慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

建立慢病毒介导的miR-145稳定过表达的鼻咽癌细胞株

目的 构建过表达miR-145的慢病毒载体,建立稳定过表达miR-145的鼻咽癌细胞株.方法 构建慢病毒表达质粒pLVTHM/miR-145;293FT细胞进行慢病毒包装,生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,经流式细胞仪筛选后,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株;最后应用荧光定量PCR检测病毒感染后鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中miR-145的表达水平.结果 荧光定量PCR结果和测序验证pLVTHM/miR-145重组质粒构建成功;包装生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞CNE1和CNE2后,与阴性对照组比较,其表达水平分别升高4000倍和4500倍.结论 成功构建了pLVTHM/miR-145慢病毒重组质粒,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,为研究miR-145在鼻咽癌发生发展过程中的基因调控和相应的作用机制提供了有用的细胞模型.     

Cofilin-1慢病毒载体的构建及其在Huh-7中的过表达

目的 构建Cofilin-1过表达的Huh-7细胞株. 方法 应用RT-PCR克隆出Cofilin-1的完整编码序列,将其亚克隆到慢病毒载体pWPT中,构建慢病毒载体表达质粒pWPT-Cofilin-1;将慢病毒表达质粒pWPT-Cofilin-1或pWPT-GFP与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞,获得携带Cofilin-1完整编码序列的慢病毒和携带GFP基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞;通过Real-Time PCR和Western blot检测Huh-7细胞中的Cofilin-1的过表达情况. 结果 测序结果显示成功构建重组慢病毒表达质粒pWPT-Cofilin-1;慢病毒有效感染Huh-7细胞,依据GFP绿色荧光可测定感染有效率超过95％;Cofilin-1在Huh-7细胞中的mRNA量和蛋白水平都成功的过表达. 结论 本实验的完成,为进一步研究Cofilin-1基因在肝癌中的生物功能和作用机制奠定了基础.     

慢病毒载体介导的RNAi技术构建稳定抑制β-catenin的人鼻咽癌细胞株

目的建立稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在鼻咽癌发生中的作用提供细胞模型。方法于β-catenin CTNNB1基因编码区选择3个siRNA靶点合成3对shRNA干扰序列,分别与pLKO.1载体连接,构建pLKO.1-sh-β-catenin质粒(干扰组1)、pLVTHM-sh-β-catenin(干扰组2)和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒(阴性对照组);将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集含慢病毒颗粒的上清液感染人鼻咽癌6-10B细胞,感染pLKO.1-sh-β-catenin和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒的细胞经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株。Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率及下游基因c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测比较细胞增殖状况,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移率。结果 Western blot检测结果显示pLKO.1-sh-β-catenin(干扰组1)干扰效率最佳,β-catenin及c-myc蛋白表达减少;MTT检测显示干扰β-catenin后细胞吸光度下降,细胞增殖受到抑制;穿过Transwell小室底膜的细胞数:干扰组1为(23.5±4.6)个,明显低于阴性对照组(50.3±5.3,P<0.01)及空白对照组(54.3±5.6,P<0.01)。结论成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为进一步研究以β-catenin为靶点的鼻咽癌基因治疗奠定基础。     

Iduna过表达慢病毒的构建、包装及鉴定

目的构建大鼠Iduna cDNA的慢病毒表达质粒(pCDH-Iduna),包装Iduna过表达慢病毒,以期上调原代神经元细胞中Iduna的表达。方法提取SD大鼠脑组织总RNA,利用RT-PCR的方法获取大鼠Iduna cDNA序列,将其插入慢病毒过表达载体pCDH质粒中,经酶切和测序验证重组质粒pCDH-Iduna。将pCDH-Iduna(以pCDH-EGFP为阴性对照)及包装质粒共转染HEK293T细胞,包装Iduna过表达慢病毒,显微镜下观察HEK293T细胞的形态变化,了解病毒包装情况。用慢病毒感染原代神经元细胞,Western blot检测靶细胞中Iduna的表达效率。结果琼脂糖凝胶电泳显示Iduna的PCR扩增产物大小为1068 bp左右片段,酶切鉴定可见重组质粒pCDH-Iduna有约1000bp左右片段释放,与预期相符,测序结果提示克隆正确。将Iduna过表达慢病毒表达载体pCDH-Iduna及包装质粒共同转染HEK293T细胞后,镜下可见细胞呈现出毒时特有的致细胞病变效应。Iduna过表达慢病毒及其对照病毒感染原代神经元细胞,免疫荧光观察感染率达70%后,Western blot检测病毒感染的神经元细胞中Iduna表达显著增加。结论成功构建大鼠Iduna慢病毒过表达载体pCDH-Iduna并获得具有良好感染效率的过表达慢病毒,后者能够显著上调原代神经元中Iduna的表达。     

稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9鼻咽癌细胞株建立

目的构建针对UGT1A9基因的shRNA慢病毒干扰表达载体;建立稳定UGT1A9干扰鼻咽癌细胞株,测定干扰效率。方法应用荧光定量PCR法检测UGT1A9 mRNA在鼻咽癌成瘤高转移细胞株5-8F和成瘤非转移细胞株6-10B之间的差异表达水平。构建重组UGT1A9 shRNA表达质粒pLentiU6/UGT1A9,经293FT细胞包装后,产生的慢病毒感染5-8F细胞,荧光定量PCR检测干扰效率。结果 UGT1A9在鼻咽癌细胞株中明显高表达。PCR、测序验证pLentiU6/UGT1A9-shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未干扰组相比,可明显抑制UGT1A9 mRNA水平。结论成功构建了稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9的鼻咽癌细胞株,为研究UGT1A9可能参与介导鼻咽癌抗药的分子机理奠定了基础。     

HOTAIR过表达慢病毒载体的构建及稳定细胞株的建立

目的构建稳定过表达HOTAIR的人滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系,并验证HOTAIR的表达。方法利用PCR技术扩增HOTAIR基因全长序列,并将其克隆入LV5载体中,构建LV5-HOTAIR载体,重组质粒经双酶切鉴定及测序验证成功后,转染人胚肾细胞293T,包装过表达病毒颗粒,制备并浓缩慢病毒颗粒。将构建好的过表达HOTAIR慢病毒载体感染HTR-8/SVneo细胞,采用嘌呤霉素筛选出HOTAIR稳定表达的细胞系,荧光显微镜观察绿色荧光表达;qRT-PCR验证HOTAIR表达。结果重组质粒酶切得到的条带与预期相符,过表达HOTAIR慢病毒载体中序列与目标序列一致。荧光显微镜下过表达HOTAIR组细胞有绿色荧光表达;qRT-PCR结果表明过表达HOTAIR的HTR-8/Svneo稳定细胞株中HOTAIR表达是Control组的206.3倍(P<0.05),是NC组的232.8倍(P<0.05)。结论成功建立稳定过表达HOTAIR的HTR-8/SVneo细胞,且过表达HOTAIR的HTR-8/Svneo稳定细胞株中HOTAIR mRNA表达水平明显升高。     

慢病毒介导的过表达载脂蛋白A1宫颈癌稳定细胞系建立的实验研究

目的采用慢病毒载体构建稳定过表达载脂蛋白A1(apolipoprotein A1, ApoA1)基因的SIHA、HELA细胞系,为研究ApoA1在宫颈癌中的作用机制奠定基础。方法构建过表达ApoA1基因的慢病毒载体,感染SIHA、HELA细胞并进行嘌呤霉素抗性筛选,构建稳定过表达ApoA1基因的SIHA、HELA细胞系,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot方法检测ApoA1 mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-qPCR显示SIHA及HELA细胞转染组中ApoA1mRNA表达量较阴性对照组明显提高(P <0.01),Western blot提示ApoA1蛋白在SIHA及HELA细胞中低表达,转染组ApoA1蛋白水平的表达明显高于对照组。结论成功构建稳定过表达ApoA1基因的宫颈癌SIHA、HELA细胞系。     

利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因PIN1的鼻咽上皮细胞株

目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因肽脯氨酰异构酶PIN1的鼻咽上皮细胞株,用于后续生物学功能方面研究。方法将病毒载体p CDH-PIN1用Lipofectamine转染到293TN细胞,收集含有PIN1病毒颗粒的培养液加入NP69细胞进行培养。荧光显微镜观察慢病毒载体GFP发光率、RT-q PCR、Westernblot验证PIN1的表达情况。结果荧光显微镜观察发现PIN1基因已整合到94%±2.09%的NP69细胞中,转染效果稳定。RT-q PCR、Westernblot检测发现NP69-PIN1组中PIN1的mRNA和蛋白水平明显高于对照组和空白组。结论课题组利用慢病毒载体系统成功在鼻咽上皮细胞构建PIN1过表达株。     

稳定表达小鼠PNPLA7的Huh7细胞系的构建

目的:构建稳定表达小鼠PNPLA7-Flag蛋白的人类肝癌细胞Huh7细胞系,观察小鼠PNPLA7在Huh7细胞中的过表达以及对Huh7细胞脂质含量的影响?方法:构建pCMV6 -PNPLA7-Flag真核表达载体,应用脂质体转染技术将该质粒导入Huh7细胞,随后通过G418筛选稳定表达的细胞系,运用Western blot方法检测PNPLA7蛋白表达;并通过油酸处理及油红染色观察过表达PNPLA7蛋白对Huh7细胞中脂质含量的影响?结果:成功获得2株稳定过表达PNPLA7-Flag的Huh7细胞系;Huh7细胞中过表达PNPLA7蛋白,在油酸处理后细胞内脂滴含量减少?结论:稳定表达小鼠PNPLA7的Huh7细胞系构建成功;小鼠PNPLA7在Huh7细胞中的表达会引起细胞中脂质含量减少,从而为后续研究PNPLA7蛋白在脂代谢通路的功能及机制提供可靠的细胞模型?     

