fliR基因与问号钩端螺旋体黏附及损伤细胞功能相关性的研究

目的：了解问号钩端螺旋体（简称钩体）fliR基因的致病性。方法：分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒，并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株，并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定。采用小鼠单核-巨噬细胞J774A．1黏附试验和流式细胞术，检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601^fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601^siRNA-R2株黏附细胞，及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化。结果：所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．9％和100％，所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同。56601^fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长，PCR和测序结果证实56601^fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因。56601“睢‰“株fliR基因mRNA水平明显下降（P〈0．01），56601”RNA。砣株fliR基因mRNA水平也低于野生株（P〈0．05）。56601^fliR-Kana和56601^siRNA-R2黏附J774A．1细胞的能力基本消失，诱导J774A．1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱（P〈0．01）。结论：fliR基因是问号钩体毒力相关基因，其功能与问号钧体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关。     

问号钩端螺旋体主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究

目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)主要外膜蛋白OmpL1、LipL32和LipL41免疫功能表位及其致炎作用.方法:建立Ni-NTA亲和层析法,提取不同基因型表达的目的重组蛋白rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2.采用SDS-PAGE检测上述目的重组蛋白的表达情况和提取物纯度.分别采用Signal P3.0预测服务器Signal P-NN软件、Propred MHC class-Ⅱ binding peptide prediction-ProPred预测服务器EMBOSS软件,对上述蛋白的信号肽、MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位进行分析.以人脐静脉内皮细胞株EVC-304为效应细胞,采用ELISA检测上述目的重组蛋白诱导人脐静脉内皮细胞EVC-304分泌IL-1、IL-8和TNF-α的作用.结果:在IPTG诱导下,所构建的原核表达系统可有效表达rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2,其产量分别约占细菌总蛋白的30%和15%、40%和35%、15%和10%.提纯后的目的重组蛋白SDS-PAGE后均仅见单一的蛋白条带.OmpL1s、LipL32/1和LipL32/2、LipL41s的信号肽分别位于N端1-24、1-21和1-24、1-24位氨基酸残基.OmpL1s、LipL32s和LipL41s分别有2、2和1个相同的主要MHC-Ⅱ结合肽和B细胞表位,其中OmpL1/2另有1个主要MHC-Ⅱ等位基因结合肽和B细胞表位(59-78).不同浓度的OmpL1s、LipL32s和LipL41s均可明显促进人静脉内皮细胞株EVC-304合成并分泌IL-1α、IL-8和TNF-α(P<0.05).其中IL-1α水平以作用24 h时最高,然后下降;IL-8和TNF-α水平则作用48 h高于24 h.结论:问号钩体ompL1/1、lipL32或lipL41不同基因型的表达产物均存在相似的MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位.rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2对EVC-304细胞均有直接的致炎作用.     

问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞FasL/Fas表达上调及FasL/Fas相关细胞凋亡的研究

目的：了解FasL／Fas途径参与问号钩端螺旋体（简称钩体）诱导细胞凋亡及其FasL／Fas表达水平变化。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核一巨噬细胞J774A．1模型。采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征，流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法，观察问号钩体56601株感染细胞FasL／Fas表达情况。采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL／Fas表达水平。结果：问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h时，部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象；感染24h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解。问号钩体56601株感染J774A．1细胞4h和24h的凋亡率分别为53．6％和64．31％。FasL中和抗体预处理细胞后，问号钩体56601株感染细胞4h或24h的凋亡率分别为10．27％和15．90％。J774A．1细胞被问号钩体56601株感染后4和24h，FasL表达率分别从感染前的4．19％上升至21．69％和65．70％，Fas表达率分别从感染前的12．88％上升至91．96％和88．01％。结论：诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A．1细胞的重要机制。问号钩体可上调靶细胞FasI。／Fas表达水平；并通过FasL／Fas途径诱导J774A．1细胞凋亡。     

问号钩端螺旋体致病机制和新型疫苗及细菌耐药性研究进展

钩端螺旋体（简称钩体）病是重要的人兽共患传染病之一，但其致病机制至今不明，目前也无可预防所有问号钩体血清群、型感染的通用型疫苗。细菌耐药性一直是医学微生物学和传染病学关注的重大问题之一，近年发现二元信号传导系统（TCS）与某些细菌耐药性密切相关。根据近年国内外有关研究资料，文中就问号钩体致病物质及其作用机制、相关信号传导通路及其致病意义，以及TCS在肺炎链球菌对青霉素和头孢胺噻耐药性形成、结核分枝杆菌对异烟肼和乙胺丁醇耐药性影响的最新研究进展进行简要介绍。     

