肿瘤睾丸抗原(CTA)在肺癌中的表达

目的：检测多种肿瘤睾丸抗原（CTA）基因在肺癌中的表达。方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法对35例肺癌患者癌组织和癌旁正常肺组织进行MAGE－1、－3，SSX－1、－2、－4、－5和NY－ESO－mRNA表达检测。随机抽取每种CTA基因的3例RT－PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。结果：35例肺癌标本中MAGE－1、－3，SSX－1、－2、－4、－5和XY－ESO－1的表达率分别为34．3％（12／35）、57．1％（20／35）、17．1％（6／35）、20．0％（7／35）、26．7％（9／35）和37．1％（13／35）。正常肺组织中7种CTA基因均无表达。肿瘤组织中7种基因至少有1种表达的几率是26／35（74．3％），两种或两种以上同时表达几率是23／35（65．7％）。测序结果表明RT－PCR产物确为CTA基因。结论：CTA在肺癌主动免疫治疗中是一种合适的、有前景的攻击靶点。同时，多种CTA的联合表达为多效价CTA疫苗在肺癌免疫治疗中的应用提供了理论基础。     

人NIT1基因原核表达载体的构建和鉴定

背景与目的目前已知FHIT基因为抑癌基因，其结构和功能的异常与肺癌的发生、发展有密切关系，而且可能与NIT1基因存在功能上的相关性。但是．FHIT基因与NIT1基因调控肺癌发生发展的分子机制尚未明了。本研究旨在构建人NIT1基因原核表达载体．为进一步研究人肺癌细胞株中NIT1基因和FHIT基因的关系打下基础。方法应用RT—PCR法获得NIT1基因cDNA．定向克隆到融合表达载体pET-32a中．作双酶切和测序鉴定。结果①克隆的cDNA片断包含了人NIT1基因翻译区的全部序列，翻译区序列与GenBank登录的人NIT1 cDNA序列完全一致。②对构建的原核表达载体做双酶切．获得了预期的目的条带。结论通过RT—PCR和定向克隆的方法．成功构建了人NIT1基因的原核表达载体，为研究人NIT1蛋白的表达和进一步研究人肺癌细胞中NIT1基因和抑癌基因FHIT的关系奠定了基础。     

肿瘤睾丸抗原基因研究进展

当前，导致人类死亡的主要原因之一为恶性肿瘤。WHO统计结果显示，每年约有700万人因肿瘤而死亡[1]，而且这一数字呈逐年递增趋势。肿瘤发生是一个长期累积的过程，受多基因控制和多因素调节。     

肿瘤-睾丸基因研究进展

肿瘤-睾丸(CT)基因可产生特异性抗原，诱导机体生成针对肿瘤细胞的特异性体液和(或)T淋巴细胞，在肿瘤免疫治疗中很有前景。现综述CT基因的研究进展、命名规范、数据库、分布情况、抗原表达及识别，并对研究中许多未知问题进行初步展望。     

肿瘤-睾丸抗原LAGE-1基因的原核表达纯化和抗血清制备

目的:构建人肿瘤-睾丸抗原LAGE-1的原核表达质粒,表达、纯化LAGE-1融合蛋白并制备GST-LAGE-1多克隆抗体。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增人肝癌组织LAGE-1基因3′端片段,连入原核表达载体pGEX-4T-1( ),构建原核表达质粒pGEX-LAGE-1并测序。将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,经包涵体透析复性和谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统分离纯化目的蛋白。用纯化的融合蛋白GST-LAGE-1免疫新西兰大白兔,间接ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并采用Western blot检测GST-LAGE-1多克隆抗体特异性。结果:RT-PCR扩增得到LAGE-1基因3′端264bp片段,测序结果与GenBank公布序列一致;成功构建pGEX-LAGE-1原核表达质粒,含有该质粒的大肠埃希菌经IPTG诱导后表达相对分子质量约为36×103的蛋白,经包涵体复性和GST融合蛋白纯化系统纯化,得到重组蛋白GST-LAGE-1,纯度达90%;制备兔抗GST-LAGE-1抗体,纯化的抗体经Western blot证实可与目的蛋白特异性结合。结论:获得了纯化的肿瘤-睾丸抗原LAGE-1重组蛋白及其特异性多克隆抗体,为进一步研究LAGE-1抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础。     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