慢病毒介导的稳定沉默MyD88基因的胰腺导管细胞株的建立

目的 建立稳定沉默髓样分化因子88基因(MyD88)的大鼠胰腺导管细胞株ARIP.方法 设计并构建编码MyD88 mRNA的短发卡样RNA(shRNA)质粒表达载体,并用三质粒包装系统包装成慢病毒,分别命名为Lenti-shMyD88-1和Lenti-shMyD88-2.将ARIP分为未处理组、Lenti-Non Ta...     

表达人KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型的建立

目的建立表达人KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,为探究人KIAA1173基因在鼻咽癌发病机制中的作用奠定实验基础。方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR(RT-PCR)得到人KI-AA1173基因cDNA,纯化PCR产物,与真核表达载体pcDNA3.1( )连接,转化,铺板,筛选阳性克隆,酶切鉴定并进行序列测定。将重组质粒pcDNA3.1( )-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆。用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况。以空白质粒转染组作为对照。结果重组质粒pcDNA3.1( )-KIAA1173经酶切和DNA测序分析显示与GenBank所公布的相应序列相符,插入方向正确,阅读框架完整。转染KIAA1173基因的6-10B细胞阳性克隆在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有该基因高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因。结论成功获得了人KIAA1173基因全长cDNA的基因克隆,将该基因导入鼻咽癌6-10B细胞后,获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的细胞模型。     

5-氨基乙酰丙酸光动力杀伤人鼻咽癌耐药/非耐药细胞株的实验研究

目的 观察5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)光动力学效应对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2及其顺铂耐药株CNE2/DDP的生物作用,探讨光动力治疗多药耐药鼻咽癌的可行性.方法 对CNE2与CNE2/DDP分别加入不同浓度的5-ALA (0.01、0.05、0.10、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L)孵育4 h,予波长为630 nm的半导体激光进行照射,能量密度分别为2、5、10、20 J/cm2,继续孵育24 h,用四唑盐比色法测定细胞存活率;两株细胞与2.0 mmol/L浓度的 5-ALA溶液共孵育4 h后,用流式细胞仪检测细胞内生性光敏剂原卟啉Ⅸ的荧光强度.结果 5-ALA光动力对体外培养的CNE2和CNE2/DDP细胞均有杀伤作用,表现为对5-ALA浓度、激光剂量的量-效依赖关系.激光能量为20 J/cm2时,5-ALA对CNE2和CNE2/DDP细胞的半数杀伤浓度分别为0.07 mmol/L与0.375 mmol/L,二者比较差异显著(P＜0.01);不同5-ALA浓度、不同激光剂量条件下CNE2细胞存活率显著低于CNE2/ DDP (P＜0.05);CNE2和CNE2/DDP的细胞内荧光强度分别为(197.33±1.45)、(106.36±2.31),相差非常显著(P＜0.01).结论 5-ALA-PDT对CNE2和CNE2 /DDP均有杀伤作用,但CNE2/DDP对其敏感性低于CNE2,表明CNE2/DDP对5-ALA-PDT存在一定程度的交叉抗性,增加5-ALA浓度和/或增大激光剂量可以在一定程度上克服这种抵抗.     

粉防己碱对人鼻咽癌细胞株CNE增殖抑制和凋亡作用的研究

目的：探讨粉防己碱（Tet）对人鼻咽癌细胞株CNE增殖抑制和凋亡的影响。方法：将人鼻咽癌细胞株CNE分为不同浓度Tet处理组,并设立对照组。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE体外生长的抑制作用;采用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳技术、流式细胞术Annenxin V/PI EGFP观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE凋亡的影响;采用逆转录-多聚酶链反应技术（RT-PCR）观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE凋亡相关基因mRNA表达的影响。结果：Tet呈浓度依赖性抑制癌细胞体外生长（P〈0.05）。Tet处理细胞72 h后,电镜下可见细胞缩小,核裂解,凋亡小体形成;随着Tet浓度的提高,各Tet处理组DNA凝胶电泳梯形条带和细胞凋亡率渐趋明显。与对照组相比较,Bcl-2 mRNA的表达渐减弱,Bax基因mRNA表达渐增强（P〈0.05）。结论：Tet可抑制癌细胞生长,促进癌细胞凋亡,其抗癌作用机制可能与下调Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达有密切联系。     

