染料介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的细胞毒性研究

目的 评价染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣膜的细胞毒性。方法 将L929细胞经亚甲基蓝介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣浸提液培养后,用MTT比色法测定其相对增殖率。将L929细胞与染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣直接接触培养,于不同时间观察细胞的生长状态。将L929细胞种植于染料介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣表面,用扫描电镜观察其生长情况。结果 染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的性质稳定,细胞毒性程度为0～Ⅰ级。L929细胞与瓣膜材料直接接触培养生长良好,形态学无明显改变。结论 染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的细胞相容性良好。     

原花青素处理去细胞牛心包细胞的相容性研究

目的考察原花青素处理去细胞牛心包的细胞相容性。方法采用L929细胞经原花青素处理去细胞牛心包浸提液培养后,噻唑蓝试验（MTT）法测定其相对增值率;将L929细胞与原花青素处理去细胞牛心包直接接触培养,逐日观察细胞生长状态;将L929细胞种植于原花青素处理的去细胞牛心包表面,扫描电镜观察其生长情况。结果原花青素处理去细胞牛心包性质稳定,细胞毒性程度为0～1级。L929细胞与心包材料直接接触培养生长良好,形态学无明显改变。结论原花青素处理去细胞牛心包细胞相容性好。     

光氧化处理牛颈静脉带瓣管道重建肺动脉与右心室连接

目的观察光氧化处理的牛颈静脉带瓣管道用于重建右心室—肺动脉连接后,在体内循环系统中与血流接触条件下的抗钙化性能及其血流动力学性能。方法以经光氧化反应处理的牛颈静脉带瓣管道为研究对象,以单纯戊二醛交联固定的牛颈静脉带瓣管道作为对照,建立犬重建右心室—肺动脉连接的动物模型;实验动物饲养观察10个月后,通过超声心动图和心导管检查等方法评价两种不同方法固定处理的牛颈静脉带瓣管道重建犬右心室—肺动脉连接后的血流动力学性能,并了解牛颈静脉管道内的瓣膜在犬的右心系统内的功能。屠宰实验动物后取出标本,通过原子吸收光谱法测定组织钙含量,von Kossa钙盐染色观察组织钙化情况。结果心脏超声显示两组管道均通畅,瓣叶活动良好。光氧化处理组结扎肺动脉前、后直接测压及术后9~10个月通过心导管测压,所测得的跨瓣压差维持在较低水平,跨瓣压差无明显升高;戊二醛组结扎肺动脉前、后及术后9~10个月测得的跨瓣压差与光氧化组相似。光氧化组管道血管壁钙含量为7.60±8.02 mg/g,戊二醛组管道血管壁钙含量为22.05±10.78 mg/g,两组有显著性差异(P<0.05);光氧化组和戊二醛组管道瓣膜钙含量分别为0.74±0.23 mg/g和0.88±0.69 mg/g,两组相比无统计学差异(P>0.05)。结论光氧化反应处理固定的牛颈静脉带瓣管道可用于重建右心室—肺动脉连接,血流动力性能良好,与自体肺动脉相当,远期血流动力学性能尚待进一步观察研究。光氧化反应处理固定的牛颈静脉带瓣管道在狗的动物模型中,抗钙化性能优于戊二醛固定的牛颈静脉管道。     

去细胞带瓣牛颈静脉管道支架的制备及形态结构观察

目的研究去细胞带瓣牛颈静脉组织工程支架的制备,并观察其形态结构。方法取新鲜牛颈静脉48条,随机分为对照组、实验组,每组24条。对照组为新鲜牛颈静脉;实验组为去细胞牛颈静脉,用40 g/L脱氧胆酸钠+50 m l/L Triton-X-100为主要成分的试剂进行处理,去除内皮细胞及成纤维细胞。HE染色、苦味酸-天狼猩红染色、弹力纤维染色、电子扫描显微镜检查、基因组DNA检测,观察其形态结构,评价去细胞效果。结果实验组瓣膜及血管壁中内皮细胞、成纤维细胞去除完全,无细胞核碎片;瓣膜及血管壁胶原纤维和弹力纤维呈波浪状排列、整齐,结构完整;瓣膜、血管壁基因组DNA含量,分别较对照组下降97.58%、97.25%。结论脱氧胆酸钠+Triton-X-100是一种有效的去除牛颈静脉细胞,制备组织工程带瓣管道支架的方法。     

