实时荧光逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用

目的 探讨实时荧光逆转录(RT)-PCR方法检测急性戊型肝炎患者血清戊型肝炎病毒(HEV)RNA的意义.方法 采用实时荧光RT-PCR方法,对HEV ORF3基因保守区进行扩增和检测.收集北京佑安医院住院和门诊434例急性戊型肝炎患者血清;甲型肝炎患者40例、乙型肝炎患者100例、健康献血员110名作为对照组;提取HEV RNA进行荧光RT-PCR检测.结果 434例急性戊型肝炎患者血清中232例(53.5%)为HEV RNA阳性.对照组血清HEV RNA检测均为阴性.与血清抗-HEV IgM检测比较,434例急性戊型肝炎患者HEV RNA检测的总符合率为67.1%,两种检测方法差异有统计学意义(Kappa=0.308,P=0.000).5例患者的首份血清检测为HEV RNA阳性,但抗-HEV IgM为阴性,系列追踪检测,相继出现抗-HEV IgM阳性.急性戊型肝炎患者的血清HEVRNA的检出多在发病的2～10 d内.结论 荧光RT-PCR方法有较高的特异性,应用实时荧光RT-PCR方法能对Ⅰ和Ⅳ戊型肝炎病毒感染的患者血清中的RNA进行定性检测.在临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平.     

庚型肝炎病毒NS3区聚合酶链反应RNA检测

2000—04～2003—12我们采用庚型肝炎病毒（HGV）NS3区逆转录-套式-聚合酶链反应法检测临床各型肝炎187例的血清HGV RNA，现将结果报告如下。     

RT—PCR单管法检测庚型肝炎病毒RNA

探讨建立了一种更简便,特异,灵敏的逆转录－巢式聚合酶链反应单管法检测庚型肝炎病毒ＨＧＶＲＮＡ,通过优化Ｍｇ＾２＋外引物浓度等实验参数,在一个Ｅｐｐｅｎｄｏｆ管中先后进行逆转录和巢式ＰＣＲ扩增等三步反应,３４２ｂｐ扩增终产物核苷酸序列采用直接测序法测定。本方法可检出１０＾４～１０＾５倍稀释的标准阳性血清,用ＲＴ－ＰＣＲ单管法与常规三步法比较检测了不同类型肝炎患者和职业献血员１７８份血清标志ＨＧＶＲＮ     

PCR和巢式PCR直接检测血清中HIV核酸序列

采用ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ方法对５３例ＨＩＶ抗体阳性和阴性标本进行了检测，以扩增ＨＩＶ特异性ＤＮＡ序列，结果美国ＡｂｂｏｔｔＨＩＶ阳性血清２份，新加坡阳性血清２份，国内阳性血清２份及ＨＩＶ－１病毒培养物１份，两套ＰＣＲ扩增反应物均为阳性，对其中一套ＰＣＲ扩增的ｇａｇ基因序列进行巢式ＰＣＲ也为阳性。采自西南边境地区的２３份ＥＬＩＳＡ和ＷＢ阳性血清，各种ＰＣＲ反应均为阳性；１１份ＥＬＩＳＡ可疑阳性、ＷＢ阴性标本中，有两例血清呈ＰＣＲ阳性，探针杂交亦为阳性。而１２例ＳＩＶ、ＳＲＶ及猴血清标本ＰＣＲ反应均为阴性。上述结果表明，采用ＰＣＲ方法检测血清中ＨＩＶ核酸序列是一种很有前途的ＨＩＶ感染诊断方法。     

逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA

利用与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组５＇非编码区保守序列同源的套式引物，建立了检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，由于在引物设计中选择了最保守的区域且避开了与黄病毒属的同源序列，保证了ＰＣＲ检测的灵敏度和特异性。经逆转录和两轮ＰＣＲ扩增，可检出１×１０－３ｕｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。研究了影响ＨＣＶＲＮＡＰＣＲ检测的各种因素，并对ＲＮＡ分离及ＲＴ－ＰＣＲ反应体系进行了优化，在此基础上研制了ＨＣＶ的ＰＣＲ检测试剂盒。     

