p27~(Kip1)在RA诱导人神经前体细胞分化中的作用

目的观察全反式视黄酸(RA)对体外培养的人神经前体细胞的诱导作用,研究在这个过程中细胞周期调节蛋白p27Kip1、p21Cip1及相关分子cdk2、cyclinE的变化,探讨p27Kip1在RA诱导的人神经前体细胞分化过程中的作用。方法取12wk的人胚胎前脑纹状体,原代培养人神经前体细胞。在细胞进入对数生长期时给予1μmol·L-1RA诱导。在诱导的d1、3、7,用相差显微镜观察细胞形态的变化;用免疫细胞化学染色、RT-PCR等方法检测p27Kip1、p21Cip1及其相关的cdk2、cyclinE的变化。结果在RA诱导d3,人神经前体细胞形态发生变化,至d7时已接近成熟神经元形态。免疫细胞化学染色结果显示p27Kip1的表达在RA诱导d3增加,在RA诱导d7时明显增加,与未经RA诱导的细胞相比差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,p27Kip1 mRNA的表达在RA诱导d3增加,并在RA诱导d5达到高峰,而p21Cip1 mRNA的表达在RA诱导后略呈下降趋势。cdk2、cy-clinE的mRNA水平在RA诱导前后没有明显变化。结论p27Kip1在RA诱导的人神经前体细胞分化过程中具有重要作用,并且其表达增加是通过转录水平调节的。     

人神经前体细胞分化过程中p27~(Kip1)的作用及其调节机制研究

目的研究视黄酸(RA)诱导人神经前体细胞(hNPCs)分化的过程中,细胞周期调节蛋白p27Kip1的变化及其调节机制,以掌握hNPCs的增殖分化特性。方法取原代hNPCs体外培养,在细胞进入对数生长期时给予RA诱导,在诱导d3、5、7收集细胞,用流式细胞分析术观察细胞周期的变化、用Westernblot法观察p27Kip1及其相关的细胞周期调节蛋白p21Cip1、cdk2的变化,以及参与p27Kip1泛素-蛋白酶降解途径的重要因子skp2的变化。结果RA诱导d3,hNPCs细胞G0/G1期的比例由诱导前的65.20%上升至80.72%;而S期的比例由诱导前的28.39%下降到8.62%;p27Kip1蛋白表达在RA诱导d3增加,并在d5达到高峰;p21Cip1和cdk2的表达在RA诱导前后变化不明显,但反映cdk2活性的p-cdk2蛋白的表达在RA诱导后明显下降;skp2的表达在RA诱导后明显下降。结论在RA诱导hNPCs分化的过程中,p27Kip1蛋白泛素降解途径受阻,致使其含量增加,并通过抑制cdk2的活性而发挥了促进hNPCs分化的作用。     

成年大鼠脑膜原代组织干细胞特性细胞的分离及神经诱导分化研究

目的 分离并检测成年大鼠脑膜组织中具有干细胞特性的细胞亚群,探讨其诱导成神经细胞的能力.方法 自成年大鼠活体分离、剪取脑膜经胰酶消化制成细胞悬液,接种于培养皿,用无血清的特殊培养基培养,动态观察脑膜细胞克隆球的形成及分化过程,并用巢蛋白（Nestin）、表面抗原CD133抗体进行免疫荧光染色,对阳性细胞进行表观遗传学鉴定.分离的脑膜细胞经曲古抑菌素A（TSA）诱导培养基分别诱导分化后检测脑膜细胞向神经细胞分化成熟程度,用免疫印迹法（westen blotting）检测诱导分化后脑膜细胞内成熟神经细胞相关标志性蛋白--高分子量神经丝蛋白（NF-200）、神经元蛋白（BM88）的表达情况.结果 成年大鼠脑膜组织体外培养时不同类型细胞的贴壁时间有差异,具有干细胞特性细胞呈球形,黏着在首先贴壁的扁平基底细胞上分裂形成克隆球,克隆球细胞Nestin、CD133免疫荧光染色阳性.诱导分化后NF-200、BM88有明显表达,表明经诱导分化后脑膜细胞可分化为神经细胞.结论 活体分离成年大鼠脑膜组织部分细胞体外培养具有干细胞特性,并可向神经细胞方向分化.     

