转移正相关基因mag-1的原核表达及抗体制备

目的:克隆人mag1-基因,在大肠杆菌中进行表达并制备其抗体。方法:利用PCR方法从含有mag1-基因全长序列的pcDNA3-mag1-质粒上扩增mag1-基因开放阅读框(ORF),将其插入表达载体pET-28 a( )中,构建重组表达载体pET-28 a-mag1-,用IPTG诱导目的基因在E.coli中的表达,并通过W estern印迹方法对表达产物进行鉴定。表达产物经过初步纯化后作为抗原免疫兔制备多克隆抗体。结果:所获得的序列经测序分析与源序列一致;SDS-PAGE分析表明,经0.1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h后在E.coli中有大量的融合蛋白表达,相对分子质量约为18×103。W estern印迹分析提示,诱导表达产物能与H is单抗发生特异反应。ELISA结果表明获得了高效价的多克隆抗体。结论:获得了H is-mag1-融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,并制备了其相应的多克隆抗体。     

抗人红细胞单链抗体基因的克隆与表达

目的：获得抗人红细胞单链抗体（single-chain antibody,ScFv)基因,并在大肠杆菌中表达具有能与人红细胞特异性结合的ScFv。方法：以从分泌抗人红细胞单克隆抗体细胞株中提取细胞的总RNA为模板,利用扩增鼠源性抗体可变区基因的通用引物,通用RT－PCR分别获得轻链（VL）、重链（VH）可变区基因,并通过15个氨基酸的加接肽（Gly4Ser)3按VL－接头－VH的顺序连接起来,组建成ScFv基因。结果：核苷酸序列分析证明,获得的单链抗体基因VH基因属于小鼠抗体重链可变区基因家族的V（A）组,VL基因属于小鼠抗体k轻链可变区基因家族的IV组。与PGEX－5X－3表达载体上的GST融合蛋白表达后,在相对分子质量54000有一明显的空载体对照没有的蛋白带（ScFv28000,GST26000）。间接免疫荧光证明该表达产物能与人红细胞特异性结合。结论：获得抗人红细胞ScFv基因和具有抗体活性的抗人红细胞ScFv,为建立患者自身红细胞凝集试验奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

PD-1/PD-L1抗体与化学药物治疗眼部不良反应比较的Meta分析

 目的 探讨细胞程序死亡蛋白1(PD-1)及配体(PD-L1)抗体与化学药物治疗(化疗)在眼部免疫相关不良反应上的差异。方法 检索PubMed、EMbase、中英文数据库,时间截止为2019年12月。纳入恶性实体肿瘤采用PD-1/PD-L1抗体治疗与对照组采用化疗比较的临床研究。通过提取关键特征,应用RevMan 5.3对纳入研究进行Meta分析。应用漏斗图对纳入研究的发表偏倚进行评估。结果 PD-1/PD-L1抗体与化疗相比,眼部相关免疫不良反应(1~5级)及严重不良反应(3~5级)发生率差异无统计学意义[OR=1.34,95%CI(0.64~2.80);OR=1.20,95%CI(0.35~4.08)]。漏斗图基本对称分布,偏倚可控。PD-1抗体与化疗相比,眼部相关免疫不良反应(1~5级)及严重不良反应(3~5级)发生率无统计学差异[OR=1.20,95%CI(0.55~2.65);OR=1.00,95%CI(0.26~3.86)]。PD-L1抗体与化疗相比,眼部相关免疫不良反应(1~5级)及严重不良反应(3~5级)发生率无统计学差异[OR=2.82,95%CI(0.29~27.19);OR=2.85,95%CI(0.12~70.15)]。结论 免疫治疗药物PD-1/PD-L1抗体眼部免疫相关不良反应总体发生率、严重程度与化疗相比无统计学差异。     

基因免疫法制备小鼠抗人肝素酶多克隆抗体

目的:利用基因免疫的方法制备抗人肝素酶抗体.方法:用本室构建的表达肝素酶全长质粒pcDNA3.1(+)-HPA为基因免疫载体,免疫6～8周龄雄性BALB/c小鼠,使得质粒上的目的基因在动物体内表达,诱导动物体对DNA编码的外源蛋白产生抗体而获得肝素酶的抗血清,通过间接ELISA方法测定小鼠抗血清效价,Western 印迹鉴定抗血清特异性.结果:获得了效价较高的小鼠抗血清,最高效价可达到1∶5×104;抗体特异性与标准品一致.结论:建立了一种制备肝素酶抗体的新方法.     

HCCR-2基因的克隆及原核表达

目的:克隆HCCR-2基因、原核表达并鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得HCCR-2基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的HCCR-2基因亚克隆到pET-28a( )表达载体中,构建HCCR-2表达载体,IPTG诱导表达1~5h,做SDS-PAGE分析,鉴定HCCR-2蛋白的表达。结果:DNA测序证明,获得了HCCR-2基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,HCCR-2蛋白获得高效表达,其相对分子质量为39kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论:HCCR-2基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨HCCR基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

rhTPO的克隆及其在原核细胞中的表达

为了更加简便有效地得到重组人血小板生长因子（ｒｈＴＰＯ），以治疗放射及化学药物等所致骨髓损伤造成的血小板减少与缺乏，缓解临床上的出血症状，降低死亡率。方法本实验从６月龄人胚胎肝脏细胞中分离ｍＲＮＡ，设计合成特异性引物，经逆转录，套式ＰＣＲ等步骤克隆出了人ＴＰＯ全基因。将人ＴＰＯ基因亚克隆至原核细胞表达载体ｐＢＶ２２０，形成了重组表达质粒ｐＢＶ２２０／ＴＰＯ，以该重组质粒转化了原核细胞大肠杆菌ＤＨ５α，应用４２℃热诱导表达目的蛋白。结果经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到了ＴＰＯ在原核细胞中的表达，其分子量与目的一致。结论ｈＴＰＯ可以在原核细胞得到良好的表达，为临床血小板减少症的生物治疗奠定了基础。     

人宫颈癌HPC2基因的克隆及其原核和真核表达载体的构建

目的:构建人宫颈癌HPC2基因的原核及真核表达载体,进一步研究该基因在宫颈癌发生中的作用。方法:从人宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA。用RT-PCR方法扩增出人宫颈癌HPC2全序列基因,插入pT7 b lue载体。酶切鉴定及序列分析后,构建人HPC2基因的原核及真核表达载体。结果:成功扩增出人宫颈癌HPC2基因;并构建pGEX4T1-HPC2原核表达载体及pCMV-F lag-HPC2真核表达载体。结论:人HPC2基因的原核及真核表达载体的构建为深入研究HPC2基因与宫颈癌的发生奠定了基础。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的 克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平.方法 应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Western blot证实表达蛋白的特异性.应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析.结果 RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Western blot证实了表达的重组蛋白的特异性.HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达.结论 成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平.     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

目的 从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1（KGF-1）编码区序列,构建真核荧光表达载体.方法 从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录 PCR获取KGF-1 cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定.将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞（marrow stroma cells,MSCs）48 h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达.结果 构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致.KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内.结论 成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础.