反义转化生长因子β1表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞增殖活性的影响

目的：构建反义TGFβ1基因，探讨阻断肿瘤细胞TGFβ1自分泌环对细胞增殖活性的影响。方法：采用RT-PCR获取人TGFβ1cDNA后，构建反义TGFBl表达载体pcDNA3-TGFβ1(-)。将pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞MG-63，采用流式细胞仪检测阻断TGFβ1自分泌环对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果：pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞后，反义基因转染细胞MG—TGFβ1(-)的G0／G1期细胞从56．2％和60．1％增至71．6％，S期细胞从19．1％和17．8％降至12．9%，细胞增殖活性明显降低。结论：通过阻断TGFβ1自分泌环以降低骨肉瘤细胞表达的TGFβ1，可以明显抑制肿瘤细胞增殖活性。进一步的深入研究，必将为骨肉瘤疗效的提高开辟新的研究方向。     

稳定转导反义增殖细胞核抗原基因对膀胱癌细胞体外增殖活性的调控作用

目的　探讨反义增殖细胞核抗原 (PCNA)基因对膀胱癌细胞增殖活性的影响。方法脂质体介导PCNA反义真核表达载体转染膀胱癌EJ细胞 72h后 ,G41 8筛选 4周获得亚克隆细胞株EJ/AP ,采用SABC免疫组织化学方法和逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)法检测PCNA基因表达 ,噻唑蓝 (MTT)比色分析、3H 胸腺嘧啶核苷 (3H TdR)掺入法、流式细胞仪、克隆形成实验检测癌细胞体外增殖活性。结果　同EJ细胞比较 ,所获亚克隆EJ/AP中PCNA蛋白及mRNA表达完全抑制 ,癌细胞体外增殖活性抑制 49.38% (P <0 .0 5) ,DNA合成速率降低 47.71 % (P <0 .0 1 ) ,细胞周期阻滞于G0 /G1 期 ,克隆形成能力抑制 64 .73 % (P <0 .0 1 )。结论　稳定转染反义PCNA基因能有效抑制膀胱癌细胞体外增殖活性 ,有望成为膀胱癌基因治疗的有效策略     

转化生长因子β1反义RNA对肾小球系膜细胞基质合成及分泌的影响

目的：观察转化生长因子beta1(TGF-β1）反义RNA对系膜细胞基质合成的影响。方法：构建含TGF－β1反义RNA的重组腺病毒，将重组腺病毒转染系膜细胞，用Northern blot检测转染系膜细胞TGF－β1及ColIV mRNA的含量，用免疫组化半定量分析转染的系膜细胞中TGF－β1，纤连蛋白（FN）及胶原（Col)IV蛋白水平，并与无转染的系膜细胞对照组比较其表达的变化。结果：构建了含TGF－β1反义RNA的重组腺病，重组反义TGF－β1腺病毒转染系膜细胞后，与对照组相比，在第24hTGF-β1及Col IV的mRNA无明显抑制，在48hTGF－β1及Col IV mRNA抑制率分别为22．5％，18．2％，72h TGF-β1及Col IV mRNA抑制率分别为29．5％，27．3％，免疫组织化学半定时结果显示；与对照组相比，在48h始转系膜细胞TGF－β1，FN及ColIV蛋白含量开始下降，48h TGF-β1，FN及Col IV蛋白抑制率分别为16．5％，18．2％及14．6％，72h TGF－β1，FN及ColⅣ蛋白抑制率分别为23．5％，27．3％，26．8％。结论：重组反义TGF－β1可抑制系膜细胞合成细胞外基质，在肾小球肾炎及肾小球硬化的研究及治疗中有潜在的应用价值。     

增殖细胞核抗原反义真核表达载体的构建及其在膀胱癌EJ细胞中的表达

目的：寻求肿瘤反义基因治疗的新途径。方法：应用分子克隆技术构建寻殖细胞核抗原（PCNA）基因反义真核表达载体,转染膀胱癌EJ细胞,通过免疫荧光,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）,噻唑蓝（MTT）比色法,克隆形成实验动态检测转染1－7d后癌细胞PCNA基因表达和体外增殖活性。结果：所获反义表达载体pLAPSN转染可使癌细胞PCNA蛋白,mRNA表达水平分别抑制16．74％－84．21％（P＜0．05）,23．27％－86．15％（P＜0．05）,增殖活性抑制27．91％－62．07％（P＜0．01）,克隆形成能力降低50．81％（P＜0．01）。结论：应用反义RNA技术阻断PCNA基因的表达,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性,是膀胱癌基因治疗的合理策略之一。     

