铜对低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

 【目的】探讨铜体外抗低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元（CGNs）凋亡作用及其机制。【方法】体外培养乳鼠的CGNs并用去极化诱导凋亡模型；噻唑兰（MTT）法检测细胞存活率；相差显微镜及Hoechst 33258染色分别观察细胞及其核形态学变化；流式细胞仪（FCM）检测亚二倍体峰。【结果】1~40 μmol/L的铜可抗低钾所致的大鼠CGNs凋亡，明显提高CGNs的存活率。铜（20 μmol/L）显著减少低钾所致的大鼠CGNs胞体皱缩、细胞核固缩和亚二倍体峰等凋亡特征。铜的神经保护作用可以持续72 h以上。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinane，PI3-K）抑制剂LY294002可阻断铜的保护作用。【结论】首次发现，一定浓度范围的铜对低钾所致的大鼠CGNs凋亡有保护作用，PI3-K/ Akt信号传导通路可能参与其保护作用。     

LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响

【目的】观察磷酸肌醇3位羟基激酶(PI3-K)的特异性阻断剂LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元(CGN)凋亡的影响。探讨磷酸肌醇3位羟基激酶/AKT(PI3-K/AKT)信号转导通路是否参与了热预处理的保护作用及其机制。【方法】以低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡为模型。用相差显微镜观察形态学,DNA琼脂糖凝胶电泳和Hoechst33258核染色分析神经元凋亡,二乙酸荧光素(FDA)染色法检测细胞的存活率。蛋白质印迹(Westernblot)法检测蛋白的表达。【结果】热预处理(44℃,1h)可以保护低钾诱导的CGN的凋亡,使神经元存活率由(33.2±4.1)%上升至(76.1±5.6)%(P <0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体减少,DNA凝胶电泳DNA梯状条带明显减弱。LY294002(20μmol/L)可以明显抑制热预处理的保护作用,使神经元的存活率降至(37.4±3.5)%(P<0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体,DNA凝胶电泳出现梯状条带。热预处理可使HSP70、磷酸化AKT增高。LY294002可以抑制磷酸化AKT(p-AKT)的增加,而对HSP70则无明显影响。【结论】在低钾诱导CGN凋亡的模型中,LY294002可以抑制热预处理的抗凋亡作用,并可抑制p鄄AKT的增加,显示PI3鄄K/AKT信号转导通路参与了热预处理的保护作用,但该抑制作用可能不是通过抑制热休克蛋白(HSP)70的表达引起。     

p38 MAPK抑制剂通过抑制JNK活性抑制培养的小脑颗粒神经元凋亡

【目的】研究特异性p38分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）抑制剂SB203580对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用。【方法】把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子（KCl25mmol*L-1）的培养基中转移至低钾培养基（KCl5mmol*L-1）中诱导神经元凋亡。凝胶电泳分析DNA片段,SAPK/JNK分析盒测定c-JunN-末端蛋白激酶(JNK)活性。【结果】低钾诱导小脑颗粒神经元的具有典型形态学和生化特征的凋亡。特异性的p38MAPK抑制剂SB203580通过抑制细胞凋亡,促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元存活。这种保护作用具有浓度依赖性。培养于低钾环境中的颗粒神经元,c-Jun表达和磷酸化水平升高了,且激活了JNK活性。当小脑颗粒神经元生长在含SB20358025μmol*L-1的低钾培养基中,c-Jun表达、磷酸化水平和JNK活性都明显降低。【结论】SB203580抑制JNK活性,降低c-Jun的磷酸化而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用。     

JNK抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

【目的】研究特异性c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用。【方法】把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子(KCl 25mmol／L)的培养基中转移至低钾培养基(KCl 5mmol／L)中诱导神经元凋亡。以Western blot法检测JNK和c-Jun的磷酸化水平。【结果】低钾(KCl 5mmol／L)磷酸化并激活JNK，诱导c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡。SP600125通过抑制c-Jun磷酸化而浓度依赖性地促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元的存活。其保护作用的半数有效量(ED50)为1．01μmol／L。【结论】SP600125通过特异性地抑制JNK活性而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用；提示JNK是介导低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关键激酶，它可能可以作为干扰神经元凋亡的药物的作用靶点。     

