雷公藤红素对转基因小鼠原代肝细胞HBV的抑制作用

目的:考察雷公藤红素对HBV转基因小鼠原代肝细胞的抗HBV作用。方法:改良的两步灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞;MTT法检测细胞毒性作用;药物作用24 h后取上清,分别应用ELISA法和荧光定量PCR法测定HBsAg和HBV-DNA。结果:雷公藤红素对原代肝细胞TC50为(6.49±0.8)μmol·L-1;雷公藤红素浓度低于0.8μmol·L-1时,对原代肝细胞没有明显毒性;在0.08～0.8μmol·L-1浓度范围内对HBsAg和HBV-DNA有显著抑制作用(P<0.05);随着雷公藤红素浓度的增加,对HBsAg和HBV-DNA的抑制作用增强。结论:雷公藤红素不仅能够抑制转基因小鼠原代肝细胞HBV-DNA的复制,而且可以有效抑制其HBsAg的表达。     

硫酸化魔芋葡甘低聚糖的抗乙肝病毒作用

目的体外观察硫酸化魔芋葡甘低聚糖(HOGS)抗乙肝病毒(HBV)的作用。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和ELISA法,研究HOGS对HepG2-2.2.15细胞细胞毒性作用及其分泌HBsAg、HBeAg的影响。采用荧光探针定量PCR检测HOGS对HepG2-2.2.15细胞HBV-DNA复制的影响。结果HOGS在0.125~1mg/mL浓度范围对HepG2-2.2.15细胞没有明显的细胞毒性作用,细胞的半数中毒浓度(TC50)为1.4753mg/mL;并且可明显抑制HepG2-2.2.15细胞HBsAg的分泌,其半数有效浓度(IC50)为0.0268mg/mL,治疗指数达5.52;对HBV-DNA也有一定的抑制作用。结论HOGS具有一定的体外抗HBV作用。     

拉米夫定和干扰素α2b体外细胞毒性与抗乙型肝炎病毒作用比较

目的 体外比较拉米夫定和α-干扰素的细胞毒性和抗乙型肝炎病毒作用. 方法体外培养L-02和 HepG2.2.15细胞,给予不同浓度的拉米夫定和干扰素α2b,作用72 h后,噻唑蓝(MTT) 法检测L-02和 HepG2.2.15细胞的生存率;收集不同浓度的拉米夫定和干扰素α2b处理的HepG2.2.15细胞上清液,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HBsAg、HBeAg的分泌.结果拉米夫定对L-02和 HepG2.2.15有一定的毒性作用,而干扰素α2b对细胞无毒性作用,甚至能促进正常细胞的增殖;拉米夫定对HBsAg和HBeAg的抑制作用大于干扰素α2b,拉米夫定对HBsAg的抑制率较高,而干扰素α2b对HBeAg的抑制率较高.结论拉米夫定和α干扰素联合使用可提高抗HBV的作用和质量.     

转阴灵抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的通过体外实验,探讨转阴灵抗乙肝病毒(HBV)的作用。方法将转阴灵作用于体外培养的2.2.15细胞,以MTT比色法观察转阴灵的细胞毒性,以ELISA法检测细胞培养液中HBsAg和HBeAg的变化,观察药物对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响。结果转阴灵作用于2.2.15细胞8d后,对细胞的半数毒性质量浓度(TC50)为4.5g·L-1,对HBsAg和HBeAg抑制的半数有效质量浓度IC50分别为0.42和0.15g·L-1,转阴灵对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别为10.71和30.00。结论转阴灵在体外细胞培养中对HBsAg和HBeAg的分泌有较好的抑制作用,有显著的抗HBV作用。     

