SSc患者外周血外泌体通过microRNA-21介导成纤维细胞活化北大核心CSCD

目的比较系统性硬皮病患者(systemic sclerosis,SSc)与正常人外周血外泌体(exosome)中microRNA-21-5p(miR-21-5p)的表达差异,评估外周血中外泌体对人皮肤成纤维细胞功能状态的影响。方法提取SSc患者及正常人外周血外泌体,荧光定量PCR法检测miR-21-5p表达情况;外泌体刺激人皮肤成纤维细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫印迹检测CollagenⅠ,Ⅲ及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。结果 SSc患者外周血外泌体中miR-21-5p显著高于正常人。与正常人相比,患者外泌体可明显增强人皮肤成纤维细胞的增殖能力及上调CollagenⅠ,Ⅲ,α-SMA的水平,上述作用可被转染miR-21-5p抑制剂阻断。结论 SSc患者循环外泌体通过转运miR-21-5p介导人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。miR-21-5p可能是SSc潜在的生物标记物。     

低氧对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的 研究低氧对系统性硬化病(SSc)患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成及胶原基因表达的影响。方法 分别以5例SSc患者和5例正常人皮肤成纤维细胞系作为实验对象。将成纤维细胞分别放入20%正常氧和2%低氧分压环境中培养,用分光光度仪测定细胞培养基上清液中羟脯氨酸含量,并折算成胶原蛋白含量。用Trizol提取细胞总RNA,用RT-PCR方法测定其中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果 培养至第6天,低氧分压条件下,SSc患者皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量比正常氧分压条件下显著增加(t=3.97,P=0.0041);正常人皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量此时也显著增加(t=2.63,P=0.0302)。培养至第3天,低氧分压条件下,SSc成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=5.81,P=0.0004;Ⅲ型:t=6.44,P=0.0002);正常人皮肤成纤维细胞此时的Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量与SSc患者相似,低氧分压条件下比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=4.40,P=0.0023;Ⅲ型:t=2.24,P=0.0453)。结论 低氧状态下,SSc患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成均有增加,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达也均增加.低氧可能是皮肤硬化的一个相关因素。     

系统性硬皮病患者皮肤克隆成纤维细胞胶原代谢的异质性

目的在克隆水平上研究系统性硬皮病(SSc)和正常皮肤成纤维细胞(FB)胶原代谢异质性的特点。方法以皮肤克隆FB作为研究对象,采用实时荧光定量RT-PCR法检测其Ⅰ,Ⅲ型前胶原和基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-3)mRNA水平;采用酶联免疫吸附法检测其细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白的表达,筛选出具有不同胶原合成能力的异质性克隆,分析其胶原代谢的特点。结果 SSc和正常皮肤克隆FB的胶原代谢均具有异质性,SSc患者克隆FBⅠ,Ⅲ型前胶原mRNA水平的异质性较正常人大(F=20.540,P=0.000;F=6.822,P=0.012),SSc患者Ⅰ型前胶原mRNA高表达克隆的比例高于正常人(48.0%vs14.3%);SSc和正常皮肤克隆FB细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白水平与其mRNA水平均存在正相关关系(r=0.873,P=0.000;r=0.538,P=0.039)。结论 SSc和正常皮肤克隆FB的胶原代谢均具有异质性。     

miR-186-5p通过抑制Twist1诱导人皮肤成纤维细胞衰老

目的 探讨miR-186-5p对人皮肤成纤维细胞衰老的影响及其机制.方法 采用实时定量PCR方法检测miR-186-5p的表达,应用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、CCK-8和EdU等方法研究miR-186-5p对人真皮成纤维细胞(HDFs)衰老的作用.通过生物信息学分析、荧光素酶报告试验、实时定量PC...     

