p53基因与5-FU联合作用诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

目的:研究通过转染野生型p53基因,并联合5-FU诱导人鼻咽癌CNE2细胞的凋亡作用.方法:将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒.用脂质体(Lipofectamine)介导的方法转染人鼻咽癌CNE2细胞,同时在培养液中加入5-FU;以RT-PCR检测p53基因的表达,通过AO/EB染色和流式细胞术等方法进行细胞凋亡分析.结果:经转染wt-p53基因后,基因在细胞中的表达增加.在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞增多.流式细胞仪检测结果示,经转染质粒pUHDl0-3-p53后,细胞的凋亡率为35.2%,单纯用5-FU组的细胞凋亡率为33.8%,而联合作用组的细胞凋亡率可达53.9%.结论:野生型p53基因与5-FU均可诱导人鼻咽癌细胞CNE2发生凋亡,野生型p53基因与5-FU联合作用,促进鼻咽癌细胞凋亡.     

p53基因与5-Fu联合作用对鼻咽癌细胞生长的影响

目的:通过转染野生型p53基因,并与5-Fu联合作用,观察其对两种鼻咽癌细胞生长的影响.方法:将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒,用脂质体(Lipofectamine)介导分别转染人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞,同时在培养液中加入5-Fu,用四甲基偶氮唑(MTT)法分析细胞生长情况.结果:人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞分别加入含5-Fu的培养液后,第4天生长抑制率分别为49.46%、54.85%.CNE1和CNE2细胞分别转染wt-p53基因后,第4天生长抑制率分别为47.14%、45.90%.人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞分别转染wt-p53基因后应用5-Fu处理,细胞的生长抑制率第4天分别可达到84.74%、85.82%,其生长作用均明显受到抑制.结论:野生型p53基因与5-Fu联合作用,对人鼻咽癌CNE1及CNE2细胞生长有明显的抑制效果.     

p53基因与5-氟尿嘧啶联合作用对鼻咽癌CNE2细胞生长的影响

目的通过转染野生型p53基因,并与5-氟尿嘧啶（5-Fu）联合作用,观察其对鼻咽癌细胞生长的影响。方法将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒,用脂质体（1ipofectamine）介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,在培养液中加入5-Fu,用四甲基偶氮唑（Mar）法分析细胞生长情况。结果人鼻咽癌CNE2细胞加入含5-Fu的培养液后,第4天生长抑制率为54．85％;CNE2细胞转染wt-p53基因后,第4天生长抑制率为45．90％。人鼻咽癌CNE2细胞转染wt-p53基因后应用5-Fu处理,细胞的生长抑制率第4天可达到85．82％,其生长明显受到抑制。结论野生型p53基因能抑制CNE2细胞生长,wt-p53与5-Fu联合作用,对人鼻咽癌CNE2细胞生长有明显的抑制效果。     

重构型Caspase-3基因对CNE2细胞的作用

目的 探讨Caspase-3基因表达对人鼻咽癌细胞CNE2的凋亡诱导作用.方法 应用重组技术将重构型Caspase-3基凶亚克隆至带有报告基因的真核表达载体pEGFP中,脂质体介导转染人鼻咽癌细胞CNE2通过RT-PCR方法检测转染后Caspase-3基因的表达:荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化;MTT法检测转染Caspase-3基因对CNE2细胞生长的影响.结果 RT-PCR方法证实重构型Caspase-3基因可在CNE2细胞内表达,形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征,结果表明Caspase-3对CNE2的细胞生长有抑制作用.结论 重构型Caspase-3对CNE2细胞的生长有抑制作用.     

脂质体介导p53基因对腩癌细胞生长的抑制作用

目的观察外源野生型p53基因在肝癌基因治疗方面的可行性。方法：将载有人野生型p53-cDNA的真核表达质粒pcDNA3-p53，用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG3B细胞，用流式细胞仪检测pcDNA3-p53对HepG3B细胞生长的影响。结果：通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现，HepG3B细胞生长受到明显的抑制。结论：脂质体介导的p53基因可在HepG3B细胞中表达，且明显抑制该细胞的生长。     