反义人端粒酶RNA亚基对胆囊癌端粒酶活性及细胞生长的抑制作用

目的探讨反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据测定的胆囊癌人端粒酶RNA亚基(hTR)基因的序列结果，并根据真核表达载体多克隆酶切位点的物理图谱，体外合成反义RNA及正义RNA的基因序列，并构建入pTriEx-4真核表达载体，酶切鉴定正确后，采用脂质转染法导入胆囊癌细胞。TRAP法检测端粒酶活性。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，电镜观察细胞微观形态变化。结果实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，正义组、转染空载体及单纯脂质体转染的细胞端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显。反义RNA基因作用后，G0／G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低。细胞的分裂、增殖受到明显抑制。反义RNA基因转化后，10d凋亡率为11．10％。13d后凋亡率为29．02％。电镜下可见明显凋亡细胞。结论反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用；并抑制胆囊癌细胞的生长，促进细胞的凋亡；且克服了反义寡核苷酸作用时间短的缺点。     

PCNA反义cDNA基因转导抑制人膀胱癌细胞增殖的研究

目的 探讨增殖细胞核抗原（PCNA）基因反义cDNA对人膀胱癌细胞体外增殖活性的抑制作用。方法 构建PCNA反义cDNA真核表达载体并转染膀胱癌DJ细胞,通过细胞生长曲线、MTT比色分析、H^3-TdR掺入法检测癌细胞增殖活性,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期时相变化,SABC免疫组化观察癌细胞PCNA蛋白表达水平。结果 PCNA反义cDNA导入后,膀胱癌DJ细胞生长速率显著减慢（P＜0．01）,增殖活性抑制率59．02％（P＜0．05）,DNA合成速率降低52．31％（P＜0．01）,S期细胞减少,细胞周期阻滞于G0／G1期,PCNA蛋白表达显著减弱（P＜0．05）,差别均有显著性意义。结论 PCNA反义cDNA基因转导能有效抑制膀胱癌细胞的PCNA蛋白表达及体外增殖活性,为肿瘤基因治疗提供了有效途径。     

反义转化生长因子β1表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞增殖活性的影响

目的:构建反义TGFβ1基因,探讨阻断肿瘤细胞TGFβ1自分泌环对细胞增殖活性的影响.方法:采用RT-PCR获取人TGFβ1 cDNA后,构建反义TGFβ1表达载体pcDNA3-TGFβ1(-).将pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞MG-63,采用流式细胞仪检测阻断TGFβ1自分泌环对肿瘤细胞增殖活性的影响.结果:pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞后,反义基因转染细胞MG-TGFβ1(-)的G0/G1期细胞从56.2%和60.1%增至71.6%,S期细胞从19.1%和17.8%降至12.9%,细胞增殖活性明显降低.结论:通过阻断TGFβ1自分泌环以降低骨肉瘤细胞表达的TGFβ1,可以明显抑制肿瘤细胞增殖活性.进一步的深入研究,必将为骨肉瘤疗效的提高开辟新的研究方向.     

RNA干扰REG1A基因抑制人膀胱癌EJ细胞增殖并降低其侵袭

目的 观察小干扰RNA(siRNA)抑制REG1A(REG1A)基因的表达对人膀胱癌EJ细胞增殖及侵袭的影响.方法 化学合成针对REG1A基因的3对siRNA,使用脂质体转染EJ细胞.实时定量聚合酶链反应( Real-time PCR)和免疫印迹(Western blot)法分别检测转染细胞REG1A的mRNA及蛋白表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染细胞的增殖,流式细胞术检测转染细胞的周期,Transwell侵袭小室检测转染细胞的侵袭能力.结果 REG1A siRNA转染组EJ细胞与空白对照Mock组比较,REG1A的mRNA及蛋白表达明显下调,分别下调了(75.58±1.17)％及(51.22±6.63)％ (P ＜0.01);REG1A siRNA转染组EJ细胞增殖速度较空白对照Mock组及阴性对照NC组明显减慢(P＜0.05),且G0/G1期细胞百分比明显增多,为(43.37±2.15)％(P＜0.01);REG1AsiRNA转染组EJ细胞穿过Transwell小室的数目为(95.84±6.49)个,明显少于空白对照Mock组的(179.93 ±8.38)个和阴性对照NC组的(186.96±6.28)个(P＜0.01).结论 REG1A siRNA能抑制体外培养的膀胱癌EJ细胞增殖并降低其侵袭能力.     