4种microRNAs在寻常型银屑病患者外周血中的表达

目的:研究寻常型银屑病患者外周血中miR-30e-5p、miR-192-5p、miR-17-3p、miR-1227-5p的表达情况。方法:采用实时荧光定量PCR技术检测60例寻常型银屑病患者和6例正常人外周血中的4种miRNAs表达,并对患者进行PASI评分,采用spearman检验分析4种miRNAs表达量与银屑病PASI评分的相关性。结果:与正常人比较,寻常型银屑病患者外周血中miR-30e-5p、miR-192-5p、miR-17-3p、miR-1227-5p表达下调,下调程度与PASI评分呈负相关(r值均0,P值均0.05)。结论:4种miRNAs可能可作为银屑病患者潜在外周血生物标志物,其表达量可用于评价银屑病病情严重程度。     

特应性皮炎患者外周血外泌体调控HaCaT细胞活化及炎症的研究

目的：明确特应性皮炎（AD）患者外周血中外泌体对角质形成细胞(KC)的活化及炎症的影响。方法：检测我院AD患者和健康人的外周血样本并分离血浆中外泌体，每组各30例。首先将0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L蛋白浓度的正常人-外泌体分别与人角质形成细胞系HaCaT细胞共培养，采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞的凋亡情况，确定外分泌体最佳实验浓度。然后将最佳浓度的外泌体与AD患者KC细胞共培养，利用荧光定量-PCR检测AD-外泌体组、正常人-外泌体组和空白对照组细胞的活化（K16）、分化（K10、IVL）、炎症指标（TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2）。结果：较其他浓度，40 g/L浓度下正常人-外泌体的HaCaT细胞增殖率最低，凋亡率最高，为最佳实验浓度。与对照组和正常人-外泌体组比较，AD-外泌体组中K16、K10、IVL、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表达上调（P<0.05），CXCL1表达水平无统计学差异（P>0.05）。结论：AD患者外周血外泌体可以促进KC的分化、活化及炎症因子的分泌，从而参与AD的发生发展。     

宫颈癌细胞外泌体miR-21调控PTEN/PI3K/AKT信号轴对淋巴管生成的影响

目的探究宫颈癌细胞外泌体miR-21对淋巴管生成的影响及机制。方法提取宫颈上皮细胞HcerEpic、宫颈癌细胞HeLa和C-33A三者分泌的外泌体(HcerEpic exo、HeLa exo和C-33A exo),采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HcerEpic、HeLa、C-33A及其所分泌外泌体中miR-21的表达;HeLa细胞转染miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、Negative control,提取转染后HeLa细胞的外泌体(HeLa/miR-21 mimic exo、HeLa/miR-21 inhibitor exo、HeLa/miR-NC exo),将上述外泌体与淋巴管内皮细胞HLECs共孵育后检测HLECs中miR-21的表达及小管生成能力;采用双荧光素酶报告基因验证miR-21和酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的靶向关系,检测转染siRNA抑制蛋白(PTEN)表达后的小管形成及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平;将HeLa/miR-21 mimic exo与HLECs共孵育后转染PTEN质粒(HeLa/miR...     

人脐间充质干细胞外泌体通过miR-126-3p抑制前列腺癌生长的相关研究

目的 探究人脐间充质干细胞外泌体(hucMSCs exo)miR-126-3p对前列腺癌生长的影响.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测RWPE.1、LNCaP、PC-3、C4-2中miR-126-3p表达水平.C4-2细胞中转染miR-126-3p mimic、inhibitor、negative...     

miR-17-3p在寻常型银屑病患者中的表达研究

目的:研究miR-17-3p在寻常型银屑病皮损及外周血中的表达情况,探讨其参与寻常型银屑病的发病机制。方法:收集寻常型银屑病患者(17例)的皮损组织和外周血及正常对照组(4例)皮肤组织和外周血,提取miRNA。采用Real-time PCR技术检测miR-17-3p miRNA的表达并进行比较。免疫组化法检测寻常型银屑病皮损组织(25例)和正常皮肤组织(15例)中miR-17-3p的可能靶基因FNIP1蛋白的表达,Pearson相关分析银屑病患者外周血中miR-17-3p的表达水平与患者PASI评分的相关性。结果:Real-time PCR显示miR-17-3p miRNA在寻常型银屑病患者组皮损及外周血中表达量较正常对照组均明显降低(t值分别为34.62、9.16,P值均<0.05)。miR-17-3p外周血中表达量与患者PASI评分呈负相关(r=-0.56,P=0.019)。寻常型银屑病患者皮损中FNIP1蛋白表达阳性率明显高于对照组(X~2=9.72,P<0.05)。结论:寻常型银屑病患者皮损及外周血中miR-17-3p表达下调可能与银屑病的发病有关,miR-17-3p可能通过调节靶基因FNIP1参与银屑病发病。通过检测外周血中miR-17-3p的表达量可能可以评估患者病情严重程度。     