6种黄酮类化合物拮抗肝细胞毒性作用的比较

目的观察芹菜素、木犀草素、白杨素、高良姜素、山奈酚、黄芩素6种结构相近的黄酮类化合物对肝毒性物质诱导的人正常肝细胞株L-02细胞及小鼠原代肝细胞损伤的保护作用,并对其保护肝细胞损伤活性的强弱进行比较及结构分析。方法培养的L-02细胞及小鼠原代肝细胞分别给予10mmol·L~(-1)四氯化碳(CCl_4)、500μmol·L~(-1)牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)、2μmol·L~(-1)川楝素(toosendanin,TSN)和25μmol·L~(-1)千里光碱(senecionine,SENE)诱导细胞凋亡。6种黄酮类化合物(100μmol·L~(-1))分别与细胞预孵15min后,加入肝毒性物质,48h后MTT法检测细胞存活率。结果与空白对照组相比,4种肝毒性药物都能明显降低肝细胞的存活率(P<0.01)。黄酮类化合物处理后,黄芩素和山奈酚能不同程度地提高肝细胞损伤模型组的细胞存活率(P<0.01)。其他4种黄酮类化合物对肝细胞存活率无显著作用。结论黄芩素和山奈酚具有抑制肝毒性物质诱导的L-02细胞和小鼠原代肝细胞毒性的作用,有潜在的抗氧化保肝活性,而芹菜素、木犀草素、白杨素、高良姜素无明显的拮抗肝毒性作用。     

白鲜碱对HepG2细胞的毒性作用及其机制

目的研究白鲜碱的肝细胞毒性作用及其毒性机制。方法白鲜碱2.5～800μmol·L-1与HepG2细胞作用24 h,用MTT法检测细胞存活率并计算IC50值,用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞膜损伤。白鲜碱25～100μmol·L-1与HepG2细胞作用4,24或48 h,用试剂盒方法分别检测细胞培养液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷氨酰转肽酶(GGT)活性。用倒置显微镜观察细胞形态变化;激光共聚焦扫描显微镜检测细胞线粒体膜电位的变化。结果白鲜碱25～800μmol· L-1与HepG2细胞作用24 h对HepG2细胞存活的抑制作用随着浓度的增加而降低(r=0.965,P<0.05),IC50值为(283±27)μmol·L-1。与溶剂对照组相比,白鲜碱12.5～50μmol·L-1作用24 h,HepG2细胞LDH释放率显著升高(P<0.01)。白鲜碱100和200μmol·L-1可引起HepG2细胞形态发生明显变化,细胞皱缩脱落,细胞数目减少,并使HepG2细胞线粒体膜电位下降(P<0.05,P<0.01)。白鲜碱100和200μmol·L-1与HepG2细胞作用24 h可使细胞培养液中ALT和AST活性显著升高,并呈浓度依赖性(r=0.995,P<0.05和r=0.996,P<0.05),线粒体膜电位亦明显下降(r=0.978,P<0.05)。与溶剂对照组相比,白鲜碱100和200μmol·L-1与HepG2细胞作用4 h,细胞培养液中GST活性明显升高(P<0.05);作用24 h,GST活性升高呈浓度依赖性(r=0.987,P<0.05)。白鲜碱200μmol· L-1作用48 h导致HepG2细胞培养液中GGT活性升高(P<0.05)。结论较高浓度的白鲜碱(≥100μmol· L-1)具有潜在的肝毒性,细胞膜损伤和线粒体损伤可能是其肝毒性作用机制之一。     

甘草甜素联合单磷酸阿糖腺苷对HepG 2.2.15细胞及其HBsAg表达的影响

目的探讨甘草甜素联合单磷酸阿糖腺苷对HepG2.2.15细胞株存活率及其HB-sAg表达的影响,评价甘草甜素(GL)与单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)合用体外抗HBV效果。方法利用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞检测细胞培养上清液中的乙肝病毒表面抗原(HBsAg),作为这两种药物联合在体外抗HBV效果的观察指标(以抑制率来表示)。用MTT法检测HepG2.2.15细胞的存活率。结果(1)各药对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率呈药物浓度和时间依赖性;联合组与两个单药组分别比较,抑制HBsAg差异有显著意义(P<0.05或P<0.01)。(2)随着浓度的增加,各药对细胞的存活率均显示抑制作用,尤其联合组高于其它两个单药组。结论GL联合Ara-AMP在体外HepG2.2.15细胞中具有协同抗HBV的作用。     