不同预处理对去细胞瓣细胞黏附率的影响

目的:探讨不同预处理对去细胞瓣细胞黏附率的影响。方法:取新鲜猪主动脉瓣,用胰蛋白酶加TritonX100去除细胞,分别给予磷酸缓冲液(PBS)、多聚赖氨酸(PLL)和未灭活胎牛血清(FBS)包被处理瓣膜。然后种植大鼠主动脉肌成纤维细胞,甲基噻唑基四唑试验检测瓣膜细胞黏附率,并苏木精-伊红染色和扫描电镜形态学观察。结果:FBS处理组的细胞黏附率高于其他两组,光镜和扫描电镜显示肌成纤维细胞在去细胞瓣表面形成连续的细胞层。结论:FBS预处理能较好地改善去细胞瓣的细胞黏附。     

3种血管替代物植入人体后的变化及比较分析

目的:了解临床上3种常用血管替代物人体内移植后的变化。方法:临床获取因治疗需要而取出的先天性心脏病患儿早期植入的Gore-Tex管道、牛颈静脉管道和同种带瓣管道标本,通过对大体标本观察,组织学切片HE染色、Masson染色、Verhoeff弹性纤维染色以及特异性细胞标记物(α-SMA、calponin、VE-cadherin)免疫组织化学染色,评价移植物植入人体后的变化。结果:Gore-Tex管道移植后原管道未降解,管道壁中无细胞长入,管腔内形成假膜,其中假膜富含胶原纤维,无弹性纤维,散在α-SMA+细胞和calponin+细胞。牛颈静脉管道移植后,原管道未降解,管道壁中无细胞长入,管腔内可见假膜,假膜较厚,富含胶原纤维,但存在特殊排列的弹性纤维,弹性纤维所在区域聚集α-SMA+细胞和calponin+细胞。同种带瓣管道移植后,管道近乎全层钙化,仅残留浅薄的内膜,内膜表面光滑,无假膜形成,可见VE-cadherin+内皮细胞层及残存的平滑肌细胞。结论:Gore-Tex管道和牛颈静脉管道难以降解,且不具备生长性,远期易出现管道狭窄;同种带瓣管道移植后无假膜形成,但易出现钙化,限制了管道的使用寿命。     

乙醇、丁二醇改性对牛颈静脉的抗钙化作用

目的探讨两种醇类改性对牛颈静脉带瓣管道的抗钙化作用。方法将戊二醛固定的牛颈静脉带瓣管道分别用80%乙醇(A组)和100%2,3-丁二醇(B组)进行化学改性,分别将两组管壁片及瓣膜片植入12只刚离乳的SD大鼠背部两侧皮下,90 d后处死大鼠,取出植入的组织片进行组织钙质量分数、总蛋白水平测定与光镜、电镜检查。结果A组的牛颈静脉管壁及瓣膜组织钙质量分数分别为(173±61)μg/m g和(2.13±0.85)μg/m g,B组钙质量分数分别为(181±29)μg/m g和(1.73±1.20)μg/m g,两组比较,均无显著性差异(P>0.05);组织学观察显示两组改性管壁及瓣膜组织炎性细胞浸润较少,胶原纤维结构保持良好。A组管壁及瓣膜片总蛋白水平分别为(337±293)m g/L和(142±82)m g/L,B组管壁及瓣膜片总蛋白水平分别为(269±230)m g/L和(139±111)m g/L,两组比较,均无显著性差异(P>0.05)。结论两种醇类均可作为牛颈静脉带瓣管道的改性剂;生物材料钙化与蛋白吸附相关;丁二醇及乙醇改性减少了生物材料的蛋白吸附,从而增强其抗钙化性能。     

