪检测酸性鞘磷脂酶活性;免疫荧光技术检测细胞膜神经酰胺和脂筏标记物。结果 CCK8法检测结果显示,隐丹参酮浓度15μM时细胞存活率为(80.9±5.4)%(24h)、(60.0±8.4)%(48h),单甲基亚砷酸浓度1μM时细胞存活率为(82.5±5.8)%(24h)、(67.7%+9.7)%(48h),隐丹参酮(15μM)联合单甲基亚砷酸(1μM)作用U266细胞24h、48h后细胞存活率为(29.1±7.0)%(24h)、(18.0±2.7)%(48h);流式细胞术结果显示,联合用药组细胞凋亡率为(41.7±4.4)%、单甲基亚砷酸组为(10.6±4.0)%、隐丹参酮组为(10.5±3.0)%;Western Blot显示,联合作用组凋亡蛋白PARP剪切活化水平较单甲基亚砷酸单药组及隐丹参酮单药组有显著升高;酸性鞘磷脂酶活性测定结果显示,联合用药组上调多发性骨髓瘤U266细胞酸性鞘磷脂的活性;免疫荧光技术检测结果显示,联合用药后多发性骨髓瘤U266细胞膜上荧光强度增加,加入Filipin后荧光强度较联合用药减少。结论 MMAIII与CPT协同作用能诱导人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡发生,其作用机制主要与促进细胞膜鞘磷脂水解生成神经酰胺、诱导脂筏聚集促进凋亡相关蛋白剪切活化密切相关。     

高浓度葡萄糖对Notch2信号通路及破骨细胞分化的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对RANKL诱导破骨细胞分化及Notch信号通路的影响.方法 高糖(5～40 mmol/L)条件下,RANKL刺激小鼠骨髓源性破骨前体细胞向破骨细胞分化,TRAP染色检测破骨细胞分化情况,实时定量PCR检测Notch信号通路相关基因(Notch1、Notch2、Jagged1)的表达情况.结果 RANKL诱导破骨细胞分化过程中,实验组(20 mmol/L和40 mmol/L葡萄糖)破骨细胞个数分别为(110.3±6.81)和(72.0±8.0); Notch1相对表达量分别为(1.25±0.43)和(1.14±0.45),Notch2相对表达量分别为(1.65±0.23)和(1.1±0.11),Jagged1相对表达量分别为(1.16±0.38)和(1.09±0.23);对照组(20 mmol/L和40 mmol/L甘露醇)破骨细胞个数分别为(152.7±7.0)和(157±12.5),Notch1相对表达量分别为(1.84±0.38)和(1.66±0.40),Notch2相对表达量分别为(2.82±0.28)和(2.42±0.27),Jagged1相对表达量分别为(1.52±0.26)和(1.45±0.34).其中,破骨细胞数量和Notch2基因表达量在实验组与对照组间差异具有显著统计学意义(P＜0.05).结论 高浓度葡萄糖抑制Notch信号及破骨细胞分化,该结果提示Notch2信号可能参与高糖抑制破骨细胞分化过程.     

乳腺癌细胞外泌体对肿瘤相关成纤维细胞激活的诱导作用及机制

目的 探讨乳腺癌细胞外泌体对肿瘤相关成纤维细胞激活的诱导作用及机制。方法 (1)将乳腺上皮细胞MCF10A、乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、PBS分别与成纤维细胞MRC-5共培养;另取上述细胞和PBS,在与MRC-5共培养的同时加入外泌体摄取抑制剂GW4869。检测共培养后MRC-5细胞的迁移能力,细胞中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、 IL-8、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β(TGF-β)、CXC基序趋化因子配体12(CXCL12)、Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)、Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)、Ⅳ型胶原蛋白α1链(COL4A1)的mRNA表达水平。(2)提取MCF10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞的外泌体并鉴定,然后将上述细胞外泌体、PBS分别与MRC-5细胞共培养。检测MRC-5细胞的迁移能力,细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、 TGF-β、 CXCL12、COL1A1、COL3A1、COL4A1的mRNA表达水平,以及细胞中核因子κB(NF-κB)信号通路相关蛋白的表达水平。结果 (1)相较于与PBS或MCF10A细胞共培...     