5-氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体的抗耐药作用及部分机制研究

目的研究5氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体(5FuGCL)体外对耐5FuHepG2细胞株的抑制作用并对其抗耐药机制进行探讨。方法在建立耐5Fu的HepG2细胞株模型的基础上,采用MTT法检测5FuGCL对其的抑制作用。另外,通过高效液相法(HPLC)检测细胞内液的药物含量、免疫组化法检测胸苷酸合酶(TS)的表达、化学法检测NO含量等研究其抗耐药作用机制。结果5FuGCL(75,150,300,600,1200μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞株有明显的抑制作用,IC50为158.6μmol·L-1,远小于游离5Fu(400.9μmol·L-1);5FuGCL(300μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞的抑制作用随时间的延长而增强,其中(24～48h)的抑制作用明显强于相同浓度的游离5Fu。5FuGCL(300μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu比较,能明显增加药物进入HepG2细胞内液的程度;5FuGCL(75,300,1200μmol·L-1)既可明显降低TS的表达,又可显著增加NO的含量,且5FuGCL(300,1200μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu相比,其作用明显增强。结论5FuGCL有明显的抗5Fu耐药作用,这可能是通过增加细胞内液5Fu的含量,抑制TS的表达和增加NO含量实现的。     

硼替佐米对人胃癌SGC-7901细胞uPA、NF-κB表达的影响及与其侵袭力关系

目的硼替佐米对人胃癌SGC-7901细胞uPA、NF-κB表达的影响及与其侵袭力关系。方法 Brdu ELISA法测细胞增殖活性;Boyden小室培养测细胞的迁移率;Western blot测细胞uPA、NF-κB的蛋白水平;细胞免疫化学测NF-κB细胞表达及细胞定位。结果 (1)与对照组(无血清培养基组)相比,10%FCS组细胞增殖活性与迁移率明显增高(P<0.05);与10%FCS组相比,硼替佐米呈浓度依赖性抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖及迁移,硼替佐米浓度为(4μg.L-1),人胃癌SGC-7901细胞增殖活性与迁移率均明显降低(P<0.05);与PDTC组(10μmol.L-1)相比,两者无明显差别;(2)与10%FCS组相比,硼替佐米呈浓度依赖性抑制胃癌SGC-7901细胞uPA、NF-κB蛋白表达,硼替佐米浓度为(4μg.L-1)时uPA、NF-κB蛋白表达均明显降低(P<0.05);与NF-κB特异性抑制剂PDTC组相比,两组uPA、NF-κB表达均无明显差别;硼替佐米浓度为(4μg.L-1)能明显降低NF-κB核蛋白含量,与PDTC组相比,两者无显著差异(P>0.05);(4)细胞免疫化学结果示:硼替佐米(4μg.L-1)抑制10%FCS诱导人胃癌SGC-7901细胞NF-κB核移位。结论①硼替佐米抑制血清诱导胃癌SGC-7901细胞增殖迁移及uPA、NF-κB蛋白表达,②硼替佐米降低胃癌SGC-7901细胞侵袭力可能与其抑制NF-κB活性,降低UPA水平有关。     

氧化苦参碱黄芩苷组合物对HepG2.2.2.15细胞乙肝病毒抗原表达的抑制作用

目的研究氧化苦参碱黄芩苷组合物对HepG2.2.2.15细胞乙型肝炎病毒抗原表达的影响。方法培养HepG 2.2.2.15细胞并在使用药物处理细胞之后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色分析法检测药物对细胞的毒性作用,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测药物对细胞向培养上清液中分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用。结果氧化苦参碱在0.125~1 g.L-1浓度范围内,对HepG 2.2.2.15细胞毒性较小,而2 g.L-1和4 g.L-1的剂量对细胞毒性较大;氧化苦参碱对HBsAg和HBeAg的抑制作用,在0.125~1 g.L-1剂量范围内逐渐增加。黄芩苷在0.625~2 g.L-1浓度范围内,对细胞的毒性作用逐渐增加;黄芩苷对HBsAg和HBeAg的抑制作用,在0.625~1 g.L-1剂量范围内逐渐增加,但是抑制效果明显弱于氧化苦参碱。氧化苦参碱黄芩苷组合物(A~F组)对HepG2.2.2.15细胞株分泌乙肝病毒抗原具有良好的抑制作用,而且对HBeAg的抑制效果优于HBsAg。其中C组氧化苦参碱黄芩苷组合物对乙肝病毒抗原分泌抑制作用优于单独使用氧化苦参碱(HBsAg:P=0.043;HBeAg:P=0.026)。结论氧化苦参碱黄芩苷组合物对HepG 2.2.2.15细胞株分泌乙肝病毒抗原有良好的协同抑制作用。     

