抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达

目的：克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法：从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆该抗体重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL），通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-ALI，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果：VH基因序列全长369碱基对，编码123个氨基酸，VL基因序列全长339碱基对，编码113个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FRs）、3个抗原互补决定区（CDRs）及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论：成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中，为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。     

溶藻弧菌抗独特型抗体scFv的原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建溶藻弧菌抗独特型单链抗体(scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定.方法从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中已获得的该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建scFv及原核表达载体pET32a-AL,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达.表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定.结果 scFv基因序列全长747碱基对,编码249个氨基酸,符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基.ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有藻弧菌一样的免疫原性.结论 成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体scFv原核表达载体并表达于包涵体中,表达的融合蛋白具有与溶藻弧菌一样的免疫原性,为溶藻弧菌抗独特型单链抗体scFv成为鱼用基因工程疫苗奠定了初步基础.     

鼠源性抗人HAAH mAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链町变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达.方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL基因;再利用重叠延伸PCR(SOE-PCR),通过设计在引物上的linker序列,将VH和VL拼接为完整anti-HAAH scFv基因.将测序正确的scFv基因克隆入pHEN 1载体,并利用E.coli HB2151进行蛋白表达;通过SDS-PAGE,Western blot分析其表达状况,ELISA鉴定其抗原结合活性.结果:测序结果显示,本实验成功地构建出鼠源anti-HAAH VH-linker-VL scFv基因,且VH、VL均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区结构,所得的scFv基因片段全长744 bp,编码248个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,pHEN 1-anti-HAAH在E.coli HB2151可表达为Mr约27 000的可溶性scFv蛋白,表达量为7.8%.间接ELISA检测显示,可溶性鼠源anti-HAAH scFv蛋白具有较高的抗原结合活性.结论:成功扩增出的鼠源anti-HAAH mAb VH区和VL区基因,并构建为anti-HAAH scFv基因.然后,利用pHEN 1载体对anti-HAAH scFv基因进行成功表达,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的: 克隆并分析抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体(mAb)VH及VL基因。方法: 从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株 (AL1 )中提取总RNA。利用RT- PCR技术,克隆抗溶藻弧菌独特型mAbVH 和VL基因, 并将其重组入PMD18 Tvector中进行测序分析。结果: VH基因序列全长为369bp, 编码 123个氨基酸; VL基因序列全长为 339bp, 编码113个氨基酸。通过国际联机检索及Kabat库分析, 二者均符合小鼠IgGV区基因的特征, 含有 4个框架区 (FR), 3个抗原互补决定区 (CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。结论: 抗溶藻弧菌独特型mAb的VH和VL基因的克隆成功,为抗溶藻弧菌独特型mAb基因工程疫苗的构建奠定了基础。     

抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备

目的 构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定.方法 设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb) FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化.采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析.结果 成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸.PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功.转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白.经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90％以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性.结论 成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体.     

抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv基因连接到pBAD/gⅢA表达载体,转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果:scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser)。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类,全长351 bp,可编码117个氨基酸;其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,全长318 bp,可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-mycMr约为31 000,结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。     

抗CD3单克隆抗体重、轻链可变区基因的克隆及序列分析

目的：抗CD3单克隆抗体（WuT3)可变区基因克隆及序列分析。方法；采用RT-PCR技术，从WuT3杂交瘤细胞总RNA中扩增VH，VL片段，经酶切后通过链接反应构建重组克隆载体，测序鉴定。结果：通过国际联机检索发现VH，VL基因与Ig同源，分别符合小鼠IgVH,Vк基因特征。VH基因属于鼠重链VH第ⅡB亚类，全长363bp，可编码121个氨基酸；VL基因属于鼠к轻链第Ⅲ亚类，全长330bp，可编码110个氨基酸，结论：成功获得WuT3单抗的重，轻链可变区基因。     