ATM失活诱导GADD45α依赖的小脑颗粒神经元凋亡

【目的】探究共济失调毛细血管扩张突变（ATM）激酶失活诱导神经元凋亡的具体分子机制。【方法】体外成熟7 d的小脑颗粒神经元（CGNs）分别用含25 mmol/L KCl(25 K)培养基、5 mmol/L KCl(5 K)培养基和含ATM特异性抑制剂（Ku55933,10μmol/L;Ku60019,15μmol/L）的25 K培养基后进行免疫印迹检测ATM、Caspase3、Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平或培养8 h后进行Hoechst染色分析。在C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA,q-PCR和免疫印迹验证其干扰效率。体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染ATM特异性siRNA和pCMVEGFP 48 h后进行Hoechst染色和凋亡分析。体外成熟7 d的CGNs用含ATM特异性抑制剂的25 K培养基培养8 h后进行全转录组测序、差异表达基因鉴定和通路富集分析。体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染GADD45α特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h,用含15μmol/L Ku6的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理8 h后...     

乙酰水杨酸铜对HCT-116细胞生长的抑制及诱导凋亡作用

目的 研究乙酰水杨酸铜对HTC-116细胞生长的抑制及诱导凋亡作用，探讨其抗肿瘤作用的机制。方法 采用MTT法检测乙酰水杨酸铜对HTC-116细胞的毒性作用；荧光显微镜照相及流式细胞术检测乙酰水杨酸铜诱导HTC-116细胞凋亡的作用。结果 乙酰水杨酸铜处理HTC-116细胞48h、72h的IC50值分别为6．10μmol／L和4．48μmoL／L；10μmol／L乙酰水杨酸铜处理HTC-116细胞24h镜下可见核分裂及凋亡小体形成，处理48h流式细胞术可检测出明显的亚二倍体峰，凋亡率达34．1％。细胞凋亡发生呈剂量和时间依赖性。结论 乙酰水杨酸铜可显著抑制HTC-116细胞生长并诱导其凋亡。     

藁本内酯对低钾大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

目的 探讨藁本内酯(ligustilide, LIG)对原代培养小脑颗粒神经元细胞(cerebellar granule neurons, CGN）低钾性凋亡的影响。方法 建立低钾诱导体外培养新生大鼠CGN凋亡模型,将CGN分为对照组、模型组、CGP54626+LIG组及LIG组,分别进行给药处理;采用噻唑兰 (MTT) 法检测各组细胞存活率,Western blot检测胰岛素样生长因子1（IGF-1）信号通路中主要效应分子IGF-1R、Akt、ERK1/2、CREB及caspase 3的蛋白表达水平。 结果 LIG（2.5~20 μmol/L） 可浓度依赖性抑制大鼠 CGN的低钾性凋亡、提高其存活率; 20 μmol/L LIG 可显著上调IGF-1R、Akt、ERK1/2 和CREB 的磷酸化水平,下调 cleaved-caspase 3 的表达水平;同时,LIG上述效应均可被γ-氨基丁酸代谢型受体（GABAB）的选择性拮抗剂 CGP54626 所阻断。结论 LIG 对低钾所致大鼠CGN凋亡有保护作用,其机制可能与激活GABAB受体及其下游的 IGF-1 信号通路有关。     

银杏内酯B对谷氨酸诱导视网膜神经细胞凋亡的影响

【目的】探讨银杏内酯B拮抗谷氨酸诱导的体外培养新生大鼠视网膜神经细胞凋亡作用及其可能的机制。【方法】MTT法检测不同浓度谷氨酸对原代培养sD大鼠视网膜神经细胞的兴奋性毒性作用。细胞分为正常组、谷氨酸组和不同浓度（10、50、100μmol／L）银杏内酯B治疗组（n=6）。MTT法检测不同浓度的银杏内酯B对谷氨酸诱导凋亡的视网膜神经细胞存活率的影响。流式细胞仪结合AnnexinV／PI检测细胞凋亡率，JC-1染色检测线粒体膜电位。【结果】100μmol／L谷氨酸作用下，视网膜神经细胞的吸光度值降低至0．50&#177;0．07，凋亡率为52．4％，JC-1的红／绿比值为1．77。10～100μmol／L银杏内酯B作用下神经细胞的吸光度值分别为0．52&#177;0．09、0．64&#177;0．15和0．74&#177;0．11，细胞的凋亡率分别下降至36．7％，12．4％和2．1％，JC-1的红／绿比值则分别上升为1．898、2．089、2．276（P〈0．05）。【结论】银杏内酯B可以拮抗谷氨酸诱导的视网膜神经细胞凋亡。其作用机制可能与提高线粒体膜机能有关。     