人胚胎神经干细胞体外培养及其增殖与分化的研究

目的 建立神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术，观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎海马区分离神经干细胞，采用无血清培养基，进行体外扩增培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞；利用流式细胞仪和细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。结果 从人胚胎脑海马区分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞团中大部分为nestin表达阳性细胞。贴壁分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞能表达nestin蛋白，具有自我更新和增殖能力，并具有向神经元、星形胶质细胞分化的潜能，具备神经干细胞的特征，可用于细胞移植等相关研究。     

SRC-1基因在小鼠神经干细胞分化过程中的变化

目的观察类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)基因在小鼠神经干细胞(NSCs)体外培养分化过程中表达的变化。方法用机械分离和酶消化法从1~3 d小鼠大脑皮质获取NSCs原代细胞,体外培养获神经球,传代并消化,经血清诱导神经球细胞分化。形态学、细胞免疫荧光实验观察神经球形态、Nestin表达鉴定NSCs;抗体分别标记神经元、星形胶质细胞,检测细胞分化d 3、9的细胞类型。RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞分化d 0、3、9 SRC-1基因mRNA和蛋白的表达。结果新生小鼠大脑皮质获取的细胞,体外培养能扩增形成神经球,Nestin阳性表达。NSCs分化d 3主要为神经元,d 9主要为星形胶质细胞。与NSCs分化d 0相比,SRC-1表达在分化d 3明显升高,在分化d 9明显降低。 结论 成功分离并获取新生小鼠皮质NSCs。在NSCs分化中,SRC-1表达量有明显变化,分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。     

双去甲氧基姜黄素对小鼠脑神经母瘤细胞的促神经分化作用及机制研究

目的 研究姜黄素衍生物双去甲氧基姜黄素（BC）对小鼠脑神经母瘤细胞Neuro-2a(N2a)的促神经分化作用及机制。方法 采用MTT法检测BC(1、2、4、6、8、10μmol/L)对N2a细胞存活率的影响,确定药物处理浓度范围。设对照组、视黄酸（RA）组（10μmol/L）和BC组（1、2、4μmol/L）,培养48、72 h后,对分化细胞的神经突起长度进行测量并计算细胞分化率;采用Western blot法检测4μmol/L BC作用5、15、30、60、120 min后细胞中蛋白激酶B(Akt)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）蛋白的磷酸化水平。以抑制剂LY294002(LY)和PD98059(PD)干预后,进一步验证BC对Akt和ERK蛋白磷酸化水平及促神经分化的影响。结果 根据MTT实验确定后续诱导细胞分化的BC浓度为1、2、4μmol/L。分化48 h后,与对照组比较,RA组和BC 1、2、4μmol/L组细胞分化率及BC 4μmol/L组细胞神经突起长度均显著升高/增加（P<0.05或P<0.01）;BC继续诱导分化...     

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

去分化肌肉干细胞神经分化潜能的探讨

目的探讨去分化肌肉干细胞经条件培养诱导,具有神经干细胞性质并分化为终末神经细胞的潜能。方法依次用神经干细胞增殖及神经细胞分化条件培养基,对去分化肌肉干细胞进行体外诱导,促使其向神经干细胞转变以及向终末神经细胞分化,并通过形态学、免疫细胞化学、RT-PCR等实验手段研究其性质并加以鉴定。结果 (1)去分化肌肉干细胞在神经干细胞增殖条件培养基诱导下,可形成神经球,EdU标记阳性,抗Nestin、Neurofilament-m(NFm)、GFAP、CNPase阳性;Myogenin表达水平下调,而Nestin、Sca-1表达上调;(2)经神经细胞分化条件培养基诱导,神经球细胞可分化为形态学上典型的、抗NFm阳性神经元,以及抗GFAP、CNPase阳性神经胶质细胞。结论去分化肌肉干细胞具有神经系的多分化潜能。     

胎鼠脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 研究胎鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法 从孕15d胎鼠的大脑皮层和海马区脑组织中获取NSCs,在含有B27、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的DMEM/F12无血清培养液中培养;传代后用5%胎牛血清培养液诱导NSCs分化。结果 体外分离培养的NSCs在无血清培养液中形成大量的神经球。经3-5代传代的细胞生长稳定。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞,神经细胞球经胎牛血清培养液贴壁培养后可分化为神经元特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂表达阳性的细胞。结论 从孕15d胎鼠大脑皮质和海马组织分离出的NSCs具有自我更新能力和多向分化潜能,其在5%胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

