用尿嘧啶－DNA－糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应（ＰＣＲ）灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系（称为产物污染）导致假阳性结果，我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中掺入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ－Ｇｌｙｃｏｌａｓｅ，ＵＤＧ）处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。ＵＤＧ切割磷酸糖骨架上的尿嘧啶，可阴止ＤＮＡ聚合酶对它的复制，而对普通ＤＮＡ（即含”ｄＴ”）无影响。因为ＵＤＧ不与ｄＵＴＰ反应，而且在ＰＣＲ扩增前加热变性失活，使含尿嘧啶的污染物的污染得到很好控制。     

血小板激活因子受体mRNA在小鼠附睾精子内的表达

目的 检测血小板激活因子受体（ＰＡＦＲ）ｍＲＮＡ在小鼠附睾精子内的表达,探讨ＰＡＦＲ对受精过程的影响。２方法 分离提高小鼠附睾精子ｍＲＮＡ,经逆转录（ＲＴ）合成ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列分析验证扩增产物的准确性。结果 小鼠附睾精子表达ＰＡＦＲ－ｍＲＮＡ;ＤＮＡ序列分析验证ＰＣＲ产物的小鼠ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。④结论 小鼠附睾精子有ＰＡＦＲ－ｍＲＮ     

日本血吸虫大国大陆株副肌球蛋白编码基因的PCR扩增

根据已知的日本血吸虫菲律宾株的副肌球蛋白分子的部分ｃＤＮＡ序列，设计两对寡核苷酸引物（引物１／２和引物３／４），以聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用引物１／２从本室两个日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ库中均扩增出与预期大小（９２７ｂｐ）一致的特定ＤＮＡ片断。巢式ＰＣＲ－以第一扩增产物为模板，用引物３／４扩增出约５０００ｂｐ的单一条带，与预期片段（４９４ｂｐ）大小一致。表明ＰＣＲ产物为编码副肌球蛋白的目的基因     

日本血吸虫中国大陆株副肌球蛋白编码基因的PCR扩增

根据已知的日本血吸虫菲律宾株的副肌球蛋白分子的部分ｃＤＮＡ序列，设计两对寡核苷酸引物（引物１／２和引物３／４），以聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用引物１／２从本室两个日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ库中均扩增出与预期大小（９２７ｂｐ）一致的特定ＤＮＡ片段。巢式ＰＣＲ——以第一扩增产物为模板，用引物３／４扩增出约５００ｂｐ的单一条带，与预期片段（４９４ｂｐ）大小一致。表明ＰＣＲ产物为编码副肌球蛋白的目的基因片段。     

反转录—聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用

为呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染的临床诊断寻求敏感，特异的检测方法，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增毒培养液和急性呼吸道感染患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因，并应用地高辛标记ｃＤＮＡ探针对扩增产物进行鉴定。结果成功地提取了ＲＳＶｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经扩增得到４７１ｂｐ左右ｃＤＮＡ区带。流感病毒Ｂ，副流感病毒２型，腺病毒７对照无扩增带，ＲＳＶ培养液１０倍连续稀释至１：１０００，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增仍可见４     

T载体克隆乙肝病毒preS2＋S基因的实验研究

将商品化真核表达载体ｐｃＤＮＡ３改造成Ｔ载体ｐｃＤＮＡ３－Ｔ，燕运用ｐｃＤＮＡ３－Ｔ直接克隆也由ＰＣＲ扩增的ａｄｗ２亚型乙肝病毒ｐｒｅＳ２与Ｓ基因；结果：ｐｃＤＮ３－Ｔ与ＰＣＲ产物的重组率高达７０％。提示：该方法具有简便，省时等特点。     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

Dnmt3b cDNA及其在小鼠胚胎组织中选择剪接异构体的克隆

目的 克隆与小鼠胚胎发育相关的新的新的全长ｃＤＮＡ。方法 从小鼠胚胎ｃＤＮＡ文库中筛选出一个新的ＥＳＴ,以８～９ｄ齿小鼠胚胎组织ｍＲＮＡ为模板进行ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）,结合ＰＣＲ筛选ｃＤＮＡ文库,获得共全长ｃＤＮＡ序列后进行序列同源检索、结构分析和功能预测。整合后的ｃＤＮＡ两上物进行ＲＴ－ＰＣＲ,克隆ＰＣＲ产物,并对产物进行全序列测定,验证整     

PCR技术应用中的辩证关系

聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是美国Ｃｅｔｕｓ公司和加利福尼亚大学于１９８５年底联合创建的一种ＤＮＡ体外扩增技术。其基本原理是依据体内细胞分裂中ＤＮＡ半保留复制机理，以及在体外ＤＮＡ分子于不同温度下双链和单链...     