差异表达基因的克隆筛选及其在肿瘤研究中的应用

高等动物的细胞中大约有 10 0 0 0 0个不同的基因 ,不同类型的细胞所表达的基因不同 ,而且即便是同一类型的细胞 ,在特定时刻同时表达的基因也仅为很少的一部分 ,约占基因总数的 10 %～ 15%。不同生理和病理状态下基因的选择性表达决定了所有的生命过程。比较细胞基因表达的差异可以获得与生命过程相关的信息 ,并且有助于揭示疾病的发生发展机理。差异表达基因的克隆技术正随着分子生物学技术的发展而不断改进 ,也越来越多地应用于肿瘤学的研究。1　差异表达基因克隆技术的研究进展目前差异表达基因克隆的技术较多 ,和肿瘤研究关系比较密切…     

11种癌-睾丸抗原基因在食管癌中表达的检测

目的 研究11种癌-睾丸（CT）抗原基因在食管癌中的表达,明确食管癌辅助免疫治疗疫苗的组成成分,为食管癌肿瘤疫苗的研制提供理论依据。方法 用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测35例食管癌肿瘤组织以及相对应的癌旁正常食管黏膜组织中11种CT抗原基因的表达。结果 所检测的11种CT抗原基因在正常食管黏膜中均无表达。在食管癌组织中表达率最高的为MAGE-3（62．9％）;其次为MAGE-4（31．4％）、LAGE-1（28．6％）、MAGE-1（25．7％）、CT10（20．0％）、NY-ESO-1（20．0％）、CT7（5．7％）和SCP-1（2．9％）,无一例食管癌组织表达SSX-1、SSX-2、SSX-4基因。在35例食管癌组织中,28例（80．0％）表达至少1种CT基因,21例（60．0％）表达2种以上的CT基因。其中,19．0％（4／21）同时表达4种及4种以上CT基因,占总数的11．4％（4／35）。不表达任何CT基因的7例中,Ⅱ期5例,Ⅰ期和Ⅳ期各1例。NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-1、MAGE-3和MAGE-4基因随肿瘤进展,其表达率增加;而SCP-1和CT10的表达主要集中在较早期的Ⅰ期及Ⅱ期食管癌组织。随着肿瘤分期的提高,CT基因的共表达率呈上升趋势,在Ⅲ期时达到最高,为28．6％。结论 （1）包含MAGE-3、MAGE-4和LAGE-1等抗原成分的CT抗原疫苗可应用于食管癌患者的免疫治疗;（2）对不同病理分期的食管癌患者应采取含有不同CT抗原成分的疫苗;（3）SSX-1、SSX-2、SSX-4在食管癌组织中无表达,其具体机制有待进一步研究。     

膀胱移行细胞癌中肿瘤-睾丸抗原基因的表达情况

目的: 研究4种肿瘤-睾丸抗原(CT)基因在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义.方法: 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测49例膀胱移行细胞痈患者癌组织(新鲜标本,Ta-T1期28例,T2-T4期21例;G1 20例,G2 16例,G3 13例)及其中15例患者癌旁组织的cTAGE-1、cTAGE-2、MAGE-A1及NY-ESO-1等4种CT基因mRNA的表达.结果: 49例膀胱移行细胞癌组织中MAGE-A1表达最高,其次为cTAGE-1,cTAGE-2及NY-ESO-1,分别为59%(29/49),55%(27/49),51%(25/49)及47%(23/49).15例癌旁组织表达均阴性.膀胱移行细胞癌组织中肿瘤不同分期、不同分级之间4种CT基因表达的差异均无统计学意义(Pearson x2检验法,P>0.05).结论: CT基因在膀胱移行细胞癌组织中有较高表达,而在癌旁组织无表达,可以进一步研究作为膀胱移行细胞癌特异性免疫治疗靶基因的可行性.     

黑色素肿瘤抗原基因-1、3在直肠癌的表达及其意义

 目的　检测黑色素肿瘤抗原基因-1、3（MAGE-1、MAGE-3）在直肠癌中的表达,探讨其与直肠癌临床病理的关系及其在直肠癌免疫治疗中的应用价值。方法　采用RT-PCR法,对33例直肠癌患者的癌组织及其相应的癌旁组织和手术切缘（乙状结肠端）以及3例直肠息肉标本（无瘤）的MAGE-1、MAGE-3的表达情况进行检测,并对RT-PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。结果　33例直肠癌组织中,MAGE-1基因的表达阳性率为30.30 %（10／33）,MAGE-3基因的表达阳性率为42.42 %（14／33）,MAGE-1、MAGE-3均表达的阳性率为21.21 %（7／33）,至少表达其中一种的阳性率为51.51 %;在癌旁组织和手术切缘组织中,MAGE-1基因的表达阳性率均为12.12 %（4／33）,MAGE-3基因的表达阳性率分别为18.18 %（6／33）、15.15 %（5／33）;3例直肠息肉标本未见MAGE-1、MAGE-3表达。肿瘤组织MAGE-1、MAGE-3基因表达阳性率均显著高于癌旁组织和手术切缘组织（P < 0.05）;而与患者年龄、性别、肿瘤组织学类型、Duke分期及淋巴结转移无关（P > 0.05）。结论　基于MAGE-1、MAGE-3基因在直肠癌中的高表达率,MAGE-1、MAGE-3表     