苯乙基异硫氰酸盐对神经分化胚胎干细胞凋亡诱导及其机制的研究

目的研究苯乙基异硫氰酸盐对体外神经分化胚胎干细胞(ES)凋亡的诱导及其作用机制。方法应用MTT法检测苯乙基异硫氰酸盐对ES细胞活性的影响;体外未分化培养和悬滴、悬浮培养后由5×10-7 mol/L视黄酸诱导神经定向分化培养的ES细胞,经不同浓度苯乙基异硫氰酸盐(0、2、4和8μmol/L)作用24 h,采用流式细胞仪、Ho-chest33258染色和Capase-3酶活性分析检验ES细胞的凋亡效应,并采用蛋白免疫印迹方法检测细胞内Bcl-2及Bax基因的表达变化。结果与阴性对照比较,未分化和神经分化培养的ES细胞在苯乙基异硫氰酸盐作用下均可出现凋亡形态变化、细胞凋亡率增加和胞内Capase-3酶活性上升,同时胞内Bcl-2基因的表达受到抑制,且呈一定剂量反应关系;另相同剂量条件下,苯乙基异硫氰酸盐对神经分化ES细胞凋亡的诱导作用远较未分化ES细胞显著。结论苯乙基异硫氰酸盐具有诱导神经分化ES细胞发生凋亡的作用,Capase-3活性增加和Bcl-2表达抑制可能是其作用的主要机制。     

Interaction of ethanol with retinol and retinoic acid in RAR beta and GAP-43 expression

Fetal ethanol exposure has many detrimental effects on neural development, which possibly occurs through ethanol-induced disruption of the function of vitamin A. In LAN-5 neuroblastoma cells, retinol (10(-6) M) and retinoic acid (RA; 10(-5)-10(-6) M) increased RAR beta mRNA expression. Ethanol downregulated RAR beta levels, even in the presence of retinol. RAR beta mRNA expression was decreased by ethanol in the presence of 10(-6) M RA, but not 10(-5) M RA. With cycloheximide (CX), RA still stimulated RAR beta mRNA, but the effect of ethanol was abolished. The mRNA expression of GAP-43, an important factor in neural development, increased with 10(-6) M retinol and 10(-5)-10(-9) M RA. Ethanol decreased GAP-43 mRNA expression in the presence or absence of retinol. Ethanol was without effect on GAP-43 mRNA at 10(-5) M RA, but did lower the levels at 10(-6) and 10(-7) M RA. CX prevented the effects of both RA and ethanol on GAP-43 mRNA. These studies provide support for the hypothesis that retinoid function is altered by ethanol.     

9-顺维甲酸对肺鳞癌细胞生物学特性的影响

目的　探讨 9 顺维甲酸 ( 9 cis RA)对肺鳞癌细胞的生物学作用。方法　对应用 9 cis RA处理后L78和A2 两肺鳞癌细胞株的生长、分化和凋亡等特性进行检测观察。结果　① 9 cis RA对两肺癌细胞株的生长产生明显的抑制作用 ;②应用 9 cis RA后 ,两株细胞分化特征明显 ;③经 9 cis RA处理后的两肺鳞癌细胞凋亡率明显高于对照组。结论　 9 cis RA具有抑制肺鳞癌细胞的生长、诱导其分化和凋亡等生物学作用。     

维甲酸诱导分化对SH-SY5Y细胞阿片受体表达的影响

目的研究维甲酸诱导SH-SY5Y细胞分化后对阿片受体表达的影响。方法 1×10-5mol.L-1维甲酸诱导SH-SY5Y细胞分化6天,[3H-diprenorphine]放射性配体受体结合试验确定阿片受体表达量。结果维甲酸诱导分化6天后,与对照细胞比较,SH-SY5Y细胞突起增多增长类似轴突,且细胞间形成明显神经纤维网络,细胞生长明显减慢,阿片受体表达提高1.6倍以上。结论维甲酸明显诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化,且分化后细胞阿片受体表达明显上调。     

Interaction of ethanol with retinol and retinoic acid in RAR β and GAP-43 expression

Fetal ethanol exposure has many detrimental effects on neural development, which possibly occurs through ethanol-induced disruption of the function of vitamin A. In LAN-5 neuroblastoma cells, retinol (10⁻⁶ M) and retinoic acid (RA; 10⁻⁵–10⁻⁶ M) increased RAR β mRNA expression. Ethanol downregulated RAR β levels, even in the presence of retinol. RAR β mRNA expression was decreased by ethanol in the presence of 10⁻⁶ M RA, but not 10⁻⁵ M RA. With cycloheximide (CX), RA still stimulated RAR β mRNA, but the effect of ethanol was abolished. The mRNA expression of GAP-43, an important factor in neural development, increased with 10⁻⁶ M retinol and 10⁻⁵–10⁻⁹ M RA. Ethanol decreased GAP-43 mRNA expression in the presence or absence of retinol. Ethanol was without effect on GAP-43 mRNA at 10⁻⁵ M RA, but did lower the levels at 10⁻⁶ and 10⁻⁷ M RA. CX prevented the effects of both RA and ethanol on GAP-43 mRNA. These studies provide support for the hypothesis that retinoid function is altered by ethanol.     