具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5,克隆其mAb体的可变区基因。方法提取杂交瘤细胞的总RNA ,分离mRNA ,反转录合成cDNA。经PCR扩增VH 基因和VL 基因 ,将VH 基因和VL基因与载体 pGEM T连接后 ,进行酶切鉴定和序列分析。结果构建了2个分别含有VH 和VL 基因的重组质粒。序列分析表明 ,VH 和VL 分别属于mouscheavychainsubgroupIII和mouselightchainsubgroupV亚群 ,长度为372和324bp ,编码124和108个氨基酸 ,在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论克隆的VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,为将来制备具有GPX活性的单链抗体提供了可靠的基因材料。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达

目的 从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达.方法 从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因;通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv).将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达.通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性.结果 测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白.间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性.结论 制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础.     

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。     

抗人肝癌单链抗体的基因克隆和分泌型表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从分泌抗人肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＡｂ１８中，扩增出抗体ＶＨ和ＶＬ连接肽基因，将ＶＨ和ＶＬ连接成ＳｃＦｖ基因，并进行序列测定，结果表明，ＶＨ，ＶＬ，ｌｉｎｋｅｒ拼接正确，基因全长为７２６ｂｐ。用噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ在大肠杆菌中表达了可溶性的ＳcＦｖ融合蛋白，经流式细胞仪分析表达产物可特异地与肝癌细胞结合，而不与正常肝细胞及胃癌细胞结合。     

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2 螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2 亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。     

抗HEV中和抗体13D8的单链抗体的构建及表达

目的 :降低HEV中和性单抗 (mAb) 13D8的鼠源性 ,表达其单链抗体 (scFv)。方法 :从分泌 13D8鼠mAb的杂交瘤细胞中 ,通过RT PCR克隆mAb的VL、VH 基因 ,并进一步组装成VH linker VL 型的scFv片段。将scFv片段克隆到pTO T7载体中 ,在大肠杆菌中进行表达。用ELISA、Westernblot检测scFv的活性。结果 :SDS PAGE表明 ,13D8的scFv在E .coli中得到高效表达 ,表达量达菌体总蛋白的 2 6 .8%左右 ,表达产物主要以包涵体的形式存在。间接ELISA和Westernblot检测表明 ,表达的 13D8的scFv能与HEVOFR2区中一段重组蛋白(NE2 )特异结合。竞争ELISA表明 ,scFv与原鼠mAb识别的为同一表位。结论 :成功地表达出具有免疫学活性的 13D8的scFv。     

抗人大肠癌单链抗体的构建、表达及其体内外生物学活性的检测

目的 将抗人大肠癌单克隆抗体ND-1(mAb)的VR和VL基因进行重组，构建和表达ND－1scFv，并对其在体内外的生物学活性进行检测。采用RT－PCR技术，从能够分泌mAb ND-1的鼠杂交瘤细胞中扩增VH和RL基因，通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽，体外构构建ND－1scFv基因，并在大肠杆菌中表达。采用间接免疫荧光（IFA）EY IF工IMPG-1scFv的免疫学活性。用^99Tc^m标记ND－1scFv后，将偶联物给予荷瘤裸鼠，观察其在动物体内的显像及生物学分布。结果 SDS－PAGEW显示，重组蛋白Mr为30000，同预期结果一致。IFA及ELISA检测表明，ND－1scFv保留了与亲本抗体相近的免疫学活性，对表达相应抗原的靶细胞具有行异结合活性。体内放射免疫实验显示，^99Tc^m-ND-1scFv在荷瘤小鼠体内的生物学分布，呈明显的肿瘤积聚趋向，注入体内1h血中T／NT即在2．61。结论 获得免疫学活性良好的ND－1scFv，对荷瘤动物体内肿瘤的定位快速，准确，可望成为有效的肿瘤诊断和治疗的导向载体。     

抗阿尔茨海默病Aβ人源单链抗体基因的筛选和表达

目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础.