比较牛颈静脉去细胞处理实验方法

目的比较两种牛颈静脉脱细胞方法。方法改良组对牛颈静脉使用0.25%聚乙二醇辛基苯基醚、2.5g/L脱氧胆酸钠、0.2g/L乙二胺四乙酸、0.1g/LRNA酶和0.2g/LDNA酶作48h脱细胞处理;常规组使用0.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸处理24h,再按以上处理组程序处理24h。血管壁和瓣膜自身细胞脱除和细胞外基质改变在染色后用扫描电镜观察;血管组织强度用生物力学检测。结果改良处理组管壁和瓣膜自身细胞完全脱除而细胞外基质无明显改变,常规组仍有大量固有细胞残留,弹力纤维出现断裂;两组脱细胞血管的生物力学性能无明显变化。结论改良脱细胞处理用聚乙二醇辛基苯基醚、脱氧胆酸钠、乙二胺四乙酸、RNA酶和DNA酶组合,是一种较理想的牛颈静脉脱细胞方法。     

蛋白多糖在脱细胞猪肺动脉带瓣管道中抗钙化的作用

目的:证实去除细胞外基质蛋白多糖对提高脱细胞猪肺动脉带瓣管道抗钙化性能的作用,为研制组织工程化肺动脉带瓣管道做准备。方法:实验分为3组,即A组:为新鲜猪肺动脉带瓣管道组织,B组:用胰蛋白酶+Triton X-100处理的脱细胞猪肺动脉带瓣管道组织和C组:在B组处理的基础上再经透明质酸酶消化,去除细胞外蛋白多糖基质成分的猪肺动脉带瓣管道组织,每组4份(n=4)。方法:实验室:将3组样本分别进行HE染色后,用光镜和扫描电镜观察肺动脉管壁及瓣膜组织的变化。采用盐酸胍抽提结合阿利新蓝染色法测定蛋白多糖的含量。同时将3组样本包埋于大鼠皮下,于6周后取出标本进行Van Kosaa银染色法(钙盐染色)和原子吸收分光光度计法分别定性、定量分析组织的钙化程度。结果:光镜和电镜检查结果显示,猪肺动脉管壁和瓣膜组织的细胞可以较完整的去除,纤维网架结构可以完整保持。蛋白多糖含量的测定显示,与A、B组相比,C组细胞外基质蛋白多糖的含量显著下降(P<0.05)。大鼠皮下包埋实验显示,与A、B两组相比,C组的钙化反应更少,管壁组织钙的含量显著下降(P<0.05)。结论:采用胰蛋白酶+Triton X-100脱细胞方法可以达到去除细胞的目的。通过大鼠皮下包埋实验证明,采用透明质酸酶消化减少细胞外基质蛋白多糖的含量可以进一步减少脱细胞组织的钙化反应,为组织工程肺动脉带瓣管道的构建提供较为理想的脱细胞基质材料。     

去细胞组织工程猪肺动脉带瓣管道的生物相容性研究

目的:探讨去细胞组织工程猪肺动脉带瓣管道的生物相容性。方法:①新鲜猪肺动脉带瓣管道组织3份,A组为对照组,B、C组采用胰蛋白酶+Triton X-100对新鲜猪肺动脉带瓣管道进行去细胞处理,C组在去细胞处理后行明胶嵌合再处理;②对3组瓣膜及管壁组织行大鼠皮下包埋实验,8周后观察材料的组织相容性和生长情况;③通过动态凝血试验、溶血试验、血小板粘附性能试验分析3种组织材料的血液相容性。结果:与A组相比,B组及C组的炎性细胞浸润显著减少,C组仅有轻微组织反应;B、C组材料组织相容性好,并于8周后有纤维细胞长入。相对A组及B组,C组的瓣膜及管壁组织具有更低的凝血率,OD-凝血时间曲线下降更缓慢且吸光度高,同时血小板粘附更少且没有明显变形和伪足。结论:这种去细胞组织工程猪肺动脉带瓣管道不仅具有极低的免疫原性,而且具有一定的生长潜能、良好的组织相容性及血液相容性,有可能成为一种新的、理想的组织工程肺动脉带瓣管道支架材料。