嘌呤受体P2X7激活介导大鼠视网膜神经节细胞死亡的实验研究

 【目的】研究嘌呤受体P2X7激动剂、拮抗剂对大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的影响。【方法】（1）对新生Long-Evan大鼠进行上丘注射荧光标记物Aminostilbamidine以标记RGCs。检测P2b激动剂BzATP（0、50、100、500μmol／L）和特异性拮抗剂OxATP（100μmol／L）对体外培养RGCs存活率的影响；（2）体外培养未经Aminostilbamidine标记的新生大鼠RGCs，以10μmol／L钙离子（Ca^2＋）荧光染料Fura-2标记后。利用Ca^2＋影像测定仪分别测定P2X7激动剂BzATP（50μmol／L）和拮抗剂OxATP（100μmol／L）对RGCs胞内Ca^2＋浓度的影响。【结果】P2X7受体激动剂BzATP可引起体外培养的RGCs死亡，反应呈剂量依赖性，EC50=35μmol／L。在50μmol／L浓度下，BzATP约杀死30％的RGCs；而100μmol／L OxATP则可明显减轻BzATP对RGCs的毒性作用，使RGCs存活率从77％±4％提高至96％±3％（P〈0．001）。BzATP可引起RGCs胞内Ca^2＋持续升高，在50μmol／L浓度下可使胞内Ca^2＋升高（1022±113）nmol／L。在OxATP作用下，BzATP介导的Ca^2＋升高幅度显著降低，仅升高（63±13）nmol／L（P〈0．001）。【结论】嘌呤能P2X7受体激活可导致大鼠视网膜神经节细胞死亡和胞内钙离子浓度升高。     

ATP敏感钾通道在硫化氢钠对抗β-淀粉样肽诱导细胞损伤中的作用

【目的】探讨ATP敏感性钾通道（KATP）在硫化氢（H2s）对抗β-淀粉样多肽（Aβ）诱导嗜铬细胞瘤细胞（PCI2）细胞损伤中的作用。【方法】应用硫化氢钠（NaHS）作为H2S的供体，碘化丙啶（PI）染色流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡率，Hoechst染色检测细胞凋亡的形态学变化，罗丹明123（Rh123）染色FCM检测细胞线粒体膜电位（MMP），双氢罗丹明123染色FCM检测细胞内活性氧（ROS）的含量。【结果】20μmol／L和40μmol／LAβ25-35能明显地诱导PC12细胞凋亡，增加细胞凋亡率．并能明显地抑制PC12细胞MMP及增加细胞内ROS生成；100mol／L和200μmol／LNaHS本身不损伤PC12细胞。但能明显地抑制Aβ25—35的致细胞凋亡作用，降低PC12细胞的凋亡率，并能显著地抑制Aβ25-35引起的MMP降低及胞内ROS水平增多；在应用NariS与Aβ25-35作用PC12细胞之前30min，应用KATP抑制剂Glybenclamide（Gly）（10μmol／L）对PC12细胞进行预处理，能部分地对抗NaHS的细胞保护作用．使PCI2细胞凋亡率增加，MMP降低及ROS生成增多。【结论】NaHS能明显对抗Aβ25-35对PC12细胞的损伤作用，此细胞保护作用可能与NaHS保护PC12细胞的MMP及抑制胞内ROS生成有关；KATP通道抑制剂Gly能部分地阻断NaHS的细胞保护作用。提示KATP通道开放可能是NaHS对抗Aβ25-35损伤作用的机制之一。     

