肺炎克雷伯菌质粒介导AmpC酶和ESBLs的研究进展

肺炎克雷伯菌（PK）是医院获得性感染最常见的致病菌之一。近年来,由于在PK中发现了质粒介导AmpC酶并产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）,产生了多重耐药现象,给临床抗感染治疗带来了更多困难和挑战。现主要针对此两种酶的种类、耐药表型、分子生物学特性、存在现状以及实验室检测方法等研究进展进行综述。     

痰热清注射液对产ESBLs肺炎克雷伯菌的体外抑制作用

目的观察产ESBLs肺炎克雷伯菌在体外对中药痰热清注射液以及其与特治星（哌拉西林/他唑巴坦）联合应用的效果,为耐药菌株的治疗提供新的思路。方法采用临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的肉汤稀释法,中药及中西药联合应用对产ESBLs肺炎克雷伯菌进行抑菌试验。结果痰热清注射液对产ESBLs的肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度（MIC）值为750μL/mL;特治星对产ESBLs的肺炎克雷伯菌的MIC值为28.125μg/mL,当痰热清注射液与特治星同时作用于产ESBLs的肺炎克雷伯菌,痰热清注射液浓度为0.001~1.758μL/mL时,可以使特治星的用量比单用时减少1~2倍。结论中西药联合应用具有明显的抑菌效果,可以显著的减少抗菌药物的用量,这对于耐药菌的临床治疗以及减少耐药菌株的产生具有一定的意义。     

与ISEcp1—like插入序列相关的CTX—M型ESBLs基因传播机制研究

目的研究CTX—M—ESBLs在天津地区肺炎克雷伯菌中的传播与ISEcp1—like插入序列及1类整合子的关系。方法采用PCR-mapping、Southern印迹杂交及DNA序列分析等方法检测CTX-M-ESBLs基因，及其与ISEcp1—like插入序列和1类整合子的关系。结果46株产ESBLs肺炎克雷伯菌中44株（95．7％）携带CTX—M-1组和（或）CTX—M-9组基因，未发现CTX—M-2组基因。60％的CTX—M-1组β内酰胺酶基因和73．7％的CTX-M-9组β内酰胺酶基因上游存在ISEcp1—like插入序列。ISEcp1—like插入序列与CTX—M-3及CTX-M-14基因间隔区序列不同。46株中25株（54．3％）携带1类整合子基因，PCR—mapping及Southern印迹杂交未发现CTX—MB内酰胺酶基因在整合子上的证据。结论天津地区肺炎克雷伯菌临床株中存在CTX—M-ESBLs的流行，许多CTX—M—ESBLs基因上游存在ISEcp1—like插入序列。ISEcp1—like插入序列可能与CTX—M型超广谱酶基因在天津市肺炎克雷伯菌临床株中的播散有关。     

肺炎克雷伯菌中qnr基因检测

目的了解质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr在肺炎克雷伯菌中流行及与ESBLs及对环丙沙星耐药的相关性.方法 纸片扩散法检测药物敏感性,双纸片协同试验检测ESBLs.PCR方法检测qnr基因.结果 62株非重复的肺炎克雷伯菌中,ESBLs阳性率为75.8%(47/62),环丙沙星敏感率为45.2%(28/62),qnr总阳性率为53.2%(42/62).单纯qnrA阳性5株(8%),qnrB9株(14.5%),qnrS10株(16.1%).同时2种qnr基因阳性9株(14.5%),qnrA和qnrB基因阳性1株(1.6%),qnrA和qnrS基因3株(4.8%),qnrB和qnrS基因5株(8%).在环丙沙星耐药株和敏感株中,qnr基因的阳性率分别为58.8%(20/34)和46.7%(13/28).在ESBLs阳性菌株和阴性菌中,qnr的阳性率分别为68%(32/47)和6.6%(1/15).结论 qnr基因主要分布在产ESBLs的肺炎克雷伯菌,与环丙沙星耐药与否无相关.     