问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞凋亡及caspase-3、-6活化对凋亡的影响

目的：了解问号钩端螺旋体（钧体）诱导小鼠单核巨噬样细胞（J774A．1）凋亡的作用，以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响。方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A．1细胞感染模型。采用FITC—AnnexinV／PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况。分别采用荧光比色法和Western Blot，检测感染细胞caspase-3、-6活性及其底物（PARA和LaminA／C）剪切情况。结果：多种不同浓度的问号钩体赖株感染均可使J774A．1细胞发生凋亡，其中以问号钩体：细胞=100：1的比例感染时凋亡率最高（48．81％&#177;5．950o）。感染细胞caspas-3和-6最大活性分别为（1453．41&#177;36．07）FU和（618．65&#177;39．82）FU，是未感染细胞的16．38和9．98倍。感染细胞的PARP和LaminA／C均被剪切。Caspase-3、-6抑制剂对问号钩体赖株诱导的J774A．1细胞凋亡有明显的阻断作用。结论：问号钩体可诱导J774A．1细胞凋亡，easpase-3和-6与该细胞凋亡密切相关。     

问号钩端螺旋体全基因组的更新注释

目的对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中未注释的基因进行重新注释,并寻找可能的新致病基因.方法将钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中功能未知的编码序列(CDSs)在BLASTP/NCBI数据库中比较,初步预测基因功能,对可能的致病基因及其编码产物运用多种生物学软件进行深入分析.结果未知CDSs中有82个与NCBI数据库中的编码蛋白序列有很高的同源性,其中LA0063和LA3291编码金属蛋白酶,可能与致病有关.结论通过钩端螺旋体黄疸出血群赖株全基因组数据库中功能未知的CDSs进行定期比对,可以不断完善该数据库的功能注释,同时可以发现新的致病基因,有助于钩端螺旋体病致病机理的最终阐明.     

钩端螺旋体与宿主细胞相互作用的研究现状

钩端螺旋体病是一种由致病性钩端螺旋体感染引起的人兽共患病。致病性钩端螺旋体在宿主体内播散过程中与遇到的各种宿主细胞相互作用,这在钩体病的发生发展过程中起到重要作用。本文阐述了近年来国内外有关钩端螺旋体和宿主细胞相互作用,并探讨钩端螺旋体致病机制的研究趋势。     

整合素和钙通道在人与小鼠钩端螺旋体主要宿主细胞上分布的差异

目的:了解人和小鼠钩端螺旋体(简称钩体)主要宿主细胞上整合素与钙通道表达情况及其差异.方法:采用免疫荧光和Westem blot法,检测人单核细胞株THP-1、小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1、人脐静脉内皮细胞株HUVEC、小鼠血管内皮细胞株EOMA、人肝细胞株L-02、小鼠肝细胞株Hepa 1-6、人肾小管上皮细胞株HEK-293、小鼠肾小球系膜上皮细胞株SV40-MES13、小鼠肾成纤维细胞株NIH/3T3、人及小鼠血小板的β1、β2、β3类整合素分子以及Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.3电压门控型钙通道蛋白和P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7受体门控型钙通道蛋白的分布差异.结果:整合素β1分子表达于J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA、L-02、Hepa1-6、HEK-239细胞以及人和小鼠血小板膜表面,β2分子表达于J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA和NIH-3T3细胞膜表面,β3分子表达于J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA、Hepa1-6、HEK-239、NIH-3T3细胞以及人和小鼠血小板膜表面.ATP依赖性受体门控型钙通道蛋白P2X1表达于人和小鼠血小板膜表面,P2X5表达于J774A.1、THP-1、L-02、Hepa1-6、HEK-239和HUVEC细胞膜表面,但未检测出上述细胞或血小板表达其它钙通道蛋白.结论:不同种类整合素分子和钙通道蛋白在钩体主要宿主细胞上表达明显不同,这可能与钩体对不同组织细胞致病性差异有关.     