肺癌相关基因HLCDG1的克隆和表达分析

背景与目的：比较基因组杂交和微卫星多态性位点全基因组扫描结果显示肺癌患者在染色体3p、5q、6q、9p、10q、llp、13q、17p、19p等区域存在高频率的杂合性缺失,提示可能有多个未知的易感基因或抑癌基因与肺癌的发生、发展相关。本研究选用在mRNA差异显示研究中获得的在肺癌组织中表达下调且代表新基因的表达序列标签(expressed sequence tag,EST)LXDDl为进一步研究对象,克隆其全长cDNA。方法：采用Northern杂交验证LXDDl在肺癌中的表达差异。并用MTN(Multiple Tissue Northern Blots^TM)膜检测其在正常组织中的表达及其所代表基因的转录本大小;克隆其全长cDNA,并利用生物信息学对该序列进行初步分析;用差异RT-PCR检测新基因在肺癌组织、配对癌旁非癌组织、肺癌细胞系和其它肿瘤细胞系中的表达。结果：成功地克隆了一个在肺癌中表达下调的新基因。HLCDGl(human lung carcinoma deleted gene 1),GenBank登录号为AF447582,全长cDNA为3．113kb,预测其开放阅读框编码一个含166个氨基酸的跨膜蛋白质。通过电子-聚合酶链反应(electric-polymerase chain reaction,e-PCR)将该基因定位于5q33。结论：HLCDGl基因是一个在肺癌中表达下调的新基因。这提示HLCDGl可能与肺癌的发生、发展相关。     

小鼠Doc-1R基因的克隆及其表达

背景与目的：Doc-1R基因是1999年克隆的一种新的基因,已有的研究表明Doc-1R基因可能是一种潜在的抑癌基因。为了进一步研究此基因的功能,我们首先克隆了小鼠的Doc-1R基因,并对此基因的表达进行了初步的研究。方法;根据小鼠的Doc-1R基因cDNA序列,设计合成了基因组特异引物,应用巢式PCR对小鼠基因组步移文库进行扩增。对测序结果进行序列分析及剪接位点的鉴定。另外应用RT－PCR的方法研究了Doc-1R基因在小鼠肝,脾,胰,肾,肺,肠,心,脑,骨,肌肉,膀胱,卵巢,睾丸等13种组织的表达。结果：经二次基因组步移获得了小鼠Doc-1R基因组全长序列。基因组全长2787bp,含4个外显子和3个内含子,外显子与内含子接头符合GT／AG法则。RT－PCR结果表明,Doc-1R基因在小鼠13种组织和器官中均有表达。结论：成功克隆了小鼠Doc-1R基因,为进一步研究此基因的功能奠定了基础。RT－PCR表达结果提示此基因可能是对维持组织器官的功能具有重要的作用的管家基因。     

前列腺特异膜抗原基因的克隆和真核表达

目的克隆前列腺特异膜抗原(PSMA)基因的编码区序列,并进行真核表达.方法用RT-PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMA cDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0.用脂质体转染法,把pcDNA3.0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达.结果序列测定结果表明,两条引物之间的片断长度为2279 bp,与预期长度一致.将克隆的编码区序列与Genebank的PSMA序列进行Blast对比分析,同源性为99.7%;间接免疫荧光法显示表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的分子量为100 000.结论利用RT-PCR技术成功扩增了PSMA编码区序列,经序列分析显示扩增片断的序列正确.构建了PSMA真核表达载体,建立了PSMA稳定表达的细胞株.经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性.所获得的PSMA真核表达系统为进一步研究PSMA基因修饰的DCs疫苗对前列腺癌的治疗提供了物质基础.     

人B细胞成熟抗原的克隆、表达及纯化

目的构建人B细胞成熟抗原（BCMA）原核表达质粒,表达BCMA融合蛋白。方法通过RT—PCR方法从人B淋巴瘤Raji总RNA中扩增BCMA的全长cDNA,并插入原核表达载体PGEX4T-1的BamHI和NotⅠ酶切位点,构建原核表达载体PGEX4T-1-BCMA,利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。在大肠杆菌中表达BCMA融合蛋白,并经谷胱甘肽-S-转移酶（GST）亲和柱纯化。纯化后的产物经过SDS—PAGE、Westernblot检测目的蛋白的表达情况。结果Bam HI／Notl双酶切证明重组质粒中含有目的大小的BCMA基因片段,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的PGEX4T-1-BCMA质粒转染感受态DH5ct,IPTG诱导表达后超声裂解菌体,上清经GST亲和纯化,经SDS—PAGE、抗GST和BCMA抗体Westernblot分析,证实融合表达蛋白为GST—BCMA融合蛋白。结论成功构建了BCMA原核表达载体,重组质粒能够在原核表达系统中可溶性表达GST—BCMA融合蛋白,为进一步研究BCMA的生物学功能奠定了基础。     