肺炎克雷伯菌临床分离株aac(6')-Ib-cr基因的检测

目的 调查肺炎克雷伯菌临床分离株aac(6')-Ib-cr基因存在情况.方法 收集2006年1月至2007年9月从临床分离的337株非重复的肺炎克雷伯菌.挑选64株对庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素任何一种耐药的肺炎克雷伯菌临床分离株进行aac(6')-Ib-cr基因检测,采用PCR法检测aac(6')-Ib和Ⅰ类整合酶基因(intll),通过DNA直接测序确定aac(6')-Ib-cr.抗生素MIC值测定采用琼脂稀释法.ESBLs检测采用双纸片扩散法,通过接合试验检测质粒是否可以发生转移.结果 337株肺炎克雷伯菌临床分离株中,对庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素的耐药率分别为19.0%(64/337)、8.3%(28/337)和16.3%(55/337).共有24株细菌经PCR证实aac(6')-Ib基因阳性,经测序证实全部为aac(6')-Ib-cr基因,阳性率为37.5%(24/64).24株aac(6')-Ib-cr基因阳性株中,有13株对环丙沙星耐药(MIC≥2 mg/L)和11株环丙沙星敏感(MIC≤0.25～1.0 mg/L).aac(6')-Ib-cr基因在环丙沙星耐药菌株和环丙沙星敏感菌株中的检出率分别为54.2%(13/24)和27.5%(11/40),经X2检验,差异具有统计学意义(X2=11.056,P＜0.01).24株aac(6')-Ib-cr基因阳性株中,ESBLs和intl1基因的阳性率分别为79.2%(19/24)和91.7%(22/24).13株aac(6')-Ib-cr基因阳性菌株的质粒成功转移至受体菌,以受体菌质粒DNA为模板进行aac(6')-Ib-cr检测,13株受体菌质粒全部为aac(6')-Ib-cr基因和intl基因阳性,全部为ESBLs阳性株.结论 aac(6')-Ib-cr基因广泛存在于肺炎克雷伯菌临床分离株中,aac(6')-Ib-cr可能通过Ⅰ类整合子和ESBL基因同时位于可转移的质粒上造成传播.     

单产超广谱β-内酰胺酶和同时产超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶肺炎克雷伯菌的临床分布与耐药性分析

目的：了解武汉大学人民医院2003年3月至2005年3月间单产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、同时产超广谱ESBLs＋头孢菌素酶（AmpC酶）肺炎克雷伯菌的临床分布及耐药性。方法：采用VITEK—AMS细菌鉴定系统进行细菌鉴定，药敏试验采用KB法，AmpC酶用三维试验法检测．结果分析采用WHONET5软件。结果：检出产ESBLs肺炎克雷伯菌131株，检出率为38-3％，检出产ESBLs＋AmpC酶肺炎克雷伯菌76株，检出率为22．2％，尿液与脓液中产ESBLs＋AmpC酶菌株、产ESBLs菌株检出率最高；在分科调查中，ICU病房产ESBLs菌株、产ESBLs＋AmpC酶菌株检出率最高；在年龄调查中，71—80岁组产ESBLs、ESBLs＋AmpC酶菌株检出率最高，检出率与年龄大致呈正相关。耐药性方面，单产ESBLs＋AmpC酶菌株较产ESBLs菌株呈现更复杂的多重耐药。结论：产ESBLs＋AmpC酶肺炎克雷伯菌的感染在临床上已广泛存在，多重耐药明显，临床应及时了解其耐药特点及变化趋势，以便合理使用抗生素。     

肺炎克雷伯菌中质粒介导的AmpC酶及相关表型研究

目的 证实临床分离的部分肺炎克雷伯菌（Kp）除产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）外，还同时产AmpC酶，并探讨了AmpC酶编码基因存在方式。方法 对临床分离的可疑同时产ESBLs和其他高活性广谱β内酰胺酶的8株Kp进行接合试验，并对供体菌和接合子同时采用三维试验、ESBLs试验、AmpC酶诱导试验和β内酰胺类抗生素最低抑菌浓度（MIC）试验测定，并进行AmpC基因携带状态、表达方式和酶活性分析。结果 8株Kp菌通过接合试验共得到10株接合子，其中有6株供体菌均只得到同时表达AmpC和ESBLs的1种接合子；另2株供体菌，各得2株接合子，1株同时表达AmpC和ESBLs，1株仅表达ESBLs；8株供体菌均未得到单独表达AmpC的接合子。表达AmpC接合子的耐药表型与受体菌非常接近，酶的活性也必须用克拉维酸（CA）和邻氯西林（CLO）两种酶抑制剂才能完全抑制，其中有5株可被头孢西丁（FOX）诱导使某些指示药出现截平现象。结论 在Kp中，已出现质粒携带的AmpC基因，有可能与编码ESBLs的基因存在于同一质粒上，并具有诱导型和非诱导型两种表达形式。     