外源性野生型p53基因对HepG2细胞的作用

目的 研究外源性野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG2细胞生长的影响。方法 以人源性肝癌细胞系HepG2细胞为实验对象,检测其p53基因的突变。转染阳离子脂质体介导的野生型p53基因,检测其表达和凋亡水平的变化。结果 人源性肝癌细胞系HepG2细胞存在p53基因的突变,阳离子脂质体介导的野生型p53基因可有效转染入HepG2细胞中。转染后的HepG2细胞增殖受到抑制,细胞凋亡水平增高。结论 野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG2细胞有明显的抑制效应, 可能在肝癌的治疗方面起着重要作用。     

重组人p53腺病毒基因药物对人鼻咽癌细胞的抑制实验

目的探索p53基因在鼻咽癌基因治疗方面的可行性。方法以人鼻咽癌CNE细胞株为实验对象,将重组人p53腺病毒药物（1010rAd/p53）转染人鼻咽癌CNE细胞,用MTT比色实验及流式细胞仪实验的方法进行体外实验,观察重组人p53腺病毒药物（rAd/p53）对人鼻咽癌CNE细胞体外生长的影响。结果各浓度重组人p53腺病毒药物（1010rAd/p53、109rAd/p53、108rAd/p53、107rAd/p53）对人鼻咽癌CNE细胞生长有抑制。尤以1010rAd/p53明显。转染3天后,重组人p53腺病毒药物（rAd/p53）诱导人鼻咽癌CNE细胞明显凋亡。结论重组人p53腺病毒药物（rAd/p53）对人鼻咽癌CNE细胞生长能有效抑制,为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

野生型p53基因转染前列腺癌细胞系PC-3m对细胞凋亡的不同影响

目的：观察野生型p53基因转染对前列腺癌细胞PC-3m增殖和凋亡的影响。方法：用脂质体Lipofectamine将真核表达载体pCMV—p53和pCMV—p53mt135分别转染PC-3m细胞，MTT法检测转染前后细胞生长情况，转染48h后采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果：pCMV—p53转染后的PC-3m细胞生长明显受到抑制，FCM显示，转染48h后，细胞凋亡率为15％。结论：野生型p53基因瞬间转染PC-3m细胞可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。     

转染野生型p53基因对肝癌细胞生长的影响

目的：通过转染野生型p53基因致肝癌细胞株BEL-7404，研究其对肝癌细胞的生长及凋亡作用。方法：野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株BEL-7404。用四甲基偶氮唑（MTT）法测定细胞生长曲线，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果：肝癌细胞BEK-7404转染野生型p53基因后，其生长作用明显受到抑制．细胞生长抑制率在第4天可达50．8％。流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．7％，转染pUHD10-3组为3．2％．转染pUHD10-3-p53组为40．7％。结论：野生型p53基因可诱导肝癌细胞BEL-7404的生长抑制及发生凋亡。     

野生型p53基因转染对人胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用

目的 研究野生型p53基因对人未分化胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用。方法 用表达人野生型p53基因全长cDNA的真核载体pcDNA3—p53，转染人未分化胃癌细胞系HGC27，对转染后细胞进行生长曲线、细胞生长抑制率及流式细胞术分析，观察其生物学特性变化。结果 外源野生型p53基因在HGC27细胞内稳定表达，经pcDNA3—p53转染的HGC27细胞生长速度受到明显抑制，流式细胞分析显示G1期增加，S期下降，细胞出现凋亡。结论 野生型p53基因能在HGC27细胞内表达，且能抑制其生长并促进细胞凋亡。     

野生型p53基因诱导人肝癌细胞系HuH-7凋亡的研究

目的 通过转染野生型p53基因作用于肝癌细胞株HUH-7,来研究其诱导肿瘤细胞的凋亡作用。方法 野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞系HUH-7,96h后,用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果 流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为2．8％、转染pUHD 10-3组为4．1％、转染pUHD 10-3-p53组为39．6％。结论 野生型p53基因可诱导人肝癌细胞系HuH-7发生凋亡。     

转染野生型p53基因对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的 研究转染野生型p53基因对人肝癌细胞的生长影响作用。方法 将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3质粒,通过Lipofectin转染肝癌细胞株BEL-7402、BEL-7404、HLE、HUH-7及SMMC-7721,用四甲基偶氮唑(MTT)法观察细胞的生长情况。结果 转染野生型p53基因,可使肝癌细胞BEL-7404、HLE、HuH-7的生长明显受到抑制,第4天生长抑制率分别是50．0％、69．0％及65．1％。结论 转染野生型p53基因能有效抑制肝癌细胞株BEL-7404、HLE、HuH-7的生长。     