胃癌外泌体MiR-221靶向PTEN促进肿瘤相关成纤维细胞的形成

目的:探究胃癌外泌体miR-221对肿瘤相关成纤维细胞的影响及机制.方法:提取并鉴定人胃黏膜细胞GES-1、人胃癌MGC-803、MKN45细胞分泌的外泌体(GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo),qRT-PCR检测miR-221在GES-1、MGC-803、MKN45及其外泌体中的表达,将1...     

miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的作用研究

目的研究miR-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其作用机制,方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)+PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)⁺PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)+PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6),TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信号转导通路的转录因子,过表达miR-125a降低了TRAF6的蛋白表达水平,而TRAF6的mRNA水平无明显改变。结论 miR-125a通过作用于新的FRAF6/NFATC1/miR-125a负反馈调控环路在破骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用,调控miR-125a的表达可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

单甲基亚砷酸联合隐丹参酮抑制多发性骨髓瘤U266增殖的作用机制研究

摘要 目的：研究单甲基亚砷酸(MMAIII)联合隐丹参酮(CPT)对多发性骨髓瘤U266的协同抑制效应，阐明其诱导多发性骨髓瘤凋亡的作用机制。方法：cell-counting-kit-8(CCK8)法检测细胞存活率；AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡；Western Blot检测凋亡标记蛋白PARP的总蛋白和剪切表达水平；酶标仪检测酸性鞘磷脂酶活性；免疫荧光技术检测细胞膜神经酰胺和脂筏标记物。结果：CCK8结果显示隐丹参酮浓度为15μM时细胞存活率为80.9%±5.4%(24h)、60%±8.4%(48h)，单甲基亚砷酸浓度为1μM时细胞存活率为82.5%±5.8%(24h)、67.7%+9.7%(48h)，隐丹参酮（15μM）联合单甲基亚砷酸（1μM）作用U266细胞24h、48h后细胞存活率为29.1%±7.0%(24h)、18%±2.7%(48h)；流式细胞术结果显示联合用药组细胞凋亡率为41.7%±4.4%、单甲基亚砷酸组为10.6%±4.0%、隐丹参酮组为10.5%±3.0%；Western Blot显示联合作用组凋亡蛋白PARP剪切活化水平较单甲基亚砷酸单药组及隐丹参酮单药组有显著升高；酸性鞘磷脂酶活性测定结果显示联合用药组上调多发性骨髓瘤U266细胞酸性鞘磷脂的活性；免疫荧光技术检测结果显示联合用药后U266细胞膜上荧光强度增加，加入Filipin后荧光强度较联合用药减少。结论：MMAIII与CPT协同作用能诱导人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡发生，其作用机制主要与促进细胞膜鞘磷脂水解生成神经酰胺、诱导脂筏聚集促进凋亡相关蛋白剪切活化密切相关。     

橄榄苦苷对破骨细胞的分化以及骨吸收功能的影响

目的 探讨橄榄苦苷(oleuropein)对破骨细胞分化成熟以及骨吸收功能的影响及其可能机制.方法 把不同浓度的橄榄苦苷(12.5、25、50 μmol/L)分别加入由核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的体外破骨细胞培养体系中,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resist ant acid phosphatase,TRAP)染色方法观察呈TRAP阳性的多核细胞;RAW264.7细胞也用RANKL诱导,用流式细胞仪分析橄榄苦苷对破骨细胞凋亡的影响;在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察骨吸收陷窝,并用图像分析软件统计其面积.采用Western blot法检测橄榄苦苷对破骨细胞特异性蛋白组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、激活T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATC1)及相关信号通路蛋白表达的影响.结果 TRAP染色结果显示,橄榄苦苷能显著抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成,且呈浓度依赖性(P＜0.05);橄榄苦苷能下调破骨细胞特异性蛋白CTSK的蛋白表达水平(P＜0.05);橄榄苦苷对破骨细胞的凋亡无明显影响(P＞0.05);橄榄苦苷能显著减少骨吸收陷窝的面积(P＜0.05);橄榄苦苷能够下调NFATC1及磷酸化p38(p-p38)的表达(P＜0.05).结论 橄榄苦苷可以抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化以及破骨细胞的骨吸收功能,可能和橄榄苦苷能够下调p38/MAPK信号通路有关.     

HSP90抑制剂对人多发性骨髓瘤细胞增殖及HSP90蛋白表达的影响

目的：探讨HSP90抑制剂17-AAG对人多发性骨髓瘤细胞增殖及HSP90蛋白表达的影响。方法采用MTT法检测HSP90抑制剂对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖能力的影响;采用 Western blot检测不同浓度的 HSP90抑制剂17-AAG (0.001,0.01,0.1,1.0,10.0μmol/L)对人多发性骨髓瘤细胞中HSP90蛋白表达水平的影响。结果 HSP90抑制剂17-AAG对人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞有剂量依赖性的增殖抑制作用(P<0.05),无时间依赖性的增殖抑制作用(P>0.05)。随着药物浓度的增加,HSP90蛋白水平的表达也逐渐下降。结论 HSP90抑制剂能剂量依赖性抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖能力,同时下调人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞中HSP90蛋白水平的表达。     

