莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的　为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法　采用 377型 DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒 p BX1的插入片段进行 DNA序列测定 ,并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒 p BX1在大肠杆菌中进行诱导表达 ,并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果　1重组质粒 p BX1插入片段大小为 477bp,其核苷酸序列与文献报道的 p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异 ,2成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱 ;3重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了 2 9kd的融合蛋白 ;4Western- blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论　该研究成功地对莱姆病螺旋体 83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达 ,为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。     

重组质粒pUC-CK在大肠杆菌中表达条件的优化

目的：优化含PKCε催化功能域基因的重组质粒pUC-CK在大肠杆菌中表达的最佳条件，方法：含重组质粒大肠杆菌培养、表达产物的SDS-PAGE电泳及Westernblot检测，结果：PKCε催化功能域在大肠杆菌中表达的最佳条件为：含重组质粒大肠杆菌过夜培养时加入0．1％的葡萄糖增加质粒拷贝数；诱导剂(IPTG)的最适工作浓度为0．5mmol／L；诱导最适培养温度为30E；诱导培养时间为2～3h用于检测，6～24h用于分离纯化，结论：PKCε催化功能域在大肠杆菌中成功表达，为今后大量表达、纯化该酶蛋白作了前期铺垫。     

高密度培养大肠杆菌生产重组钩端螺旋体DNA疫苗

目的：高密度、高质粒拷贝数培养大肠杆菌生产重组DNA疫苗pcD-flaB。方法：应用FUS－5L自控发酵罐，采用补料分批培养技术，补料的补加使溶氧控制在30％－605，pH控制在7左右，培养中后期采用42℃培养以提高质粒拷贝数。结果；重组菌E.coli DH5α/pcDNA3-flaB发酵液光密度（D600）达到45。经纯化后最终质粒DNA得率为50mg/L。质粒没有发生丢失现象。结论：本实验为钩端螺旋体DNA疫苗的大规模生产奠定了基础。     

重组质粒DNA中插入子的核苷酸序列分析

探讨由乙酰胆碱受体抗体可变区基因与载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ构建的重组质粒中插入子进行核苷酸序列分析的条件及对结果的影响．     

温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响

对于大肠杆菌温度表达系统,温度的选择和变化对外源基因的表达至关重要,最直接的因素表现在对质粒拷贝数的影响上。本文通过重组大肠杆菌DH 5α表达载脂蛋白A I-M ilano来分析不同温度诱导模式对质粒拷贝数的影响,确立了二次升温诱导(30°C→42°C→37°C→42°C)有利于菌体质粒拷贝数的增加,从而提高目的蛋白的表达量,结果表明:二次升温诱导比一次升温诱导蛋白表达量增加80%。     

人胸腺素α1原核表达重组体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：以基因工程方法获得人胸腺素α1（Tα1）多肽产品。方法：通过PCR扩增人工合成模板的方法获得人Tα1基因，然后将其克隆入原核细胞表达载体pGEMEX1，用重组体转化大肠杆菌，并从mRNA和蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况。结果：构建人Tα1克隆重组体pUC18-Tα1，经序列分析证实对码、序列无误；成功构建了人Tα1原核细胞表达重组体pGEMEX1-Tα1;从mRNA水平证实pGEMEX1-Tα1在大肠杆菌JM109（DE3）中能够转录；转化大肠杆菌JM109（DE3），经IPTG诱导，能产生-36kD左右的融合蛋白。结论：构建成功重组体pGEMEX1-Tα1，并在大肠杆菌中得以表达。     

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫保护研究

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８的免疫保护作用，采用随机、双盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质Ｐ６８可作为钩体基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

一种适合序列分析的快速重组质粒DNA制备法

应用阳离子去垢剂十六烷基三甲基溴化铵沉淀重组质粒ＤＮＡ，得到的ＤＮＡ制剂纯度高，可直接用于双股ＤＮＡ序列分析，本法省时，ＤＮＡ序列分析重复性好。     

质粒DNA的快速提取及其在重组子大量筛选中的应用

目的 介绍一种质粒DNA的快速提取方法及其在重组子大量筛选中的应用。方法 利用微量碱变性一步法快速提取质粒DNA。结果 应用该法能在大量的重组菌株中筛选出所需的重组质粒。结论 本法便捷，经济，适合于在大量DNA库中筛选出所需目的基因。     

Construction and expression of human alpha-fetoprotein recombinant plasmid]

OBJECTIVE: To construct AFP-expressing plasmid and study the expression in eukaryotic cells. METHODS: Total RNA was isolated from fetal liver tissue. Full-length human AFP cDNA was obtained by RT-PCR amplification and then recombined into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1. The AFP sequence of the recombinant plasmid phAFP was determined. The AFP expressions in CHO transfected with phAFP and in muscle after injection phAFP were investigated by immunohistological methods. RESULTS: The restriction endonuclease mapping of recombinant plasmid showed 1.8 kb fragment as well as full-length human AFP cDNA, and the sequence is consistent with that from GenBank. The phAFP was successfully expressed in CHO and in muscle tissues. CONCLUSION: These results suggested that AFP can be used as a target gene of DNA vaccine in heptocellular carcinoma therapy.     