嘌呤受体P2X7激活谷氨酸受体NMDA引起视网膜神经节细胞凋亡

 【目的】研究嘌呤受体P2X7和谷氨酸受体NMDA激活诱导大鼠视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的相互作用机制。【方法】①对新生Long-Evan大鼠进行上丘注射荧光标记物Aminostilbamidine标记RGC,NMDA受体通道拮抗剂MK-801、APV和Memantine分别与P2X7受体激动剂BzATP共培养,检测它们对体外培养RGC存活率的影响;②未经Aminostilbamidine标记的新生大鼠RGC,以10μmol/L钙离子（Ca^2＋）荧光染料Fura-2标记后,利用Ca^2＋影像测定仪分别测定BzATP及三种NMDA拮抗剂对RGC胞内Ca^2＋浓度的影响。【结果】（1）三种NMDA拮抗剂均分别不同程度阻断BzATP引起的RGC凋亡。BzATP在50μmol/L浓度下,约杀死（36%±2%）的RGC,而MK-801（10μmol/L）、APV（100μmol/L）和Memantine（100μmol/L）则均可明显减轻BzATP对RGC的毒性作用,使RGC存活率分别提高至（96%±4%,P〈0.001）、（80%±5%,P=0.010）和（76%±9%,P=0.144）。（2）BzATP可引起RGC胞内Ca^2＋持续升高,在50μmol/L浓度下可使胞内Ca^2＋升高至（1183±109）nmol/L。而MK-801（10μmol/L）、APV（300μmol/L）和Memantine（30μmol/L）则均可显著降低BzATP介导的Ca^2＋升高幅度,分别为（76%±7%,P=0.003）、（51%±17%,P=0.033）和（55%±16%,P=0.025）。【结论】NMDA受体拮抗剂可阻断嘌呤受体P2X7激活诱导的RGC凋亡。P2X7受体和NMDA受体通道激活可能共同介导着兴奋性神经毒作用且P2X7在NMDA受体的上一环节先起作用。     

嘌呤受体P2X7激活谷氨酸受体NMDA引起视网膜神经节细胞凋亡

【目的】研究嘌呤受体P2X7和谷氨酸受体NMDA激活诱导大鼠视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的相互作用机制。【方法】①对新生Long-Evan大鼠进行上丘注射荧光标记物Aminostilbamidine标记RGC,NMDA受体通道拮抗剂MK-801、APV和Memantine分别与P2X7受体激动剂BzATP共培养,检测它们对体外培养RGC存活率的影响;②未经Aminostilbamidine标记的新生大鼠RGC,以10μmol/L钙离子（Ca^2＋）荧光染料Fura-2标记后,利用Ca^2＋影像测定仪分别测定BzATP及三种NMDA拮抗剂对RGC胞内Ca^2＋浓度的影响。【结果】（1）三种NMDA拮抗剂均分别不同程度阻断BzATP引起的RGC凋亡。BzATP在50μmol/L浓度下,约杀死（36%±2%）的RGC,而MK-801（10μmol/L）、APV（100μmol/L）和Memantine（100μmol/L）则均可明显减轻BzATP对RGC的毒性作用,使RGC存活率分别提高至（96%±4%,P〈0.001）、（80%±5%,P=0.010）和（76%±9%,P=0.144）。（2）BzATP可引起RGC胞内Ca^2＋持续升高,在50μmol/L浓度下可使胞内Ca^2＋升高至（1183±109）nmol/L。而MK-801（10μmol/L）、APV（300μmol/L）和Memantine（30μmol/L）则均可显著降低BzATP介导的Ca^2＋升高幅度,分别为（76%±7%,P=0.003）、（51%±17%,P=0.033）和（55%±16%,P=0.025）。【结论】NMDA受体拮抗剂可阻断嘌呤受体P2X7激活诱导的RGC凋亡。P2X7受体和NMDA受体通道激活可能共同介导着兴奋性神经毒作用且P2X7在NMDA受体的上一环节先起作用。     

