神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的 探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响.方法 12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液, 并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU.于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测.结果 海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无.结论 切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加 NGF可促进其增殖和分化.     

切割穹窿海马伞大鼠海马内Lhx8 mRNA表达的变化

目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠切割侧与正常侧海马内Lhx8 mRNA表达的差异。方法:切割SD大鼠右侧穹窿海马伞。切割后7d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Lhx8 RNA探针进行原位杂交,分析切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层中及齿状回门区和颗粒下层中的Lhx8 mRNA阳性细胞的数量和平均光密度值。结果:切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层Lhx8 mRNA阳性细胞数量无明显差异,但切割侧平均光密度值较正常侧明显增加;在齿状回的门区和颗粒下层,切割侧Lhx8 mRNA阳性细胞数和平均光密度值均较正常侧升高。结论:切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达上调,可能与其中的神经干细胞向胆碱能神经元分化的神经再生机制有关。     

切割穹窿海马伞大鼠海马内BLBP的表达变化

为了观察切割大鼠右侧穹窿海马伞后,切割侧与正常侧海马齿状回内脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化,本研究应用Western blot和免疫组织化学方法检测双侧海马内BLBP蛋白表达水平的变化,以及海马齿状回门区和颗粒下层中BLBP免疫阳性细胞数和灰度值。结果显示:正常大鼠双侧海马各区和颗粒下层细胞BLBP仅有微量表达,切割穹窿海马伞后第1 d双侧差异不明显;3 d时切割侧颗粒下层阳性细胞及染色深度较正常侧加深;5 d时切割侧颗粒下层阳性细胞数量明显增多,染色较深,并达到最高水平;7 d后BLBP免疫阳性细胞的数量和染色深度开始降低,14 d时接近正常侧水平。而切割后3、5 d时双侧门区BLBP免疫阳性细胞的数量差异不大,但切割侧染色较深,7 d后也逐渐降低,14 d时降至正常侧水平。上述结果提示,切割穹窿海马伞阻断了隔区与海马齿状回的纤维联系后,可引起海马齿状回门区和颗粒下层BLBP表达增强,可能引发了放射状胶质细胞的增殖和激活,构成的支架有助于神经干细胞的迁移和向神经元的分化。     

Jagged1在大鼠切割穹窿海马伞后海马内的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞后不同时相点海马内Jagged1的动态表达变化。方法:切割SD大鼠双侧穹窿海马伞,于切割后第3、7、14、21 d分别提取海马组织总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和Western Blot的方法分别检测Jagged1基因和蛋白的表达变化;切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,7 d后通过免疫组织化学的方法检测海马齿状回颗粒下层和门区中Jagged1阳性细胞的数目和平均光密度值(MOD)。结果:Jagged1基因和蛋白在切割穹窿海马伞后的第3 d表达开始增高,第7 d时达到最高水平,第14 d后表达下降至正常水平;切割穹窿海马伞后的第7 d,切割侧海马齿状回颗粒下层和门区中Jagged1阳性细胞数为167.89±22.11,平均光密度值为0.11±0.02;正常侧阳性细胞数为140.45±22.63,平均光密度值为0.06±0.01;切割侧阳性细胞数和平均光密度值与正常侧均明显增高(P0.05)。结论:切割穹窿海马伞后Jagged1基因和蛋白的表达呈现出先增高后降低的变化趋势,提示Jagged1是切割穹窿海马伞后海马内微环境的重要组成分子。     

切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化——原位杂交法

目的 探讨大鼠穹隆海马伞切割侧与正常侧海马内Brn-4 mRNA表达的差异.方法 切割大鼠右侧穹窿海马伞,切割后14d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Brn-4 RNA探针进行原位杂交.每只动物随机计数3张切片切割侧和正常侧Brn-4 mRNA的阳性细胞,测定其吸光度(A)值,进行配对t检验分析.结果 切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层均见Brn-4 mRNA阳性细胞,两侧细胞数无明显差异,但切割侧阳性细胞平均吸光度值较正常侧明显增加(P＜0.01);而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧Brn-4 mRNA阳性细胞数和平均吸光度值均较正常侧升高(均P＜0.01).结论 穹窿海马伞切割侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞中Brn-4 mRNA的表达量明显增强,而在齿状回门区和颗粒下层中,其阳性细胞数和表达量均较正常侧明显升高.结合本课题组以往的工作,提示切割穹窿海马伞后,海马中Brn-4 mRNA表达的增高可能与促进其中的神经干细胞向神经元分化有关.     