白癜风患者外周血中miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p的表达与病情进展的研究

目的本研究旨在探讨miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p在白癜风患者外周血中的表达改变与病程发展的关系。方法本次研究选取2018年1月—2019年1月来我院治疗和检查的62例白癜风患者,平均年龄(23.25±2.11)岁,男30例(48.39%),女32例(51.61%),其中白癜风稳定期患者44例(71.77%),白癜风进展期患者18例(28.23%)。选取与白癜风组性别、年龄和体质量指数匹配的健康者作为对照组;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测受试者外周血中miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、mi R-630和miR-766-3p的表达量;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α和白细胞介素(IL)-1β蛋白水平含量;通过活性氧检测试剂盒和流式细胞仪检测受试者白癜风患者细胞内活性氧含量。结果随着白癜风病程发展,miR-155 m RNA和蛋白表达量逐渐增加,mi R-1238-3p、miR-202-3p、mi R-630和miR-766-3p mRNA和蛋白表达量逐渐降低(P0.05)。白癜风进展期miR-155 mRNA和蛋白表达量高于白癜风稳定期,mi R-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p mRNA和蛋白表达量低于白癜风稳定期(P0.05);相较于健康对照组,白癜风稳定期和白癜风进展期均能使TNF-α、IFN-γ、IFN-α和IL-1β含量增加,白癜风进展期TNF-α、IFN-γ、IFN-α和IL-1β含量高于白癜风稳定期;相较于健康对照组(2.36±0.15),白癜风稳定期(3.85±0.47)和白癜风进展期(8.18±0.56)活性氧含量均增加,且进展期高于稳定期(P0.05)。结论随着白癜风病程发展,外周血中mi R-155表达量逐渐增加,miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p表达量逐渐降低。     

脐带间充质干细胞外泌体对急性皮肤创面愈合的初步研究

目的:探讨脐带间充质干细胞（ucMSC）外泌体对急性皮肤创面愈合的影响。方法:用超高速离心法提取ucMSC外泌体,经透射电镜观察、Western印迹检测外泌体表面标志物CD63和TSG101和粒径分析鉴定外泌体。体外培养3~5代人皮肤成纤维细胞（HSF）,分别用含0（阴性对照组）、1、2 μg/ml外泌体的高糖DMEM...     

活血化瘀中药对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞胶原合成的影响

目的研究活血化瘀中药对系统性硬皮病(SSc)患者皮肤成纤维细胞胶原合成的影响.方法以组织块培养法建立3个SSc患者皮肤成纤维细胞株.将活血化瘀中药加入成纤维细胞培养液,其浓度分别为5g/L、2.5g/L和1.25g/L,于加药后第3、6 d,以分光光度法测定细胞培养上清液中羟脯氨酸浓度并折算成胶原浓度.结果积雪草和丹参在5g/L、2.5g/L及1.25g/L浓度下于作用第3 d和第6 d时能显著抑制SSc患者皮肤成纤维细胞的胶原合成(P＜0.05～0.01),红花在5 g/L、2.5g/L及1.25 g/L浓度下于作用第3 d和第6 d时能显著促进SSc患者皮肤成纤维细胞的胶原合成(P＜0.05).此外,当归在5g/L、茜草在2.5g/L浓度下于作用第6 d时也能显著抑制SSc患者皮肤成纤维细胞合成胶原(P＜0.05).结论不同的活血化瘀中药对皮肤成纤维细胞胶原合成的作用不一,该结果可为临床制定治疗SSc及其他相关疾病的中药方剂提供参考.     

硬皮病皮损CTGF,COL-Ⅰ Ⅲ的检测及意义

目的研究硬皮病(SD)发病与结缔组织生长因子(CTGF)及Ⅰ,Ⅲ型胶原(COL-Ⅰ,Ⅲ)表达的关系,探讨硬皮病可能的发病机制。方法采用免疫组化SP法检测72例SD患者皮损中CTGF蛋白及COL-Ⅰ,Ⅲ蛋白表达,18例正常人皮肤组织作为正常对照组。结果①CTGF在SD患者皮损的表达强于对照组,在系统性硬皮病(SSc)表达高于局限性SD(P均<0.001);②COL-Ⅰ在SD患者皮损的表达强于对照组,但在SSc组、局限性SD组间表达无明显差异(P>0.05);COL-Ⅲ在SD患者皮损的表达与对照组相近(P>0.05);相关分析表明COL-Ⅰ与CTGF的表达呈正相关(r5SC=0.728,rSD=0.71,P均<0.01)。结论COL-Ⅰ与CTGF在SD患者皮肤硬化过程中起一定作用,可能与SD的病理纤维化形成有关。     