牛膝多肽对NMDA诱导的大鼠原代视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的：探讨牛膝多肽（ABPP）对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的体外培养大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）损伤的保护作用。方法：采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养,随机分为对照组、NMDA组、ABPP＋NMDA组[按ABPP不同药物质量浓度（0.1、0.3、1.0、3.0μg/ml）设4个亚组]和地西平（MK-801）＋NMDA组。采用倒置显微镜观察细胞形态;抗Thy-1.1细胞免疫荧光染色鉴定培养细胞中RGCs纯度;MTT比色法测定细胞存活率;Hoechst/PI双染色法定性观察细胞凋亡;流式细胞术AnnexinV/PI双染色法定量测定细胞凋亡率。结果：NMDA可诱导大鼠视网膜神经节细胞凋亡,与NMDA组比较,0.3μg/ml ABPP可提高RGCs存活率,减少细胞凋亡（P〈0.05）。结论：ABPP可抑制NMDA诱导的视网膜神经节细胞凋亡,保护视网膜神经元。     

姜酚肟对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用

【目的】探讨姜酚肟对谷氨酸（glutamate，Glu）诱导PC12细胞损伤的保护作用。【方法】体外培养PCI2细胞，建立谷氨酸诱导PC12细胞损伤的模型；采用MTT法检测细胞活力，流式细胞术和Hoechst 33258 DNA染色法检测细胞凋亡。【结果】经5mmol／L的谷氨酸处理24h后，PC12细胞活力比对照组降低，仅为对照组的58．3％。在一定浓度范围内，姜酚肟能保护PC12细胞免受谷氨酸（5mmol／L）的影响，但较高浓度时对细胞有一定的毒性。经不同浓度姜酚肟（3.125、6．25、12．5、25μg／mL）预处理后，细胞活力明显提高，其保护作用随浓度降低而升高，当浓度为6．25μg／mL时效果最好，使PC12细胞的存活率达到75．2％（P〈0．01），浓度为3．125μg／mL时，细胞存活率降为70．2％（P〈0．01）。谷氨酸（5mmol／L）能诱导PCI2细胞凋亡，处理24h后细胞凋亡率为20．1％，经姜酚肟（3．125、6．25、12．5、25μg／mL）预处理后，细胞凋亡率明显降低，分别为3．5％（P〈0．01），2．8％（P〈O．01），9．6％（P〈0．01），17．7％（P〈0．05）。【结论】谷氨酸能诱导PCI2细胞凋亡，较低浓度的姜酚肟能有效保护PC12细胞免受谷氨酸诱导的细胞损伤。其中6．25μg／mL的姜酚肟效果最好。     

SIRT1/p66Shc介导小檗碱对阿霉素诱导心肌毒性拮抗作用研究

【目的】基于细胞水平观察小檗碱对阿霉素诱导心肌细胞沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)/p66Shc通路的影响,探讨小檗碱抗阿霉素所致心肌毒性作用的机制。【方法】应用阿霉素（1μmol/L）处理人心肌细胞系AC16建立阿霉素心肌毒性模型。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定细胞存活率,二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）染色荧光显微镜照像测定细胞活性氧簇（ROS）水平,罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像测定线粒体膜电位（MMP）,荧光染料Rhod2-AM（分子探针）测定线粒体Ca2+浓度（[Ca2+]m）,蛋白免疫印迹（Western Blot）法测定细胞SIRT1、p66Shc及凋亡蛋白Bax的表达水平。【结果】用1μmol/L小檗碱预处理可明显抑制1μmol/L阿霉素引起的AC16心肌细胞毒性作用,使细胞存活率升高,表现为抑制阿霉素引起的细胞内ROS生成增多、抑制阿霉素致细胞凋亡（使凋亡蛋白Bax表达下调）和减轻线粒体损伤。阿霉素处理的AC16心肌细胞中p66Shc表达增强且SIRT1蛋白表达下降;预先加用小檗碱组中,阿霉素上调p66Shc及下调SIRT1表达的效应显...     

Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01／04增殖抑制的作用机制

 【目的】研究thapsigargin（TG）对体外培养的人品状体上皮细胞系SRA01／04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】不同浓度TG处理SRA01／04细胞72h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17／19ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】MTT法测得TG为0．325～5μmol／L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0．8μmol／L；透射电镜显示TG处理SRA01／04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成；流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0．1，0．5，1，10μmol／L分别处理SRA01／04细胞72h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性；TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加，TG为10μmol／L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01／04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对丙烯酰胺致小脑颗粒神经元凋亡的影响

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对丙烯酰胺(ACR)致小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的保护作用。方法:体外培养的CGNs经不同浓度EGCG(5,10,25,50,100μmol/L)预处理48h后,加入ACR(5mmol/L)染毒24 h,用四甲基偶氮唑盐(M)比色法检测细胞存活率,测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)的含量,Hochst33342荧光显微镜染色观察凋亡时细胞核形态的变化,RT-PCR检测细胞bcl-2 mRNA与bax mRNA表达情况。结果:同ACR损伤组比较,终浓度为10,25,50μmol/L的EGCG能减轻ACR引起的CGNs的损伤,明显提高细胞的存活率(P<0.05),SOD活性增高,MDA含量降低。Hoechst33342染色发现细胞核固缩、致密浓染现象较ACR损伤组改善明显,bcl-2mRNA表达增强,bax mRNA表达减弱,bcl-2/bax比值降低(P<0.05),25μmol/LEGCG组保护效果最佳(P<0.01),而终浓度为100μmol/LEGCG组无明显保护作用。结论:EGCG在一定剂量范围内对ACR引起的CGNs凋亡有保护作用。     

Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01／04增殖抑制的作用机制

【目的】研究thapsigargin（TG）对体外培养的人品状体上皮细胞系SRA01／04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】不同浓度TG处理SRA01／04细胞72h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17／19ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】MTT法测得TG为0．325～5μmol／L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0．8μmol／L；透射电镜显示TG处理SRA01／04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成；流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0．1，0．5，1，10μmol／L分别处理SRA01／04细胞72h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性；TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加，TG为10μmol／L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01／04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。     

分泌型磷脂酶 A2非酶活性依赖的神经元保护作用

【目的】鉴定中华眼镜蛇(Najanajaatra)蛇毒中的神经保护因子,研究其抗神经元凋亡作用机制。【方法】连续柱层析法分离、纯化蛇毒神经保护因子。用EdmanN-末端测序法取得蛋白质一级序列,BLAST软件进行蛋白质鉴定。使用低钾诱导体外培养小脑颗粒神经元凋亡模型,研究其神经元保护作用。【结果】从中华眼镜蛇蛇毒中分离出一种,可浓度依赖性地抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。神经保护因子(Cobravenomneu-ronalprotectivefactor,CVNPF)此神经保护因子N-末端20个氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSRSWWD-,BLAST序列同源比对确定该保护因子为中华眼镜蛇分泌型磷脂酶A2(secretedphospholipaseA2,sPLA2)。进一步发现来源于蜂毒、莫桑比克眼镜蛇(Njajanajamossambica)蛇毒、西部菱斑响尾蛇(Crotalusatroxalso)蛇毒的sPLA2也对小脑颗粒神经元具有保护作用;其作用不为磷脂酶A2酶活性抑制剂7,7-Dimethyleicosadienoicacid(DEDA)和Manoalide阻断。【结论】CVNPF属于sPLA2。多种sPLA2可以抗神经元凋亡,其保护机制与磷脂酶A2的酶活性无关。     

海洋甾体YC-1抑制低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元的凋亡

【目的】观察海洋甾体YC 1对低钾 (5mmol/L ,lowK )诱导小脑颗粒神经元凋亡的影响 ,并对其机制进行初步探讨。【方法】小脑颗粒神经元原代培养 ;采用二乙酸荧光素 (fluoresceindiacetate ,FDA)和Hoechst 332 5 8DNA染色法观察神经元存活率及形态学特征 ;用琼脂糖凝胶电泳分析神经元死亡的生化特征。【结果】低钾引起小脑颗粒神经元凋亡。Hoechst332 5 8DNA染色表现出染色体固缩 ,DNA凝胶电泳表现出由大小不一的断裂DNA片段形成的“梯形”条带。YC 1(1 2 5～ 2 0 μmol/L)呈时间和剂量依赖性地抑制上述现象的出现。蛋白质合成抑制剂放线菌酮 (cycloheximide)不能改变由不同孵育时间造成的YC 1对神经元不同保护效果的差异。【结论】YC 1抑制低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡 ,YC 1的这一作用可能属于一非基因效应。