NY-ESO-1基因在人食管癌中的表达及其基因克隆

背景与目的：NY-ESO-1是从食管癌cDNA文库中筛选到的肿瘤抗原,但是该基因在食管癌组织中的表达情况尚未见报道。本文研究NY-ESO-1基因在食管癌中的表达率,以便于确定食管癌患者是否可以使用以NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法：采用RT-PCR方法检测了NY-ESO-1基因在30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达;采用分子克隆的方法从食管癌组织中克隆了NY-ESO-1cDNA。结果：NY-ESO-1基因在食管癌组织中的表达率为50%（15/30）,在30例相应癌旁正常组织中未见表达;克隆的NY-ESO-1cDNA序列与GenBank报道一致。结论：NY-ESO-1基因在食管癌中高频率表达,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-1类分子限制性CTL识别。     

抗人大肠癌单链抗体基因的克隆与表达

背景与目的：单链抗体相对于完整抗体具有免疫源性低、对肿瘤组织穿透力强的特点,日益成为肿瘤诊断和治疗的良好导向载体。本研究的目的是将抗人大肠癌单克隆抗体ND－1的重链可变区VH和轻链可变区VL基因借助一短肽序列（Gly4Ser)3进行重组,构建单链抗体基因ND－1scFv,并使其在大肠杆菌中表达。方法：采用RT－PCR技术从能够分泌ND－1单抗的鼠杂交瘤细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建ND－lscFv基因,经过常规转化和筛选,将其克隆至PET－28a( )表达载体,由IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达为ND－lscFv与His-Tag的融合蛋白。表达产物用Ni-NTA resin亲和层析方法纯化,并采用ELISA方法检测其免疫活性。结果：序列分析表明,ND－lscFv基因全长732bp,VH354bp位于上游;VL330bp位于下游。SDS－PAGE显示,重组蛋白相对分子量30kDa,与预期结果一致。scFv表达产物以不溶性包涵体形式存在,经亲和层析纯化后蛋白纯度达94％。ELISA结果显示scFv保留了与亲本抗体ND－1相似的免疫活性。结论：成功地构建了抗人大肠癌单链抗体ND－lscFv,并在大肠杆菌中获得了较高水平的功能性表达。     

hTERT1658-2070在大肠杆菌中的克隆及表达

目的　用基因工程的方法在大肠杆菌中表达人端粒酶逆转录酶 (hTERT)部分活性片段。方法　PCR扩增hTERTcDNA16 5 8 2 0 70片段 ,将其克隆至表达载体pGEX 5x 3上 ,转化大肠杆菌TG1,获得hTERT蛋白片段表达。并经DNA测序及Westernblot验证表达蛋白。结果　表达出的蛋白为GST hTERT融合蛋白 ,分子量为 38.8kD。经DNA测序及Westernblot证实表达蛋白即为所需蛋白。结论　在大肠杆菌中克隆并表达了hTERT部分片段。     

人成骨特异性转录因子cDNA胞外区片段的克隆和序列分析

目的:克隆人成骨特异性转录因子(cbfa1)cDNA胞外区片段并进行序列分析。方法:提取人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA,逆转录合成cDNA,用PCR法扩增cbfa1基因片段。将获得的预期大小的PCR产物插入pUC19克隆载体中,转化TOP10感受态细胞,蓝白筛选白色克隆,进行体外扩增,提取质粒进行酶切鉴定后进行序列分析。结果:从人骨肉瘤细胞系细胞提取的总RNA中成功获得人cbfa1基因片段和重组质粒pUC19-cbfa1,DNA序列分析证实其序列和文献报道一致。结论:采用基因克隆的方法得到人cbfa1基因片段和重组质粒pUC19-cbfa1,为进一步进行其结构和功能研究打下基础。     

荧光定量RT-PCR检测mdr-1基因表达

建立荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测肿瘤细胞ｍｄｒ－１基因表达的方法,了解肺癌组织中ｍｄｒ的表达水平。方法：建立荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法,在ＰＥ７７００型检测仪上定量检测Ｋ５６２／ＡＤＭ耐药株和Ｋ５６２不耐药株细胞ｍｄｒ－１有达水平,同时检测４５例初治肺部肿瘤病人组织标本。