问号钩端螺旋体诱导的Vero和J774A.1细胞的凋亡和超微结构病变

目的:探讨不同毒力的钩体黏附和侵入宿主细胞能力及其病理变化.方法:建立Fontana镀银染色法用于观察问号钩体黄疸出血群赖型56601株、波摩那群波摩那型56608株和双曲钩体三堡隆群patoc型Patoc Ⅰ株黏附Vero和J774A.1细胞的能力;采用电镜技术观察感染细胞的超微结构病变;采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术,检测紫外线灭活前后的上述钩体菌株诱导Vero和J774A.1细胞凋亡或坏死的情况.结果:问号钩体56601和56608株对Vero细胞的黏附率分别为24.2%和22.9%(P＞0.05);对J774A.1细胞的黏附率分别为49.0%和46.9%(P＞0.05);双曲钩体Patoc Ⅰ株不能黏附细胞.两株问号钩体侵入细胞后形成含有钩体的特殊吞噬泡,并引起相似的细胞超微结构病变,如细胞核染色质浓缩或溶解、细胞空泡变性、线粒体肿胀及线粒体嵴消失、内质网肿胀和膜旁核糖体消失等.灭活前的56601和56608株引起的Vero细胞凋亡率分别为84.4%和82.8%,灭活后则分别为77.9%和86.1%.灭活前后的56601株均以诱导Vero细胞晚期凋亡为主,其凋亡率分别68.0%和52.9%.灭活前后的56608株均以诱导Vero细胞早期凋亡为主,其凋亡率分别为64.1%和50.1%.在J774A.1细胞中,紫外线灭活前后的56601和56608株主要引起细胞坏死,其次是细胞凋亡,均以晚期凋亡为主.结论:所建立的Fontana镀银染色法可用于观察问号钩体的细胞黏附.问号钩体以内吞方式侵入细胞,并导致细胞超微结构病变.问号钩体诱导细胞坏死或凋亡可因细胞种类不同而异,与其毒力无明显关系.     

问号钩端螺旋体全基因组的更新注释

目的对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中未注释的基因进行重新注释，并寻找可能的新致病基因。方法将钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库中功能未知的编码序列(CDSs)在BLASTP／NCBI数据库中比较，初步预测基因功能，对可能的致病基因及其编码产物运用多种生物学软件进行深入分析。结果未知CDSs中有82个与NCBI数据库中的编码蛋白序列有很高的同源性，其中LA0063和LA3291编码金属蛋白酶，可能与致病有关。结论通过钩端螺旋体黄疸出血群赖株全基因组数据库中功能未知的CDSs进行定期比对，可以不断完善该数据库的功能注释，同时可以发现新的致病基因，有助于钩端螺旋体病致病机理的最终阐明。     

问号钩端螺旋体磷脂酶C的活性及其内化时细胞内游离Ca2+水平的变化

目的:了解不同毒力的钩端螺旋体(简称钩体)对细胞内游离Ca2 水平的影响及其磷脂酶C(PLC)活性与细胞内游离Ca2 水平的关系.方法:建立问号钩体Vero和J774A.1细胞感染模型.采用fluo-3/AM胞内Ca2 特异荧光标记激光共聚焦技术,检测强毒力的问号钩体黄疸出血群赖型56601株和弱毒力的波摩那群波摩那型56608株及无毒力的双曲钩体Patoc Ⅰ株作用的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 水平.以[3H]PIP2为底物,采用同位素法检测上述3株钩体培养物上清、胞浆和胞膜中PLC的活性.结果:正常Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 基础值分别为(102.3±8.2)%和(105.9±7.3)%,在观察时间内Patoc Ⅰ株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于(102.3±8.2)%～(102.2±8.3)%.问号钩体56601株感染的Vero和J774A.1细胞胞内游离Ca2 浓度呈双峰型增高,第一峰荧光强度变化百分数分别为(430.5±35.7)%和(747.5±18.5)%,第二峰荧光强度变化百分数分别为(380.6±17.4)%和(804.6±22.4)%.问号钩体56608株感染Vero和J774A.1细胞,其胞内游离Ca2 浓度均呈缓慢的单一坡型升高,其最大荧光强度变化百分数分别为(235.0±19.3)%和(402.4±17.4)%,明显小于56601株问号钩体(P<0.01).问号钩体56601株和56608株及双曲钩体Patoc Ⅰ株的培养物上清、胞浆蛋白和胞膜蛋白成分中均显示PLC活性(P<0.05).结论:不同毒力的问号钩体所感染细胞的胞内游离Ca2 水平及其峰型有明显差异,而且与被感染细胞的种类有关,与PLC活性无关.     