ABT-737对M2型TAM来源外泌体处理的卵巢癌细胞SKOV3自噬性凋亡与干性特征的影响

目的 探讨Bcl-2小分子抑制剂ABT-737对经肿瘤相关巨噬细胞(TAM)来源外泌体(Exo)处理的卵巢癌细胞自噬性凋亡及干性特征的作用。方法 利用佛波酯(PMA)与重组人白细胞介素-4(IL-4)诱导人外周血单核细胞THP-1为M2型TAM,流式细胞术检测细胞表面巨噬细胞相关标志物表达;差速离心法提取外泌体,透射电镜与纳米粒子追踪技术观察外泌体形态及径粒分布,Western blot检测外泌体标志蛋白表达,Dil结合PKH67染色检测TAM来源外泌体被卵巢癌细胞系SKOV3摄取情况;实验分组为对照组、Exo组、Exo+ABT-737组,采用TAM来源外泌体与ABT-737按照分组处理SKOV3细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,双荧光mRFP-GFP-LC3实验检测细胞自噬水平,Western blot检测细胞自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin-1、p62)与凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3)表达,肿瘤细胞成球实验检测细胞干性,Western blot检测肿瘤干细胞相关蛋白(CD133、OCT4、SOX2)表达。结果 经PMA与IL-4...     

HSP90抑制剂对人多发性骨髓瘤细胞增殖及HSP90蛋白表达的影响

目的 探讨HSP90抑制剂17-AAG对人多发性骨髓瘤细胞增殖及HSP90蛋白表达的影响. 方法 采用MTT法检测HSP90抑制剂对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖能力的影响;采用Western blot检测不同浓度的HSP90抑制剂17-AAG(0.001,0.01,0.1,1.0,10.0 μmol/L)对人多发性骨髓瘤细胞中HSP90蛋白表达水平的影响. 结果 HSP90抑制剂17-AAG对人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞有剂量依赖性的增殖抑制作用(P＜0.05),无时间依赖性的增殖抑制作用(P＞0.05).随着药物浓度的增加,HSP90蛋白水平的表达也逐渐下降. 结论 HSP90抑制剂能剂量依赖性抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖能力,同时下调人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞中HSP90蛋白水平的表达.     

缺氧诱导的外泌体活化自噬促进肝癌进展

目的 探讨缺氧诱导的外泌体对肝癌进展的调节作用及其机制。方法 将Huh7细胞置于0.1%O₂培养箱培养24 h作为缺氧组，另设常氧组，提取外泌体，纳米追踪技术检测外泌体的浓度和粒径大小，免疫印迹检测HSP70、Alix、CD63的表达。将Huh7细胞分为对照组(PBS)、常氧外泌体组(20μg/ml常氧外泌体)、缺氧外泌体组(20μg/ml缺氧外泌体),实时无标记细胞分析仪(real-time cell analysis, RTCA)实验检测细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，免疫印记检测细胞PCNA、cyclin D1、Bax、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Beclin1、LC3、p62的表达，激光共聚焦检测自噬流的改变。Huh7细胞分为对照组(PBS)、缺氧外泌体组(20μg/ml缺氧外泌体)、缺氧外泌体+3-MA组(5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤+1 h后20μg/ml缺氧外泌体),检测细胞增殖、迁移和相关蛋白的表达。结果 与常氧组相比，缺氧组外泌体浓度增加，但外泌体粒径的大小没有明显变化，缺氧组外泌体标记蛋白HSP70、Ali...     

骨髓瘤细胞诱导破骨前体细胞分化的分子机制探讨

目的探讨人骨髓瘤细胞RPMI8226诱导破骨前体细胞分化的分子机制。方法采用RT-PCR和Western blot-ting法检测RPMI8226细胞能表达核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κB Ligand,RANKL)蛋白和RANKL裂解酶(TACE、ADAM19)mRNA表达。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)细胞化学染色鉴定成熟破骨细胞。利用重组人RANKL蛋白(rhRANKL)、条件培养液和人抑制性RANKL单克隆抗体(RANKL mAb)参与培养,诱导RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞。结果 Western blotting法证实RPMI8226细胞表达跨膜型和可溶型RANKL(mRANKL,sRANKL)。RT-PCR法证明RPMI8226细胞表达RANKL、RANKL裂解酶和TRAP mRNA。TRAP染色观察RPMI8226细胞、MG-63细胞条件培养液与rhRANKL均能明显诱导RAW264.7细胞分化为TRAP阳性多核成熟破骨细胞。RT-PCR法证实此3组能刺激RAW264.7细胞上调TRAP mRNA表达。TRAP染色和TRAP mRNA表达中发现RANKL mAb能阻断RPMI8226细胞条件培养液和rhRANKL诱导的破骨前体细胞分化成熟作用。结论骨髓瘤RPMI8226细胞能表达RANKL,其条件培养液可能含sRANKL,能使RAW264.7细胞分化成TRAP阳性多核成熟破骨细胞。