反义TGF-β1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究

目的 应用反义技术抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞（KF）体外增殖,为应用基因治疗手段改善创伤愈合提供实验依据。方法 应用脂质体将反义TGF－β1转染至KF,通过细胞计数绘制细胞生长动力学曲线,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果 ①转染反义TGF－β1的KF体外增殖明显降低。②与未转染反义TGF－β1的KF相比,转染反义TGF－β1的KF凋 亡发生率明显增高（差异有显著性意义,P＜0．05）。结论 反义TGF－β1可抑制体外培养的KF增殖,并促进KF的凋亡。     

细胞周期素D1反义cDNA治疗肝癌的研究

目的 通过基因反义封闭技术抑制细胞周期素D1（CydinD1）的表达，研究其对肝癌细胞增殖以及成瘤性的影响。方法 以肝癌HepG2细胞株为研究对象，通过转染可表达CyclinD1反义互补脱氧核苷酸（AScDNA）的质粒后，观察CyclinD1反义cDNA对肝癌细胞CyclinD1基因表达、体外增殖活性及裸鼠体内成瘤性的影响。结果 噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性显示转染表达反义CydinD1的质粒后，HepG2细胞的增殖受到抑制．抑制作用在48h左右最强；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测显示CyclinD1 mRNA基因的表达明显被抑制；间接免疫荧光检测结果显示CyclinD1蛋白表达显著降低；流式细胞仪检测结果显示G0／G1期的细胞比例增高，G2＋M和S期的细胞比例下降，HepG2细胞周期在G1期被阻滞；裸鼠成瘤试验显示肝癌HepG2细胞的成瘤性受到明显抑制。结论 CyclinD1反义cDNA可以特异性的抑制肝癌HepG2细胞株CyclinD1蛋白的表达，从而调控细胞周期，抑制肝癌细胞增殖及体内成瘤性。CyclinD1反义cDNA对于肝细胞癌的生物治疗具有一定的应用前景。     

WT-PTEN高表达对膀胱癌EJ细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨外源性野生型人PTEN高表达对膀胱癌EJ细胞增殖和侵袭能力的影响.方法利用携带人PTEN基因的野生型、磷酸酶域突变型质粒体外转染人膀胱移行细胞癌EJ细胞,Western印迹法检测目的基因的表达.采用细胞生长实验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测EJ转染前后细胞增殖、细胞周期和细胞体外侵袭力的变化.以空载质粒作为对照.结果Western印迹法检测质粒转染后EJ细胞的PTEN蛋白表达明显增强,转染野生型质粒后对EJ细胞的生长有抑制作用(生长速度下降42.7%,P＜0.01),出现G0～G1期阻滞,Boyden小室法检测转染后体外侵袭力受到明显抑制(下降41.9%,P＜0.01).而转染突变型质粒的EJ细胞则无此作用(P＞0.05).结论野生型PTEN基因在体外对膀胱移行细胞癌EJ细胞增殖和侵袭能力有明显抑制作用,磷酸酶域突变型PTEN基因无此作用.增强野生型PTEN基因表达可望作为膀胱癌基因治疗的有效工具.     

脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸体外转染率及对人膀胱癌EJ细胞的影响

目的通过以脂质体为载体介导端粒酶反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,asODN)转染人膀胱癌EJ细胞,促进反义寡核苷酸对膀胱癌EJ细胞的生长抑制。方法利用脂质体为载体将针对端粒酶RNA模板区的asODN转染膀胱癌EJ细胞;荧光显微镜观察细胞转染率;PCR-ELISA法测定端粒酶活性;MTT法检测反义寡核苷酸对膀胱癌细胞的抑制。结果脂质体介导的asODN在膀胱癌EJ细胞中的转染率1/2h、4h、8h分别为15%、56%、80%,并且细胞的端粒酶活性和细胞生长明显被抑制,与对照组比较,具有显著性差异(p(0.05)。结论脂质体介导的端粒酶asODN能够有效抑制膀胱癌EJ细胞端粒酶活性和生长,可应用于实验性肿瘤基因治疗研究和端粒酶与膀胱癌关系的进一步研究。     