两种方法检测HCV-RNA的结果分析

目的比较两种方法检测丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)的结果。方法逆转录套式定性PCR(RT-nestedPCR)和荧光定量PCR对288例抗-HCV阳性的丙型肝炎患者血清标本进行HCV-RNA检测。结果288例抗-HCV阳性血清标本有248例RT-nested-PCR结果阳性,阳性率为86.1%(248/288);226例荧光定量PCR检测HCV-RNA>103拷贝/ml,检出率为78.5%(226/288),两种检测结果的阳性符合率为85.9%(219/255)。同时,29例标本定性结果阳性,定量结果<103拷贝/ml;7例标本定性结果阴性,定量结果>103拷贝/ml,差异具有统计学意义(χ2=12.25,P<0.01)。结论两种方法检测HCV-RNA,可以提高检测的灵敏度,为临床治疗提供依据。     

RT—PCR检测庚型肝炎的临床初探

自1995年，Abbott公司的Simmons等[1]报道，应用分子生物技术发现了新型肝炎病毒-GB病毒或后称庚型肝炎病毒（HGV）以来，引起了众多学者的关注．为了解HGV与临床的关系，我们采用逆转录ICR（RT－PCR）检测高危人群中的HGV－RNA．材料和方法一、标本来源我院收治的病人血清，76例，男47例，女29例，19～55岁，临床确诊：慢活肝（CAN）20例、丙型肝炎3例，血透析病人11例，ALT反覆轻度异常的非A－E型肝炎病人42例．二、检测方法HGVRT-PCR试剂盒由军事医学科学院放射医学研究所提供，检测步骤按说明书操作，扩增产物经琼脂糖…     

1型HIV感染多重PCR检测方法的建立

重复性,能覆盖我国最主要的流行病毒株.     

献血员庚型肝炎病毒感染的研究进展

自1989年确认丙型肝炎病毒(HCV)与戊型肝炎病毒(HEV)以来,仍有少部分肝炎患不能用现有实验室诊断方法分型,提示可能存在着新型肝炎病毒。1995年,美国的Simmons和Linnen等学率先应用分子生物学技术发现一种新型肝炎病毒—庚型肝炎病毒(GBV-C／HGV)。各国学也相继建立了多种GBV-C／HGV血清标本的实验室检测方法．并运用到病毒性肝炎的临床诊断和流行病学研究中去,并取得重要进展。     

HCV RNA基因分型多色荧光PCR筛查和确认方法的建立

目的建立多色荧光丙型肝炎基因分型检测方法。方法针对HCV5＇NCR区特异性基因设计一对通用引物和Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型特异性探针,Ⅰ型和Ⅲ型探针标记FAM荧光染料,Ⅱ/Ⅳ型标记VIC荧光染料,分别建立Ⅰ/Ⅱ型和Ⅲ/Ⅳ型两管双色荧光PCR扩增系统。分别采用测序和本研究方法对97份丙型肝炎阳性血清进行分型,比较两种方法分型结果的一致性,并对双色荧光法检测的2889例HCV分型结果进行分析。结果在97份丙型肝炎阳性血清中,双色荧光法分出Ⅰ型65例（67.0%）,Ⅱ型25例（25.8%）,Ⅲ型2例（2.1%）,Ⅰ/Ⅱ混合型3例（3.1%）,有2例HCVRNA定量为（1～3）×103IU/ml弱阳性标本未分出型;测序法分出Ⅰ型61例（62.9%）,Ⅱ型24例（24.7%）,Ⅲ型2例（2.1%）,Ⅰ/Ⅱ混合型2例（2.1%）,有8例HCVRNA定量结果为（1～5）×103IU/ml的阳性标本测序法未分出型,有1例Ⅰ/Ⅱ混合型标本测序无法判断,而荧光法分型明确。我院采用本研究建立的方法检测2889例临床丙型肝炎标本,2268份分出基因型,其中Ⅰ型1545例（68.1%）,Ⅱ型702例（31.0%）,Ⅰ/Ⅱ混合型18例（0.8%）,Ⅲ型3例（0.1%）,高HCV载量血清全部涵盖在Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型中,未发现Ⅳ型和其他型的病例。结论本研究建立的双色荧光HCV基因分型的方法具有良好的敏感性、特异性、可重复性且省时省力,由于近99%的HCV阳性血清为Ⅰ/Ⅱ型,所以临床可选择Ⅰ/Ⅱ型试剂进行常规检测,对高病毒载量而非Ⅰ/Ⅱ型的标本可采用Ⅲ/Ⅳ型试剂进一步分型明确。     