酒精对HBV转基因小鼠肝脏的损伤作用及其机制

目的探讨在肝损伤早期酒精和HBV协同作用的分子机制。方法20只HBV转基因小鼠和20只普通小鼠随机分为4组:转基因小鼠酒精组(alcohol-fed Tg mice)和普通小鼠酒精组(alcohol-fed Wt mice),以白酒灌胃;转基因小鼠对照组(control Tg mice)和普通小鼠对照组(control Wtmice),以生理盐水灌胃。连续处理10wk后检测各组小鼠血清ALT、AST水平,肝组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、Smad7、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达水平及TGF-β1、CTGF、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平。结果酒精可升高转基因小鼠血清ALT、AST水平,诱发其肝脏病理损伤,但纤维化不明显;肝组织TGF-β1、Smad3、Smad7、CTGF mRNA及TGF-β1、CTGF、α-SMA蛋白表达增加。结论酒精和HBV对肝损伤协同作用的机制可能与TGF-β1、Smad3、CTGF、α-SMA表达增加以及TGF-β1/Smads通路信号分子表达比例失调有关。     

The human liver-uPA-SCID mouse: a model for the evaluation of antiviral compounds against HBV and HCV

The study of the hepatitis B virus (HBV) and the hepatitis C virus (HCV) has long been hampered by the lack of a suitable small animal model. Both viruses could only be studied in humans or in chimpanzees. Recently, a new chimeric mouse model was developed that was permissive for HBV and HCV infection. In this model, uPA+/+-SCID mice, suffering from a transgene-induced liver disease, are transplanted early after birth with primary human hepatocytes. These human hepatocytes integrate in the parenchyma and progressively repopulate the diseased mouse liver without losing their normal metabolic functions. Successfully transplanted mice can then be infected with HBV and HCV. In this review, we describe the characteristics of this chimeric mouse model in more detail and give an overview of how this model has already contributed to the development of new antiviral compounds for the treatment of viral hepatitis.     

Humanized murine model for HBV and HCV using human induced pluripotent stem cells

Infection of hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV) results in heterogeneous outcomes from acute asymptomatic infection to chronic infection leading to cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). In vitro models using animal hepatocytes, human HCC cell lines, or in vivo transgenic mouse models have contributed invaluably to understanding the pathogenesis of HBV and HCV. A humanized mouse model made by reconstitution of human primary hepatocytes in the liver of the immunodeficient mouse provides a novel experimental opportunity which mimics the in vivo growth of the human hepatocytes. The limited access to primary human hepatocytes necessitated the search for other cellular sources, such as pluripotent stem cells. Human embryonic stem cells (hESCs) have the features of self-renewal and pluripotency and differentiate into cells of all three germ layers, including hepatocytes. Humaninduced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from the patient’s or individual’s own cells provide a novel opportunity to generate hepatocyte-like cells with the defined genetic composition. Here, we will review the current perspective of the models used for HBV and HCV study, and introduce the personalized mouse model using human iPSCs. This novel mouse model will facilitate the direct investigation of HBV and HCV in human hepatocytes as well as probing the genetic influence on the susceptibility of hepatocytes to HBV and HCV.     

Non-cytolytic antigen clearance in DNA-vaccinated mice with electroporation

Aim： To explore the potential of electroporation （EP）-mediated hepatitis B virus （HBV） DNA vaccination for the treatment of chronic HBV infection. Methods： BALB/c mice were vaccinated with HBV DNA vaccine encoding for the HBV preS2-S antigen, combined with or without EP. HBV surface antigen expression plasmid was administered into mice liver via a hydrodynamic injection to mimic HBV infection. The clearance of antigen in the serum and liver was detected by ELISA assay and immunohistochemical staining. The histopathology of the liver tissues was examined by HE staining and serum alanine aminotransferase assay. Results： The immunogenicity of HBV DNA vaccine encoding for the HBV preS2- S antigen can be improved by EP-mediated vaccine delivery. The elicited immune responses can indeed reduce the expression of HBV surface antigen （HBsAg） in hepatocytes of the mouse model that was transfected to express HBsAg using the hydrodynamic injection method. The antigen clearance process did not cause significant toxicity to liver tissue, suggesting a non-cytolytic mechanism. Conclusion： The EP-aided DNA vaccination may have potential in mediating viral clearance in chronic hepatitis B patients.     