反义增殖细胞核抗原联合p16基因转染抑制膀胱癌细胞生长的研究

目的 探讨膀胱癌联合基因治疗的新策略。方法 反义增殖细胞核抗原(PCNA)联合p16转染膀胱癌细胞，观测共转染1—7d后癌细胞增殖活性、DNA合成速率、细胞周期时相、克隆形成能力、细胞凋亡和PCNA、p16基因表达情况。结果 联合转染后癌细胞PCNA表达减弱，p16表达显著增强，增殖活性抑制15．45％—68．47％(P＜0．01)，DNA合成速率减慢65．77％(P＜0．01)，细胞周期阻滞于G0／G1期，克隆形成率抑制64．49％(P＜0．01)，凋亡率为22．00％(P＜0．01)。结论 反义PCNA与p16共转染具有抑制增殖、诱导凋亡的双重作用，有望成为膀胱癌联合基因治疗的新途径。     

p53重组腺病毒联合增殖细胞核抗原反义寡核苷酸治疗膀胱癌的研究

目的：探讨重组腺病毒p53(Ad-p53)与增殖细胞核抗原反义寡核苷酸（PCNA-ASO）联合应用对膀胱癌的抑瘤效应。方法：用腺病毒将p53{感染强度（MOI）100}导入细胞，PCNA-ASO(1.6μmol/L)在脂质体（Lipofectin）介导下转染细胞，通过噻唑蓝比色法（MTT）、流式细胞术、克隆形成、建立移植瘤模型，探讨其体内外抗瘤活性。结果：Ad-p53与PCNA-ASO联合应用明显抑膀胱癌胞EJ(89.3%)和BIU-87(78.6%)生长，细胞克隆形成能力分别下降74.8％和67.5％，S期比率（EJ细胞11.4％，BIU-87细胞14.6％）明显降低，细胞生长受阻于G1期(EJ细胞62.2％，BIU-87细胞56.8％)；联合应用7d后，肿瘤体积较初始分别下降47.6％和36.4％。结论：Ad-p53联合PCNA-ASO可抑制膀胱癌细胞体内外生长，产生协同效应。     

转染肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对膀胱癌细胞的抑制作用

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对膀胱癌细胞的抑制作用。方法构建TRAIL融合增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，脂质体法转染膀胱癌细胞株玎细胞。荧光显微镜下计算转染率。分别采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot检测TRAIL的表达。采用流式细胞仪检测细胞凋亡，噻唑蓝（MTT）法、细胞倍增时间和集落形成率观察TRAIL的抑制作用。结果48h观察重组载体转染率为38．4％，空载体转染率为35．3％（P〉0．05）．RT-PCR和Western blot证实转染后EJ细胞中TRAIL的表达明显增加；凋亡率明显高于转染空白载体和未转染组（P〈0．01）；EJ细胞增殖受到明显抑制（P〈0．01）。结论TRAIL具有诱导膀胱癌细胞凋亡、抑制增殖的作用，有望成为治疗膀胱癌的新方法。     

反义mTOR逆转录病毒载体对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：观察反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)逆转录病毒载体对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响。方法：采用脂质体介导转染包装细胞后构建mTOR的反义重组逆转录病毒载体(pLXIN-AmTOR)感染VSMC，检测mTOR及其下游底物包括真核细胞启动子4E结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶(p70S6k)的表达变化，以及VSMC细胞增殖周期和增殖活性的改变。 结果：反义逆转录病毒载体转染PT67细胞后感染VSMC，能显著抑制mTOR的mRNA和蛋白产物表达，mTOR通路下游p70S6k表达相应减少，而4E-BP1的表达却显著增强;感染后的VSMC的分裂、增殖过程受阻，更多细胞停滞在G1期。 结论：成功构建反义mTOR逆转录病毒载体;感染VSMC后能明显抑制VSMC的分裂、分化和增殖。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制膀胱癌EJ细胞增殖及转移