日本血吸虫(大陆株)26ku谷胱甘肽转移酶基因真核表达载体构建及序列分析

目的　构建日本血吸虫大陆株 2 6ku谷胱甘肽转移酶 (GST)基因真核表达质粒 pBK SjGST并进行序列分析 ,为进一步进行重组蛋白的表达及保护性免疫研究提供条件。方法　根据日本血吸虫菲律宾株 2 6kuGST核苷酸序列 ,设计合成一对引物 ,以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板 ,通过RT PCR合成日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGSTcDNA片段。将其克隆入 pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK SjGST ,转化到大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果　PCR、pGEM T SjGST及 pBK SjGST分别经双酶切获得一特异性基因片段 .经测序分析该片段具有一个 670bp的全基因序列 ,而其开放阅读框 (openreadingframe,ORF)为 65 7bp ,编码 2 18个氨基酸 ,并对其基因序列及编码的蛋白质进行了分析。结论　成功地构建了日本血吸虫中国大陆株 2 6kuGST基因真核表达重组质粒 ,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析     

pQE31-HPV16 L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒以获得ＨＰＶ１６ Ｌ１活性蛋白。为进一步研制ＨＰＶ１６基因工程疫苗打下基础。方法 以克隆质粒pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检查质闰重组后序列情况。结果 ＰＣＲ结果显示扩增片断大小为１.5Kb,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约５.0Kb。大小及酶切图谱与预期相同。经测序发现插入片段两端序列无改变。结论 pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１质粒构建成功。     

pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0) 的真核表达载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中表达,以期为深入研究Mxi1-0的作用及机制奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肿瘤细胞HepG2中获得Mxi1-0基因的编码片段,连接至增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)构建成pEGFP-N1-Mxi1-0。经酶切和测序鉴定重组质粒的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光显微镜观察和Western blot方法检测Mxi1-0表达,免疫荧光法检测Mxi1-0在NIH/3T3细胞内的定位情况。结果:经双酶切和核酸序列测序鉴定证实含Mxi1-0的重组真核表达载体pEGFP-Mxi1-0构建成功。重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞后,检测到Mxi1-0的成功表达,并证实Mxi1-0主要定位于NIH/3T3细胞质中。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mxi1-0,并检测到Mxi1-0的表达,实验证明Mxi1-0定位于NIH/3T3细胞质中。     

一株鸭乙型肝炎病毒DHBV全基因的克隆和序列分析

目的 从本地樱桃谷鸭血清中克隆鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA，并进行序列分析。方法 用PCR扩增HBV全基因．连接至T载体上，挑选克隆进行测序分析，与GenBank中16株：DHBV全基因组进行同源性比较，并进行分子进化树分析。结果 24-18与16株DHBV基因组比较，核苷酸同源性介于89．4%-99．3％之间，各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显地方位于P区。结论 24-18属于DHBV西方基因型中的一个亚型。     

重组pEGFP-C2-FOXC1-C真核表达质粒的构建与表达

目的:将人FOXC1-C基因定向连入pEGFP-C2质粒,使FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究FOXC1-C蛋白的功能及定位奠定实验基础。方法:采用EcoR I和NotI双酶切方法,从pcDNA3.1(+)-FOXC1-C质粒中获得FOXC1-C蛋白的cDNA羧基末端;连入pEGFP-C2质粒的C端。将构建成功的pEGFP-C2-FOXC1-C质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见FOXC1-C片段;(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)FOXC1-C cDNA羧基末端成功连入pEGFP-C2质粒(;2)FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

重组质粒pcDNA4-FLAG-GLUT1构建及蛋白表达

目的:为探究葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）磷酸化水平对红细胞期疟原虫生长发育的影响,构建必要的分子工具。方法:以pcDNATM4/TO/myc-His B为载体,构建在GLUT1第一个胞外区插入2×FLAG标签的重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。将重组质粒转染到NIH/3T3细胞中,利用Western印迹和流式细胞术分别检测细胞FLAG-GLUT1蛋白总量和细胞表面FLAG-GLUT1的表达水平。结果:酶切鉴定及DNA测序表明正确构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。通过识别FLAG标签,利用Western印迹能够检测到FLAG-GLUT1在NIH/3T3细胞中的表达,流式细胞术结果显示,转染重组质粒的细胞表面可检测到FLAG-GLUT1的表达,阳性群比例为（21.46 ± 2.375）%,明显高于对照组（0.01±0.00）%,差异有统计学意义（t=9.035,P<0.01）。结论:成功构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1,为研究GLUT1蛋白磷酸化在疟原虫感染红细胞中的作用提供了必要的工具。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。