肾透明细胞癌患者血清miR-769-5p表达水平变化及其对远期生存的预测价值

目的 检测肾透明细胞癌(ccRCC)患者血清微小核糖核酸-769-5p(miR-769-5p)的表达水平,并分析其对远期生存的预测作用。方法 选取2014年2月至2016年7月南充市中心医院诊治的138例接受手术治疗的ccRCC患者作为研究对象,设为研究组。另选取同期体检的135例健康人设为对照组。两组均取外周血采用聚合酶链反应检测血清miR-769-5p表达并比较;比较研究组中ccRCC不同临床病理特征患者血清miR-769-5p表达水平。研究组均接受随访5年,统计生存率;采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清miR-769-5p表达水平对ccRCC患者5年内病死的预测价值;采用Cox回归分析法分析ccRCC患者5年内病死的影响因素,并应用R3.4.3软件构建Nomogram列线图预测模型,评价其预测效能。结果 研究组血清miR-769-5p表达水平低于对照组(P<0.05);研究组中临床分期>Ⅱ期、FuhrmanⅢ～Ⅳ级、有淋巴结转移患者血清miR-769-5p表达水平均低于临床分期≤Ⅱ期、FuhrmanⅠ～Ⅱ级、无淋巴结转移患者(P<0.05);ccRCC患者...     

人真皮网状层成纤维细胞在瘢痕疙瘩皮损组织中的表达与分布

【摘要】 目的 探讨人真皮乳头层成纤维细胞（Fp）、网状层成纤维细胞（Fr）和肌成纤维细胞（MFB）在瘢痕疙瘩皮损组织中的表达与分布。方法 2019年5 - 12月在武汉大学人民医院皮肤科门诊确诊的15例瘢痕疙瘩患者,男8例,女7例,年龄20 ~ 50岁,取皮损组织,以15例年龄匹配的女性乳房整形术正常皮肤组织为对照。采用双重免疫荧光染色法检测成纤维细胞活化蛋白（FAP）、CD90和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的分布。从3例正常皮肤和3例瘢痕疙瘩组织中分离成纤维细胞原代培养,采用10 ng/ml 转化生长因子β1（TGF-β1）体外处理两组细胞0 ~ 48 h,观察细胞表型的变化,荧光定量RT-PCR和Western印迹检测FAP、CD90和α-SMA mRNA和蛋白表达。两组间差异比较采用t检验。结果 免疫荧光结果显示,正常皮肤组织中,FAP+/CD90-细胞主要分布在真皮浅层,FAP-/CD90+细胞集中在真皮深层,CD90+细胞几乎不表达α-SMA;瘢痕疙瘩组织深层可见大量FAP+和CD90+细胞,大量CD90+细胞同时表达α-SMA。双重免疫荧光染色显示,正常皮肤成纤维细胞几乎不表达α-SMA,瘢痕疙瘩成纤维细胞表达α-SMA;TGF-β1处理24 h时,正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞α-SMA+细胞荧光强度（21.058 ± 0.709、27.112 ± 0.097）均高于未处理组（11.312 ± 0.636、21.306 ± 0.464）,t值为22.430、13.370,P < 0.05。RT-PCR和Western印迹显示,TGF-β1处理48 h时,瘢痕疙瘩成纤维细胞FAP、CD90、α-SMA mRNA相对表达水平（92.610 ± 3.667、1.366 ± 0.105、3.240 ± 0.141）与蛋白表达水平（0.652 ± 0.073、1.046 ± 0.119、0.946 ± 0.117）均高于处理前（均P < 0.05）。结论 瘢痕疙瘩组织真皮深层的CD90+（Fr）细胞异常增生,提示针对真皮深层异常增殖活跃的FAP-/CD90+（Fr）细胞群进行定向干预可能提高瘢痕疙瘩治疗疗效。     