柞蚕抗菌肽对人鼻咽癌细胞CNE 2骨架的作用

目的：探讨柞蚕抗菌肽对癌细胞骨架的破坏作用。方法：用柞蚕抗菌肽对人鼻咽癌细胞CNE2处理12和18h，抗微管蛋白单克隆抗体检测细胞骨架结构的变化。结果：免疫组织化学染色见抗菌肽处理后细胞骨架分布不均匀，形态不规则，散乱，卷缩。结论：柞蚕抗菌肽具有较明显的破坏人鼻咽癌细胞株CNE2细胞骨架的作用。     

吉非替尼对鼻咽癌细胞株CNE2放疗增敏作用

目的应用吉非替尼作用于鼻咽癌细胞株CNE2,观察其放疗增敏作用。方法体外培养鼻咽癌细胞株CNE2,以MTT实验检测细胞增殖抑制情况及吉非替尼对细胞放射敏感性的影响;用克隆形成法绘制细胞存活曲线,获得不同处理条件下的放射增敏比。以流式细胞术(FCM)分析细胞周期变化和凋亡情况。结果 MTT显示与单纯照射组比较,联合吉非替尼照射组细胞生存率显著降低(0.582±0.012vs0.398±0.016,P=0.0020);FCM显示吉非替尼联合放射组S期细胞显著下降(P=0.000),而G2/M期细胞比值显著增加(P=0.000),吉非替尼和放射线可协同作用,使CNE2细胞的周期再分布显著变化。结论吉非替尼可增强鼻咽癌细胞株CNE2放射敏感性,其机制可能与改变细胞周期的分布相关。     

缺氧诱导鼻咽癌细胞株CNE2化疗耐药及其机制

目的：探讨缺氧环境下人鼻咽癌多药耐药相关基因和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达和意义,从而部分阐明鼻咽癌发生多药耐药的机制,为逆转鼻咽癌耐药提供新的分子靶点.方法：将人鼻咽癌细胞系CNE2分别行不同时间低氧培养,MTT法检测CNE2对紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶的耐药倍数;流式细胞仪检测缺氧与常氧下细胞的凋亡情况.应用RT-PCR和Western Blot分别检测每组CNE2细胞中多药耐药相关基因（mdr1）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）和HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表达.结果：缺氧培养48 h,CNE2对紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶的耐药倍数较常氧分别提高2.14,1.86,1.43倍,且药物引起的凋亡减少.在缺氧组,随着缺氧时间的延长,CNE2细胞中多药耐药相关基因mdr1,MRP1的表达均逐渐增高,而且这些多药耐药相关基因的表达与HIF-1α的表达呈同步化改变.结论：缺氧可上调鼻咽癌细胞内的核转录因子HIF-1α以及多药耐药相关基因的表达,从而诱导鼻咽癌产生多药耐药性.核转录因子HIF-1α和这些多药耐药相关基因可能成为逆转鼻咽癌耐药的新的分子靶点.     

稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株的构建

目的应用RNA干扰技术降低肾癌A498细胞株的CXCR4基因表达水平,并建立稳定转染细胞株。方法针对CXCR4基因设计合成siRNA,转染肾癌A498细胞株,采用RT-PCR法检测CXCR4基因表达变化,根据有效干扰片段结果合成重组shRNA质粒,稳定转染至A498细胞系并进行G418抗性筛选细胞株。采用RT-PCR和Westen印迹法检测CXCR4mRNA及蛋白表达水平,应用流式细胞技术检测CXCR4shRNA诱导A498细胞凋亡的效应,Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变。结果将CXCR4重组shRNA质粒成功转染A498细胞后,肾癌细胞内可见绿色荧光,通过G418筛选,获得了CXCR4基因沉默的A498细胞系,RT-PCR及Western印迹检测证实该细胞系的CXCR4水平明显低于对照组的表达水平(P<0.05)。CXCR4shRNA组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均显著高于对照组(P<0.05),Tran-swell体外侵袭实验显示CXCR4shRNA能明显抑制A498细胞的体外侵袭力(P<0.05)。结论成功构建稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株,转染后的细胞凋亡率升高,体外侵袭能力降低,为后续研究奠定了基础。     

鼻咽癌细胞肝转移亚株的建立

目的 建立鼻咽癌细胞肝转移亚株,研究鼻咽癌肝转移机制。方法 利用裸鼠体内传代的方法获得肝转移细胞亚株,并用体内和体外实验来观察其侵袭转移能力。结果 经体内反复筛选得到肝转移能力高的亚株5-8F-H3B-EGFP．其侵袭性、运动性以及形成肝转移灶的能力均大于母系5-8F-EGFP,并具有较高的肝脏亲和性。结论 该亚株的建立为今后研究鼻咽癌肝转移的分子机制奠定了基础。