抑制核转录因子κBp65对鼻咽癌CNE2细胞的生物学影响

目的  探讨核转录因子κBp65（NF-κBp65）沉默对鼻咽癌的生物学作用。方法  构建NF-κBp65特异性小干扰核糖核酸（siRNA）质粒表达载体（pGPU6/RFP/Neo-NF-κBp65）和阴性对照质粒表达载体（pGPU6/RFP/Neo-NC）。采用非脂质体脂类转染剂将重组质粒表达载体转入人鼻咽癌CNE2细胞,建立NF-κ Bp65沉默的稳定转染CNE2细胞株（NF-κBp65沉默组）和阴性对照细胞株（阴性对照组）;蛋白质印迹法（Western blot）分析癌细胞中NF-κBp65基因的表达水平,MTT实验及流式细胞术分析癌细胞的增殖能力和细胞周期变化;复制裸鼠移植瘤模型,分析沉默NF-κBp65对癌细胞成瘤性的影响。结果  成功获得稳定转染CNE2细胞株,NF-κBp65沉默组细胞中NF-κBp65蛋白表达水平降低;NF-κBp65沉默后,CNE2细胞周期阻滞于S期,增殖速度减慢;NF-κBp65沉默组裸鼠移植瘤生长慢,重量轻,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义（F =14.386,P <0.05）。结论  NF-κBp65沉默能降低鼻咽癌CNE2细胞的恶性生物学行为。

     

PCDNA3/p33ING1、wt-p53转染对胃癌细胞株SGC-7901生长抑制及凋亡的影响

目的 研究p33^ING1基因与p53基因间的协同功能对胃癌细胞生长抑制和细胞凋亡的影响。方法 构建PCD—NA3／p33^ING1真核表达质粒（正义，反义）与wt—p53质粒，将其单、共转染至胃癌细胞株SGC-7901；应用流式细胞仪检测细胞生长周期曲线比例；TUNEL法、MG-P-MY法染色观察SGC-7901的凋亡情况。结果 p33^ING1单转染和wt-p53共转染的SGC-7901胃癌细胞株较反义组和转染空载体组细胞生长速度减慢。细胞周期G0／G1期延长，S期变短（P〈0．05），细胞调亡数增加（P〈0．05）。结论 p33 ING1具有抑癌功能及生物活性．与p53基因共同抑制胃癌细胞的生长，诱导细胞的凋亡，使细胞周期阻滞。二者呈协同依赖关系。     

正反p33ING1b对人类胰腺癌细胞SW1990生长的影响

目的:探讨p33ING1b和wtp53体外对胰腺癌细胞生物学活性的影响.方法:脂质体法将正义和反义p33ING1b以及wtp53单转染和共转染胰腺癌细胞SW1990;Western印迹法检测p33ING1b和wtp53蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞周期改变情况;特殊染色观察细胞凋亡情况.结果:转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者蛋白水平明显较反义组和空转组高(P<0.05);共转组SW1990细胞生长周期较其他各组缩短;转染p33ING1b组和共转染p33ING1b和wtp53组,两者凋亡细胞数目较反义组和空转组多.结论:p33ING1b对细胞可能存在正性调控作用,这种作用可能主要通过p53来发挥作用的.     

5-杂氮-2’-脱氧胞苷对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的分析5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2dC）对鼻咽癌细胞株CNEl、CNE2、5-8F、6-10B增殖、凋亡和细胞周期分布的影响。方法用不同浓度5-aza-2dC处理鼻咽癌细胞，MTT实验观察细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞周期分布情况和凋亡细胞比例。结果5-aza-2dC对4株细胞的增殖均具有抑制作用，CNEl和6-10B细胞的半数抑制剂量低于CNE2和5-8F。药物处理使4株细胞凋亡率呈剂量依赖性增加，CNEl和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。经5-aza-2dC处理后，CNEl、CNE2、6-10B细胞出现不同程度G0／G1期阻滞，而5-8F表现为G0／G1期和G2／M期双期阻滞．CNEl和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。结论5-aza-2dC对CNEl、CNE2、5-8F和6-10B细胞具有抑制增殖、促进凋亡和细胞周期阻滞作用，CNEl和6-10B对药物敏感性高于CNE2和5-8F。     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。