MicroRNA-21对瘢痕疙瘩成纤维细胞mTOR信号通路的调控作用研究

目的:探讨MicroRNA(miR)-21对瘢痕疙瘩成纤维细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控作用及机制。方法:应用miR-21抑制物(inhibitor)及阴性对照(NC)序列转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,反转录(RT)-PCR检测miR-21及10号染色体张力缺失蛋白磷酸酶(PTEN)mRNA表达水平;western blot检测m TOR信号通路关键分子PTEN、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶BPKB(p-Akt,又称Akt)及p-mTOR蛋白的表达。生物信息学方法预测miR-21与PTEN mRNA 3′-UTR结合位点,并用双萤光素酶报告基因验证miR-21对PTEN m RNA的靶向作用;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。结果:miR-21能够靶向调控PTEN m RNA表达,抑制miR-21表达可导致PTEN的m RNA和蛋白表达增加,进而抑制p-Akt及p-mTOR蛋白的表达,从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。结论:miR-21可通过靶基因PTEN调控瘢痕疙瘩成纤维细胞mTOR信号通路关键分子p-Akt和p-mTOR的表达。     

阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响

目的:明确阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响。方法:原代培养系统性硬皮病(SSc)患者皮肤成纤维细胞(FB),使用不同浓度的阿维A(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)mol/L)作用48 h,用羟脯氨酸法测定胶原的质量浓度,RT-PCR法Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结果:阿维A实验组FB胶原合成及I型前胶原mRNA的表达较对照组减少,且均与阿维A呈浓度依赖性关系。结论:阿维A可能通过抑制FBⅠ型前胶原基因的表达减少胶原合成。     

miR-769-5p在皮肤黑素瘤中的表达及其对细胞增殖的影响

目的探究miR-769-5p在皮肤黑素瘤(malignant melanoma,MM)中的表达,以及其对人黑素瘤A375、G361细胞增殖的影响,以期为疾病的临床治疗提供新思路。方法收集本院保存的62例MM患者肿瘤组织以及对应癌旁组织进行研究,实时定量PCR(qRT-PCR)检测组织中miR-769-5p的表达,分析miR-769-5p表达与患者临床病理参数的关系,体外培养A375、G361细胞,转染miR-769-5p inhibitor分为空白对照组、阴性转染组、miR-769-5p转染组,MTT法检测细胞增殖情况;平板细胞克隆实验检测菌落形成情况;流式细胞仪检测细胞凋亡以及周期分布情况;裸鼠模型肿瘤形成实验评估体内肿瘤生长情况。结果 MM组患者miR-769-5p mRNA表达明显高于癌旁组织(P0.05)。miR-769-5p表达与性别、年龄、病灶溃疡情况无关,与淋巴结转移、临床分期相关(P0.05)。与HEM-L细胞系相比,A375、G361细胞系miR-769-5p mRNA表达均升高(P0.05)。与空白对照组、阴性转染组相比,miR-769-5p转染组细胞中miR-769-5p表达、菌落数量、小鼠肿瘤体积均降低,细胞抑制率、G1期DNA含量均升高(P0.05)。结论 miR-769-5p在MM中呈高表达,抑制其表达后能够影响细胞周期的进展,使细胞阻滞于G0/G1期,进而降低细胞增殖进程。     

半边旗5F对系统性硬皮病患者成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的 研究中草药半边旗5F对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的作用,以期找到治疗该病的新的有效药物。方法 用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法和光度检测法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定半边旗5F对成纤维细胞增殖和培养基中的胶原含量以及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响。结果 半边旗5F对患者皮肤成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用,还能显著降低该细胞培养基中可溶性胶原的含量(P<0.01)。上述抑制作用随着药物浓度的增高和作用时间的延长而增强。采用RT-PCR法对Ⅰ、Ⅲ型前胶原的mRNA检测显示随着药物浓度的增高二者的表达量降低。结论 半边旗5F对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的增殖和胶原合成具有显著的抑制作用,为寻找有效治疗该病的药物提供了新的启示。     

系统性硬皮病患者血清中I型原胶原羧基末端前肽的浓度

已有人报告过系统性硬皮病(SSc)患者血清Ⅲ型原胶原氨基末端前肽(P3NP)水平升高,但正常皮肤和硬皮病皮肤中主要胶原成分是Ⅰ型胶原。因此作者研究了SSc患者中血清Ⅰ型原胶原羧基末端前肽(P_1CP)水平,以了解后者与临床特征间的关系。血标本采自61例SSc患