人淋巴霉素cDNA克隆及顺序分析

目的：克隆人淋巴毒素ｃＤＮＡ并测序。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化的Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ中扩增入淋巴毒素ｃＤＮＡ并定向克隆于ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９质粒载体Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序，结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个５４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示。该５４１ｂｐ片段为编码人淋巴毒素成熟肽的ｃＤＮＡ，与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致，结论；     

从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因的初步研究

采用５＇加端ＰＣＲ从Ｋ５６２ｃＤＮＡ文库中扩增出含锌指结构域的ｃＤＮＡ基因片段，重组至ｐＧＥＭ７ＺＤＮＡ载体中。通过ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交初步从Ｋ５６２ｃＤＮＡ文库中筛选出９个含锌指基因片段的重组克隆。经ＤＮＡ序列分析和基因库检索，发现有２个克隆的序列与巳知基因差异显著，有可能为新的锌指蛋白基因片段。     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

小鼠β趋化因子受体CCR5基因的克隆

目的：克隆小鼠β趋化因子相关的受体并研究其表达。方法：使用共同引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ中扩增出一０．５ｋｂ ｃＤＮＡ，再根据其序列，设计一特异引物，用Ｍａｒａｔｈｏｎ ＰＣＲ法扩增得一２．８ｋｂ ｃＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｍ方法检测分析该ＡＤＬＤ，Ｎｒｔｈｅｒｎ方法分析其表达。结果：成功克隆出小鼠ＣＣＲ５ ｃＤＮＡ，其开放阅读框为１０６５ｂｐ，     

三种方法对日本血吸早抗原cDNA克隆的筛选和鉴定

利用融源表达、平板裂解法和ＰＣＲ扩增三种不同方法分别对日本血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因进行鉴定和分析，８个免疫筛选阳性克隆均能在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达，表达蛋白分子量为１４０－１５０ｋＤａ，抗原ｃＤＮＡ基因经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ酶解后，琼脂糖凝胶电泳显示其大小为７００－９００ｂｐ，ＰＣＲ能扩增出特异性条带，结果表明，上述三种方法能从蛋白质和核酸水平有铲地鉴定血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因。     

人血小板生成素的基因克隆及序列分析

目的：为获得人血小板生成素全长ｃＤＮＡ克隆。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ技术,以特异性寡核苷酸为上、下游引物自胎肝总ＲＮＡ中扩增目的基因。结果：ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＵＣ１８－Ｔ载体,儿得重组质较ｐＵＣＴ－ＴＰＯＭ。结论：序列分析显示,获得的血小板生成素ｃＤＮＡ序列与国外文献一致。     

人类PU.1 cDNA的克隆及表达产物的生物活性

目的：重叠聚合酶链反应（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＣｈａｎｉＲｅａｃｔｉｏｎ ＰＣＲ）法是在上下游引物之间设计一对碱基互站的嵌套引物,第一轮ＰＣＲ分别扩增５’端和３’端片段,第二轮ＰＣＲ以第一轮ＰＣＲ的５’端和３’端片段混合物为模板,用上下游引物扩增出全长片段。该文用逆转录－Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ法快速高效地从前骨髓干细胞中扩增到人类ＰＵ．１全长ｃＤＮＡ为４４２ｂｐ,酶切和测序证实完全与前人报道一致。构建的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＰＵ．１可以被特异的抗体识别,体外细胞株转梁证实具有特异的激活启动子活性的功能。     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

人淋巴毒素cDNA克隆及顺序分析

目的：克隆人淋巴毒素ｃＤＮＡ并测序。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ中扩增人淋巴毒素ｃＤＮＡ，并定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体，Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个５４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示，该５４１ｂｐ片段为编码人淋巴毒素成熟肽的ｃＤＮＡ，与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。结论：本实验成功地克隆了人淋巴毒素ｃＤＮＡ，为在大肠杆菌表达人淋巴毒素并进一步研究其功能，以及淋巴毒素的开发与临床应用奠定了基础。     

PCR测定在医学中的应用

ＰＣＲ测定在医学中的应用江苏镇江医学院生物化学教研室龚志明江苏省镇江市第一人民医院杨兆生聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ－ｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术是用ＤＮＡ聚合酶在体外条件下，模仿天然ＤＮＡ的复制过程．ＰＣＲ测定的样品量是微量的，只...     

PCR检测女性泌尿道淋菌应用

ＰＣＲ检测女性泌尿道淋菌应用罗仁福内江市第二人民医院检验科ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ聚合酶链反应）是一种具有高度特异性和敏感性和基因体外扩增的分子生物学技术。在实验过程中获得核糖核酸（ＤＮＡ）作为所需扩增基因的模板是试验成...