Influence of isomerisation on the growth inhibitory effects and cellular activity of 13-cis and all-trans retinoic acid in neuroblastoma cells

Treatment with 13-cis retinoic acid (13-cis RA) has been shown to significantly improve the clinical outcome of children with high-risk neuroblastoma. Despite the large number of studies investigating the cellular effects of retinoids in neuroblastoma cells, the influence of RA isomerisation and the factors that determine the extent of RA isomerisation and uptake are unknown. The aim of this study was to establish the extent of extra- and intracellular isomerisation of 13-cis RA and all-trans retinoic acid (ATRA) in neuroblastoma cell lines, and to investigate the influence of isomerisation on their growth inhibitory effects and on the regulation of expression of cellular retinoic acid binding protein II (CRABP II) and RAR-beta. Limited extracellular isomerisation was observed up to 72 hr after incubation of four neuroblastoma cell lines with 10 microM 13-cis RA or ATRA. The retinoic acid isomer present initially in the medium accounted for >75% of extracellular retinoid exposure. By contrast, incubation with 13-cis RA resulted in intracellular levels of ATRA comparable to those of 13-cis RA. This degree of intracellular isomerisation was not observed after ATRA incubations, with 13-cis RA accounting for <10% of total intracellular retinoids. No differences were observed in the sensitivity of three N-type neuroblastoma cell lines to either 13-cis RA (IC(50): 11.2-13.9 microM) or ATRA (IC(50): 12.9-14.4 microM), despite 10-fold differences in intracellular retinoid levels. A decrease in sensitivity to 13-cis RA (IC(50)=137 microM), as compared to ATRA (IC(50)=41 microM), was observed in the S-type cell line SH S EP. RAR-beta was induced in a dose-dependent manner in SH SY 5Y cells following incubation with ATRA, whereas a weaker and delayed induction was observed with 13-cis RA. Similarly, incubation with ATRA resulted in a greater induction of CRABP II in these cells. In summary, these results indicate either an intracellular conversion of 13-cis RA to ATRA or a selective uptake of ATRA and suggest that this may mediate the differential activity of 13-cis RA in neuroblastoma cell subtypes.     

辅助性T细胞9在类风湿关节炎发病中的作用探讨

目的 探讨Th9细胞及相关细胞因子在类风湿关节炎(RA)中表达的改变及可能的机制.方法 采集20例健康人(HC)和20例RA患者(RA组)的外周血,用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-9、IL-4、转化生长因子(TGF)-β和干扰素(IFN)-γ水平;流式细胞术检测Th9细胞数;实时定量PCR检测IL-9 mRNA、转录因子PU.1 mRNA,分析这些指标可能的相互关系.结果 RA组患者外周血中CD4+ IL-9+T细胞、CD4+ PU.1 +T细胞、CD4+ IL-9+ PU.1 +T细胞均缺如.细胞因子检测:IL-9水平在HC组为(1.24±0.44)×10-9 g/L,RA组为(1.33 ±0.53)×10-9 g/L(P =0.558);IL-4水平在HC组为(8.59±4.07) ×10-9 g/L,RA组为(5.95±5.73) ×10-9 g/L(P =0.101);TGF-β水平在HC组为(1238±329) μg/L,RA组(712±254) μg/L,(P=0.00);IFN-γ水平在HC组均低于检测水平,RA患者中5例IFN-γ水平升高.HC组IL-9 mRNA表达为(0.24±0.04),RA组为(0.24±0.02) (P =0.764);HC组PU.1 mRNA表达为(0.38 ±0.02),RA组(0.13±0.02) (P =0.000).结论 RA组患者外周血促Th9分化关键细胞因子水平降低.抑制其分化关键细胞因子平有所升高,导致PU.1 mRNA表达受抑,PU.1蛋白无法合成不能支持IL-9mRNA表达.RA患者外周血不存在Th9细胞分化条件,推测循环血Th9细胞可能不参与RA发病机制.