产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及其基因分析

目的了解临床分离菌中产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌发生率,分析其耐药表型,探讨其ESBLs基因类别。方法采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的纸片扩散法,对364株大肠埃希菌和71株肺炎克雷伯菌进行产ESBLs菌株初筛试验,并用双纸片确证试验和双纸片协同试验进行产ESBLs菌株确证。按照NCCLS文件标准,用KirbyBauer纸片扩散法进行产ESBLs株21种抗生素药敏试验。用PCR方法扩增168株ESBLs表型阳性菌中blaTEM1、blaSHV1、CTXM1组、TOHO1组等4种基因。结果(1)大肠埃希菌和克雷伯菌中产ESBLs的检出率分别为46.7%和32.4%。(2)产ESBLs菌对青霉素类100%耐药;对第1、2代头孢菌素耐药率达85%～100%;对除头孢他定以外的第3代头孢菌素,产ESBLs大肠埃希菌耐药率为80%以上,产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药率为65%～75%以上;产ESBLs菌对复方新诺明的耐药率为75%～85%;产ESBLs大肠埃希菌对环丙沙星耐药率为80%～90%、庆大霉素耐药率为50%～75%;产ESBLs菌对阿米卡星、头孢替坦、亚胺培南有较好的敏感性(80%～90%以上)。(3)产ESBLs大肠埃希菌中,blaTEM1、blaSHV1、CTXM1组等3种基因扩增阳性率分别为93.9%、7.4%和53.4%。51.4%的菌株同时携带2种耐药基因,2.7%的菌株同时携带3种耐药基因。产ESBLs肺炎克雷伯菌中blaTEM1、blaSHV1、CTXM1组等3种基因扩增阳性率分别为50.0%、95.0%和20.0%。同时携带2种耐药基因的菌株占35.0%,同时携带3种耐药基因的菌株占15.0%。两种细菌中均未检出TOHO1组基因。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产ESBLs的检出率较高,大肠埃希菌中产ESBLs菌比例有逐年上升趋势。产ESBLs菌对头孢噻肟的耐药率远高于头孢他定,且多数菌株对青霉素类,第1、2、3代头孢菌素、喹诺酮类、磺胺类、氨基糖甙类等抗生素呈多重耐药。大肠埃希菌中以TEM型和CTXM型基因为主。肺炎克雷伯菌以SHV型基因为主,同时存在TEM型和CTXM型基因。     

产KPC酶肺炎克雷伯菌检测及耐药性研究

目的探讨我院产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药率升高的原因。方法对2009—2011年我院各类临床标本中分离的肺炎克雷伯菌进行统计及药敏结果分析。对2010年1月—2011年12月间分离的耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌做改良Hodge试验和金属β-内酰胺酶检测,阳性菌株筛查KPC酶及耐药细菌（NDM-1）基因。结果 2009、2010年肺炎克雷伯菌对亚胺培南仍保持高敏感性,对2010年分离的8株耐亚胺培南的肺炎克雷伯菌做改良Hodge试验均为阴性（2009年菌株未保留）。2011年肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药性显著升高,47株耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌改良Hodge试验阳性,KPC酶阳性;2株耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌金属β-内酰胺酶阳性;所有菌株NDM-1基因检测均为阴性。结论由KPC酶介导的耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌在临床分离菌株中显著增加。KPC酶基因的出现是碳青霉烯类抗菌药物广泛应用引起的耐药基因突变,携带KPC酶的质粒存在不同种属细菌间进行转移的可能性,临床应加强监控,防止产碳青霉烯酶菌株在医院环境中暴发和流行。     

Gambol and Tc1 are two distinct families of DD34E transposons: analysis of the Anopheles gambiae genome expands the diversity of the IS630-Tc1-mariner superfamily