新疆地区献血者HGV和TTV感染的流行病学分析

目的：研究分析庚型肝炎病毒（HV）和输血传播病毒（TTV）在新疆地区献血中的感染状况，方法：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测抗－HGV IgG、逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术检测HGV RNA，聚合酶链反应（PCR）技术检测TTV RNA，对1997年维吾尔族献血和321名汉族献血的血清标本进行了检测分析。结果：518名研究对象中抗－HBV IgG的阳性检险率为6．5％（34／518）。维吾尔族和汉族血抗－HBV IgG阳性率分别为11．2％（22／197）和3．7％（12／321），X^2=10．9，P＜0．005，维吾尔族有偿献血，无偿献血抗－HBV IgG阳性率分别为13．5％（21／156）、2．4％（1／41），X^2＝4．0，P＜0．05；汉族有偿献血、无偿献血抗－HGV IgG阳性率分别为7．5％（8／106）和1．9％（4／215），X^2＝6．4，P＜0．05，维吾尔族和汉族抗－HGV阳性献血HGV RNA阳性率分别为77．3％（17／22）和66．7％（8／12），X^2=0．5，P＞0．05。维吾尔族和汉族献血TTV DNA阳性率分别为25．7％（9／35）和13．0％（6／46），X^2＝2．1，P＞0．05，抗－HGV阳性和阴性献血中TTV DNA阳性率分别为35．3％（12／34）和14．0％（7／50），X^2=5．2，P＜0．05。结论：新疆地区存在HGV和TTV感染，有偿献血为HGV感染的高危人群，抗－HGV阳性献血有更高的TTV DNA检出率，这种重叠感染的机制有待进一步研究分析。     

2000～2002年丙型肝炎病毒核酸逆转录聚合酶链反应测定室间质量评价

目的 评价2000年至2002年临床基因扩增检验实验室在丙型肝炎病毒(HCV)RNA逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测中的质量。方法 从2002年至2003年每年进行质评两次，每次发放HCVRNA样本5份，其中阳性样本3—4份，含量在10^4-10^7拷贝数／ml范围内。阴性样本1～2份，均为冻干品。要求各个实验室按规定时间检测并回报结果，然后统计分析。结果 对质评样本测定全部正确的比率从2000年的001批的53．3％(24／45)、002批的4．8％(2／42)和2001年011批的73．8％(31／42)、012批的79．2％(42／53)，上升到2002年021批的89．7％(105／117)和022批的91．6％(109／119)。假阳性率也从2000年和2001年的高至26．7％和14．3％降至2002年的8．0％以下。对在10^5和10^4拷贝数／ml数量级的质评样本，测定假阴性率从2000年的15．6％(0011)、19．0％(0025)和81．0％(0023)下降到2001年的11．9％(0112)、11．3％(0125)和9．5％(0115)，到2002年更是下降到了4．6％(0221)、3．7％(0223)和3．8％(0212)。从试剂盒的临床使用评价来看，从2000年到2002年各厂家试剂的临床检测特异性、灵敏度和符合率均有明显改善。结论 从2000-2002年全国临床HCV RNA RT-PCR测定假阳性和假阴性明显降低。说明所建立的HCV RNA临床RT-PCR测定室间质量评价项目能很好的监测实验室存在质量问题，从而促使其加以改进。     

TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５’端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％。凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录。套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率达９３．３％（１４／１５）。ＴｔｈＤＮＡ聚合酶用于ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ５’端非编码序列片段具有敏感性高、特异性强、稳定性好的优点。     

血浆丙型肝炎病毒核酸稳定性的研究

目的：建立血浆丙型病毒性肝炎病毒(HCV)核酸的稳定保存方法，提高荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测的准确性。方法：HCV混合血浆以TRIZOL提取病毒核酸，分别保存于70％乙醇溶液及溶解于焦碳酸二乙醇(DEPC)水中。在4℃放置不同时间后，以FQ-PCR检测HCV RNA拷贝数。HCV RNA冻干质控品溶解于DEPC水并提取核酸后同时测定作为对照。另外，对保存的HCV RNA稀释后作线性分析。结果：未提取核酸的病毒血浆及70％乙醇溶液中的HCV RNA在4℃保存8d后，病毒核酸拷贝数无明显改变。HCV RNA DEPC水溶液在4℃放置30min后即发现拷贝数降低,5h后下降为零。质控品测定值无明显降低。在70％乙醇溶液中保存的HCV RNA稀释后测定值具有线性(r=0．9991)。结论：病毒在血浆及70％乙醇溶液中保存，其核酸可以在4℃稳定保存至少8d并具有良好的线性。病毒核酸DEPC水溶液在4℃易发生降解。     

戊型肝炎病毒IgM抗体阳性患者系列血清3种生物标志物结果分析

目的分析戊型肝炎病毒（HEV）IgM抗体阳性患者的入院时、住院中和出院时的系列血清中3种生物标志物的变化情况及其诊断意义。方法收集临床常规检测的HEVIgM抗体阳性患者的入院时、住院中和出院时的血清,用酶联免疫（EIA）试剂检测HEVIgG抗体和IgM抗体,用实时荧光PCR方法检测核酸,分析其变化情况。结果在25例HEVIgM抗体阳性患者系列血清中,HEVIgM抗体为4例高值无明显变化、15例高值明显下降变化、1例明显升高变化、5例低值无明显变化,HEVIgG抗体为3例高值无明显变化、15例高值明显升高变化、4例高值下降后维持高值、1例低值转为阴性、2例始终阴性,HEVRNA为入院第1天22例（88％）阳性、入院后1周15例（62．5％）阳性、入院后2周1例（5．6％）阳性。结论戊型肝炎患者发病过程中,系列血清HEV IgG抗体和IgM抗体及HEV RNA联合检测有助于戊型肝炎的明确诊断。     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

淋巴细胞HLA-A mRNA方法学建立及在乙型肝炎病毒感染患者中的应用

目的建立外周血淋巴细胞HLA-A mRNA的检测方法,探讨其在慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者中的应用价值。方法改良法提取人外周血淋巴细胞RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法扩增HLA-A mRNA,琼脂糖凝胶电泳结果采用Bandscan软件分析相对灰度值,半定量HLA-A的基因表达。结果半定量HLA-A所得平均相对灰度值在慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组、正常对照组分别为0．54±0．21、0．34±0．27、0．22±0．16、0．95±0．19。慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组均明显低于正常对照组(P<0．05),慢性乙型肝炎组与肝癌组,肝硬化组与肝癌组相比差异有统计学意义(P<0．05),慢性乙型肝炎组与肝硬化组有下降趋势。结论成功建立检测HLA-A基因的RT-PCR一步法,从基因转录水平上证实慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血淋巴细胞HLA-A下调,且与相应患者细胞免疫功能减弱密切相关。