大鼠穹隆海马伞切割对海马伞内神经干细胞再生的影响

目的 检测损伤的穹隆海马伞内自体神经干细胞的再生情况.方法 SD大鼠7只,切割左侧穹隆海马伞,术后腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU).术后7d取脑组织制备冷冻切片,行Nestin、BrdU免疫荧光检测;取穹隆海马伞组织进行神经干细胞的体外分离培养,对获得的细胞球进行增殖性、胚胎性以及多分化潜能的检测.结果 切割...     

穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响

为观察成鼠神经干细胞移植入切割穹窿海马伞侧海马和正常侧海马后存活和分化为神经元的状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带神经干细胞 ,进行 Brd U标记和扩增。切割 SD大鼠右侧穹窿海马伞 ,术后 2周将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回。 2月后 ,行 Nissl染色、Brd U免疫荧光、NF -2 0 0 / Brd U免疫荧光、β-tubulin- / Brd U免疫组织化学染色和 ACh E组织化学染色。结果发现 ,移植的神经干细胞在海马齿状回中存活并沿颗粒下层迁移 ,切割侧海马齿状回中有较多的 Nissl深染的大胞体神经元样细胞 ,而正常侧多为小胞体胶质样细胞。切割侧海马齿状回颗粒下层中见有数个NF-2 0 0 / Brd U、β-tubulin- / Brd U双标神经元和 ACh E阳性神经元 ,而正常侧海马中则未能见到。上述结果提示 ,移植到海马中的神经干细胞能存活、迁移 ,穹窿海马伞切割侧海马中某些物质的表达增强 ,可诱导植入其内的神经干细胞向神经元或 ACh E阳性神经元分化。     

切割穹窿海马伞后海马齿状回内Lhx8的表达变化及其对RGCs向胆碱能神经元分化的影响

目的:明确Lhx8在SD大鼠切割穹窿海马伞后海马齿状回颗粒下层和门区中的表达变化。方法:切割SD大鼠穹窿海马伞,成功制备海马去神经支配动物模型后,通过Western Blot的方法检测切割后第1、3、7、14、21、28 d海马中Lhx8蛋白的表达变化;通过免疫组织化学方法检测切割后第7天海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞的表达定位,并通过免疫荧光化学方法检测Lhx8/ChAT双标阳性细胞的共定位情况;切割SD大鼠穹窿海马伞并制备海马提取液,将其加入至细胞培养液中,模拟体内海马神经再生微环境,检测培养的海马放射状胶质细胞(radial slia cells,RGCs)向胆碱能神经元分化的情况。结果:切割穹窿海马伞后第7 d,Lhx8蛋白表达量较其他各时相点明显增高;海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞数目和光密度也明显高于正常侧,Lhx8/ChAT双标阳性细胞数目也较正常侧增多;体外细胞培养,切割穹窿海马伞侧海马提取液也较正常侧海马提取液更能促进海马放射状胶质细胞向胆碱能神经元的分化。结论:切割穹窿海马伞后,Lhx8表达明显上调,与海马齿状回的胆碱能神经再生有关。     

PEBP在切割穹窿海马伞大鼠海马中的表达变化

切割大鼠右侧穹窿海马伞,应用Western blot、免疫组化技术,观察切割后海马中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyle-thanolamine binding protein,PEBP)的表达的时空变化。Western blot结果显示:PEBP在切割后3 d表达开始上升,7 d达最高水平,随后缓慢下降,28 d时降至正常。免疫组化结果显示:术后各时间点切割侧海马CA1～CA3区的锥体细胞层和齿状回颗粒层的PEBP阳性细胞数与正常侧相比无显著性差异(P>0.05),但切割侧PEBP阳性细胞染色加深,7 d时最为明显,两侧比较灰度值有显著性差异(P<0.01)。切割侧齿状回门区和颗粒下层中可见较多深染的PEBP阳性细胞,其细胞数和灰度值与正常侧相比均有显著性差异(P<0.05)。结合本课题组以往的工作,本结果提示切割穹窿海马伞后PEBP的高表达可能与海马神经再生有关。     