Effective metabolism and long intracellular half life of the anti-hepatitis B agent adefovir in hepatic cells

Adefovir dipivoxil (ADV) is esterolytically cleaved to the 2'-deoxyadenosine monophosphate (dAMP) analog adefovir, subsequent phosphorylation leads to the formation of the anti-Hepatitis B virus (HBV) agent adefovir-DP. To better understand the mechanism of action of ADV, metabolism studies were done in Hep G2, Huh-7 and primary human hepatocytes. Separation of radiolabeled adefovir metabolites after incubation in Hep G2 cells suggested that adefovir in its mono- and di-phosphorylated forms are the only metabolites formed from adefovir. Incubation of 10 microM adefovir with hepatic cell lines and fresh monolayers of primary human hepatocytes from two donors and analysis of intracellular metabolites by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry resulted in adefovir-DP levels of approximately 10 pmol/million cells. Adefovir was more efficiently phosphorylated in primary hepatocytes than cell lines with adefovir-DP accounting for 44% versus 26% of total intracellular adefovir after 24 h. Egress studies showed adefovir-DP to have a half-life of 33 +/- 3 h, 10 +/- 1 h, 48 +/- 3 h and 33 +/- 2 h in Hep G2, Huh-7, and primary hepatocytes from two separate donors, respectively. The markedly shorter half-life in Huh-7 cells was inferred to be transport dependent based on its sensitivity to the transport inhibitor MK-571. Effective phosphorylation coupled with a long intracellular half-life and small competing dATP pool sizes in primary hepatocytes forms the cellular metabolic basis for the efficacy of adefovir dipivoxil in the treatment of chronic hepatitis B.     

昆明种乳鼠肝细胞原代培养方法的比较研究

目的 通过比较3种昆明鼠乳鼠肝细胞原代培养的方法,探索一种更有效、快捷的原代培养方法。方法 取30只1~3日龄昆明种乳鼠,随机分为3组,分别采用组织块培养法、胰酶消化法、组织块联合胰酶消化法进行肝细胞原代培养,用倒置显微镜观察实验过程中肝细胞的形态及生长情况。结果 3种方法均能进行乳鼠肝细胞的原代培养,其中组织块联合胰酶消化法培养的肝细胞形态学和生物学特性优于其他两种方法培养的细胞。结论 组织块联合胰酶消化法是3种方法中最快速和高效的一种方法,获得的乳鼠肝细胞形态及生物学特性好,为体外建立乳鼠肝细胞实验模型奠定了实验基础。     

肝组织HBV DNA定量检查的临床意义

目的 由于对ＨＢＶ感染的认识正在不断深入，抗病毒治疗急待寻找判定效果的可靠方法，ＨＢＶ ＤＮＡ检测，特别是血液和肝组织定量检测显得极为重要。方法 在ＨＢＶ感染者作肝活检时随机留取小粒肝组织，同时采血作ＨＢＶ ＤＮＡ定量检查。结果 急慢性ＨＢＶ感染病例均示肝组织内ＨＢＶ ＤＮＡ检查明显高于血内检出率，同时肝组织ＨＢＶ含量明显高于血液内含量。结论 肝组织检测ＨＢＶ ＤＮＡ可以明显提高ＨＢＶ感染诊断率，血内ＨＢＶ ＤＮＡ阴转时不能说明肝组织内亦已阴转，血内ＨＢＶ ＤＮＡ阴转不宜随即停止治疗。     

鲨肝刺激物质降血糖作用机制的研究

目的 :研究鲨肝刺激物质的降血糖作用机制。方法 :采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型 ,观察鲨肝刺激物质对糖尿病小鼠空腹血糖、果糖胺、胰岛素、肝糖原、己糖激酶、过氧化脂质等生化指标的影响。采用离体培养原代小鼠肝细胞 ,研究鲨肝刺激物质对四氯化碳、对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用。结果 :鲨肝刺激物质显著降低糖尿病小鼠空腹血糖和果糖胺水平 ,增加血清胰岛素、肝糖原含量 ,提高己糖激酶活性 ,减轻四氯化碳、对乙酰氨基酚对原代小鼠肝细胞的损伤。结论 :鲨肝刺激物质降血糖作用机制与保护胰岛和肝细胞功能、提高己糖激酶活性、促进肝糖原合成和抗氧化损伤作用密切相关