细胞黏附分子、细胞外基质在肿瘤细胞迁移中功能的研究进展

肿瘤细胞的迁移包括从原发肿瘤细胞中释放并侵入周围组织、进入血液循环或淋巴循环、在循环系统中转移、被远处器官的毛细血管床捕获、从循环系统中迁出和在选择位点开始生长等过程。在这些过程中，癌细胞之间，癌细胞与正常宿主细胞之间，以及癌细胞与细胞外基质之间的黏附作用发挥了至关重要的作用。作者以肿瘤细胞迁移中重要的生物学事件为线索，对其中涉及细胞黏附分子、细胞外基质重要作用的分子机制进行综述。     

延肾胶囊对残肾肾小球系膜细胞凋亡及其细胞外基质代谢的影响

目的探讨“延肾胶囊”对残肾肾小球系膜细胞凋亡及其细胞外基质代谢的影响。方法将Wistar大鼠120只随机分为6组，A组为假手术对照组；B组为5／6肾切除；C、D、E组分别为5／6肾切除 低、中、高剂量延肾胶囊；F组为5／6肾切除 肾衰宁。术后A、B两组给予等容积生理盐水灌胃。定量喂养。自由饮水。于术后15、90天测定各指标，每组每时相点观察10只大鼠。结果术后B组血浆血管紧张素Ⅱ浓度、肾小球系膜细胞增殖指数和凋亡指数、肾组织TGF-β1、Cot Ⅳ、Fas、FasL积分光密度等指标高于A组。C、D、E组血浆血管紧张素Ⅱ浓度、肾小球系膜细胞增殖指数、肾组织TGF-β1和Col Ⅳ积分光密度高于A组，但显著低于B组，随着延肾胶囊剂量增加，上述指标有逐渐降低的趋势；肾小球系膜细胞凋亡指数、Fas和FasL积分光密度显著高于A、B两组。随着延肾胶囊剂量增加。上述指标有逐渐升高的趋势。F组血浆血管紧张素Ⅱ浓度、肾小球系膜细胞增殖指数、肾组织TGF—β1和Col Ⅳ积分光密度低于B组，但高于D、E两组；肾组织Fas和FasL积分光密度显著高于A、B组。稍低于D、E两组；肾小球系膜细胞凋亡指数与B组无显著差异，显著低于C、D、E3组。结论“延肾胶囊”能显著抑制5／6肾切除大鼠残肾血管紧张素Ⅱ和TGF—β1的高表达，增加Fas和FasL的表达。抑制残肾肾小球系膜细胞过度增生，促进增生的系膜细胞凋亡。稳定残肾肾小球系膜细胞数量，减轻细胞外基质的堆积。呈剂量依赖性；“肾衰宁”能抑制系膜细胞增生，但不能促使增生的系膜细胞凋亡。     

血小板衍生生长因子对人脐带间充质干细胞胞外基质的影响

目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)对人脐带间充质干细胞(UCMSCs)增殖和细胞外基质(ECM)表达的影响及其可能的作用机制。方法 体外传代培养UCMSCs,分为对照组和实验组,其中对照组不加PDGF,实验组分别加入不同质量浓度(2、5、10、20、50μg/L)的PDGF。加入PDGF 12h后,用qRT-PCR法检测ECM基因和凋亡相关基因(Bcl 2、Bax)的表达;加入PDGF 24h后,用四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞增殖。结果 与对照组比较,随着PDGF质量浓度的增加,反映细胞代谢活性的OD值逐渐增加,且PDGF质量浓度在20μg/L时达到最高值,但PDGF质量浓度为50μg/L时OD值反而降低;PDGF质量浓度为2μg/L时,ECM表达和Bcl 2/Bax比值较对照组有所降低,随着PDGF质量浓度的增加,ECM的表达和Bcl 2/Bax比值呈现先增高后降低的趋势,且在10μg/L时达到最高值。 结论 PDGF可以促进脐带间充质干细胞的增殖,同时能促进其ECM的表达,还能提高细胞耐受凋亡的能力,最佳作用质量浓度为10μg/L。     

支气管哮喘患者支气管细胞外基质变化的研究

目的：以小支气管平滑肌厚度、粘膜网状基底膜厚度作为气道重塑指标，观察支气管哮喘患者支气管细胞外基质变化；了解哮喘患者血清、支气管肺泡灌洗液中细胞外基质相关因子的变化。方法：对12例哮喘患者和10例非哮喘对照者经纤支镜支气管粘膜活检，测量支气管平滑肌、粘膜网状基底膜厚度，测定血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞外基质相关因子：转化生长因子βl(TGFβ1)、γ干扰素(IFN-γ)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量。用t检验比较两组小支气管平滑肌及粘膜网状基底膜厚度以及上述细胞因子含量。结果：哮喘患者小支气管平滑肌厚度、粘膜网状基底膜厚度明显高于对照组，差异有显著性。哮喘患者血清和BALF中TGFβl、IL-4、IL-5、PCⅢ含量明显高于对照组，IFN-γ含量明显低于对照组，差异均有显著性。结论：哮喘患者小支气管平滑肌厚度、粘膜网状基底膜厚度均存在不同程度增厚，血清和BALF中某些细胞外基质相关因子存在显著变化，可能存在Thl／Th2失衡。