穹窿海马伞切割大鼠海马内Brn-4 mRNA 的表达变化

目的探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割海马伞后1、3、7、14、21及28d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA表达水平的变化。结果海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3d开始升高,14d达到最高水平,随后下降,28d左右恢复至正常水平。结论切割穹窿海马伞后海马内Brn-4 mRNA表达明显上调,可能与促进神经干细胞更多地向神经元和AChE阳性神经元分化有关。     

穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用

目的 探讨穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元和AchE阳性神经元的影响。方法 切割SD大鼠右侧穹窿海马伞，14d后取两侧海马制成提取液；将神经干细胞接种于3块24孔培养板中，每板分成切割组、正常组和对照组各8孔，前2组分别加入切割侧和正常侧海马提取液。第1、2块分别于第7d和14d时行MAP-2免疫荧光检测；第3块于10d时行AChE组织化学染色。计数MAP-2和AChE阳性神经元数，观察胞体大小和突起长度。结果 切割组第7d时MAP-2阳性神经元较多，胞体大、突起长，14d时细胞进一步迁移、成熟；正常组第7d时仅见少量突起短的MAP-2阳性神经元，14d时细胞稍增多，突起稍增长：对照组第7d时未见MAP-2阳性神经元，14d时仅有少量胞体小、突起短的MAP-2阳性神经元。第10d切割组AChE阳性神经元较多，突起多而长，正常组仅见少量无突起的AChE阳性神经元，对照组未见AChE阳性神经元。结论 穹窿海马伞切割侧海马提取液可明显促进神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元。     

海马胆碱能刺激肽促进神经干细胞向神经元分化

目的探讨海马胆碱能刺激肽(HCNP)在神经干细胞向神经元分化过程中所起的作用。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14天后取切割穹窿海马伞侧海马制成海马提取液;将神经干细胞接种于24孔板中,分为HCNP与海马提取液联合培养组、HCNP组以及空白对照组,每组八孔;细胞分化至14天时行Tuj-1、MAP-2免疫荧光检测;计数Tuj-1、MAP-2阳性神经元数及细胞周长,并观察胞体大小和突起长度。结果联合培养组Tuj-1、MAP-2阳性神经元最多,胞体大,突起长;HCNP组神经元数量较前组少,胞体较小,突起数量和长度均小于前组;对照组则仅有少量胞体小、突起短的神经元。HCNP与切割穹窿海马伞侧海马提取液联合培养组神经元成熟度优于其它两组。结论 HCNP对神经干细胞向神经元的分化具有明显促进作用。     

大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移

为观察成鼠神经干细胞移植入切割海马伞侧海马和正常侧海马后的存活和迁移状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带组织的神经干细胞 ,并用 Brd U标记、扩增。在切割 SD大鼠右侧海马伞术后 14 d,将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回中。分别于术后 1周、2周、1个月和 2个月时取脑、冰冻切片 ,进行 Nissl染色和 Brd U免疫荧光检测。结果发现 ,1周和 2周时移植细胞主要围绕在移植点周围 ;1个月和 2个月时 ,移植细胞沿着海马齿状回颗粒下层迁移排列成条带。在所有的脑组织切片中 ,切割海马伞侧海马内移植细胞的密度均明显地大于正常侧海马内的移植细胞密度 ,且切割海马伞侧海马内 Nissl深染的大胞体神经元样细胞明显地多于正常侧。提示 ,移植至海马齿状回中的神经干细胞可存活并可沿海马齿状回颗粒下层迁移 ;切割海马伞侧海马中存活和迁移的神经干细胞密度大于正常侧者 ,可能与某种物质的表达增加有关