目的探讨慢病毒介导的Clusterin(CLU)基因沉默的RNA干扰效果及其对膀胱癌EJ细胞增殖和转移的影响。方法构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,用Westernblot检测其对膀胱尿路上皮癌细胞株EJ的干扰效果,用MTT、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验等方法分别检测CLU沉默后膀胱癌EJ细胞在增殖、侵袭和转移等方面的细胞生物学改变。结果靶向CLU基因的慢病毒干扰载体感染膀胱癌EJ细胞后,CLU基因在蛋白水平的表达明显下降。EJ细胞的增殖、侵袭和转移能力均受到抑制。结论 CLU慢病毒干扰载体可有效沉默膀胱癌EJ细胞内源性CLU基因,抑制膀胱癌EJ细胞的增殖、侵袭和转移。     

雄激素和转化生长因子β1协同调节前列腺基质细胞增殖和分化

目的：探讨双氢睾酮（DHT）和转化生长因子β1（TGF－β1）对体外培养的前腺基质细胞增殖和分化的影响及前列腺基质增生的机制。方法：体外培养人前列腺基质细胞，加入DHT和TGF－β1，采用MTT法检测细胞增殖，免疫组化、RT－PCR方法检测平滑肌细胞特异性标记蛋白的表达。结果：对平顶期的前列腺基质细胞，单独应用DHT或TGF－β1无显著刺激增殖作用（P＞0．05）；DHT和TGF－β1联合应用时，可显著刺激基质细胞增殖（P＜0．01），TGF－β1可使前列腺基质细胞中平滑肌细胞特异性标记蛋白的表达增加（P＜0．05），与DHT联合应用时这种作用更强。结论：DHT和TGF－β1具有协同促进前列腺基质细胞增殖和分化的作用。TGF－β1和雄激素可能是前列腺基质增生和平滑肌细胞过度增殖的重要诱因。     

脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸在人膀胱癌EJ细胞中的转染率及稳定性

目的探讨端粒酶反义寡核苷酸（asODN）在脂质体介导下在入膀胱癌EJ细胞中的转染率、分布特点及稳定性。方法合成针对端粒酶RNA模板区的asODN，并行全硫代修饰或不修饰，5-FITC标记，脂质体介导转染人膀胱癌EJ细胞后分别于15、30min、1h以及以后每小时，在电镜下观察asODN在细胞中的表达，分布特点及稳定性。结果在脂质体介导下，未修饰型asODN转染细胞后15min开始表达，1～3h稳定表达于细胞中，表达率15％～20％，4h减退；修饰型asODN 15min开始表达，8h有56％～80％的高表达，12h开始消散。结论脂质体是一种有前途的膀胱癌非病毒基因治疗载体。     

反义表皮生长因子受体RNA对U251胶质瘤细胞生长的抑制作用

目的探讨反义靶向表皮生长因子受体（EGFR）在体内外对U251细胞生长抑制作用。方法构建反义EGFR的pcDNA3表达质粒并进行了脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系基因转染。应用RT-PCR检测EGFR表达水平，应用MTT法、流式细胞术、Matrigel基质生长实验和Transwell方法评价肿瘤细胞转染前后的生物学行为。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导反义EGFR基因治疗对U251细胞生长抑制作用。对肿瘤组织应用免疫组织化学的方法进行EGFR、PCNA和GFAP表达比较。结果脂质体介导反义EGFR可显著抑制U251细胞ECFR表达，MTT法分析显示反义EGFR转染组胞生长抑制率为68％；与对照组和pcDNA3转染组比较，细胞周期分析结果表明p-anti-hEGFR转染组G0～G1期细胞数没有明显变化，进入S期的细胞数较对照组减少了，而进入G2期细胞则增加。Matrigel基质生长实验显示对照组和peDNA3转染组细胞呈正常形态贴壁生长。而p-anti-hEGFR转染组细胞不能贴壁生长，呈团块状簇集生长。Transwell方法显示肿瘤细胞的体外侵袭能力显著下降。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示反义EGFR RNA可以显著抑制皮下肿瘤生长，组织病理学分析显示治疗组EGFR表达下降而GFAP表达上调。结论反义EGFR可以显著抑制U251细胞的EGFR表达，在体内外对U251细胞生长均产生明显抑制作用。