Tc1 is a family of DNA transposons found in diverse organisms including vertebrates, invertebrates and fungi. Tc1 belongs to the IS630-Tc1-mariner superfamily, which is characterized by common 'TA' target site and conserved D(Asp)DE(Glu) or DDD catalytic triad. All functional Tc1-like transposons contain a transposase with a DD34E catalytic triad. We conducted a systematic analysis of DD34E transposons in the African malaria mosquito, Anopheles gambiae, using a reiterative and exhaustive search program. In addition to previously described Tc1-like elements, we uncovered 26 new DD34E transposons including a novel family that we named gambol. Designation of family status to gambol is based on phylogenetic analyses of transposase sequences that showed gambol and Tc1 transposons as distinct clades that were separated by mariner and other families of the IS630-Tc1-mariner superfamily. The distinction between Tc1 and gambol is also consistent with the unique TIRs in gambol elements and the presence of a 'W[I/L/V]DEDC' signature near their N-termini. This signature is predicted as part of the 'RED' domain, a component of the 'PAI' and 'RED' DNA binding domains in Tc1 and possibly mariner. Although gambol appears to be related to a few DD34E transposons from cyanobacteria and fungi, no gambol has been reported in any other insects or animals thus far. Several gambol and Tc1 elements have intact ORFs and different genomic copies with high sequence identity, which suggests that they may have been recently active.     

前S1蛋白与乙肝病毒DNA和e抗原对乙肝病毒复制诊断的研究

乙型肝炎病毒(HBV)的衣壳蛋白包括S蛋白与前S蛋白,后者又分为前S1蛋白(Pre-S1)和前S2蛋白(Pre-S2)。Pre-S1蛋白含有肝细胞膜受体,在HBV感染肝细胞和机体免疫应答的过程中起重要作用。对慢性乙型肝炎患者与健康对照者进行了HBV标志物、Pre-S1蛋白和HBV DNA的检测,旨在分析Pre-S1     

甾醇类新药NSC67657诱导THP-1细胞分化及ICAT蛋白在细胞分化中的作用研究

目的 研究新的甲磺酸甾醇类药物NSC67657对白血病细胞的诱导分化作用及可能机制.方法 采用MTT法分析在不同浓度NSC67657作用下THP-1细胞的增殖水平,通过细胞表面分化抗原的检测,观察不同药物浓度、不同作用时间处理的THP-1细胞分化程度,并对完全分化细胞做形态学分析.通过RT-PCR和Western blot方法观察药物作用细胞前后β-catenin相关蛋白1(ICAT)基因和蛋白的表达情况;构建pDsRed-ICAT真核表达载体,测序后转染THP-1细胞,筛选阳性克隆,并做表达验证.采用流式细胞术,瑞特染色和超微结构观察,分析重组质粒转染细胞在药物处理前和处理24 h后THP-1细胞的分化情况.结果 通过比较可见药物处理后的THP-1细胞增殖明显受抑;细胞表面分化抗原CD14的表达水平随药物处理时间的延长和药物浓度的升高而增加,结合增殖分析,以10 μmol/L药物、连续诱导5 d为宜,细胞分化可达到90%以上.形态学观察验证了THP-1细胞在NSC67657的作用下向单核系分化.真核表达载体构建成功,电转后THP-1细胞ICAT基因和蛋白表达升高.药物作用前后,重组质粒转染THP-1细胞CD14的表达与对照组比较无明显差异;通过瑞特染色和超微结构观察,发现药物作用重组质粒转染THP-1细胞24 h后,细胞仍处初级分化阶段.结论 NSC67657可诱导THP-1细胞向单核系分化,并激活ICAT基因的表达,但仅是该基因的高表达并不 足以诱导THP-1细胞分化,也不会增加THP-1细胞对NSC67657 药物作用的敏感性.     

1例罕见B（A）血型鉴定及其临床安全输血策略初探

目的 鉴定罕见B（A）血型并探讨其临床安全输血策略。方法 利用全自动血型分析仪检测ABO血型,发现正反定型不符的一位患者,利用血型血清学和分子生物学方法对该患者及其家系中9位成员进行血型鉴定和ABO血型基因测序,分析该家族血型的遗传特点;并对该血型的患者进行临床输血探讨,确保临床输血安全。结果 患者为B（A）血型,与B101基因序列比对,均为nt640A>G,基因型鉴定为B(A)04/O01,B(A)型血清与同型红细胞以及O型、B型红细胞不凝集,B(A)型红细胞与同型以及AB型血清不凝集。结论 血型血清学方法可以对正反定型不符的B（A）血型做出初步判断,分子生物学技术可以进一步准确判断该血型;临床输血应采取自体输血、同型输注及配合相容性输血。