阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

外源基因转染血管内皮细胞条件优化

目的探讨阳离子脂质体及电穿孔法介导外源基因转染血管内皮细胞的转染效率并进行条件优化。方法采用绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体为载体以及电穿孔方法,转染人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）。培养48 h后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在HUVEC内的表达及转染效率。结果 Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体介导组有少量细胞可见弱荧光信号,而电穿孔法转染组可见较强荧光信号,其中以电击条件为电场强度1100 V、脉冲时间20 ms、电击2次的转染效率最好。结论电穿孔法介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,可作为血管内皮细胞的外源基因转染的方法。     

脂质体介导外源基因体外转染精子的研究

为探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的可行性。方法我们从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子，与阳离子脂质体包裹的ＤＮＡ混合孵育之后将其注入超排卵小鼠的阴道内，４８ｈ后收集Ⅱ细胞胚胎细胞。结果（１）精子可转染上外源ＤＮＡ，转染率达５３％；（２）转染有外源ＤＮＡ的精子可使Ⅱ细胞期胚胎携带上外源基因，携带率为１１．５％。结论小鼠输精管及附睾管内的精子可被脂质体包裹的外源ＤＮＡ转染并可作为载体     

人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3细胞系中的瞬时表达研究

目的：研究人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3中的瞬时表达情况。方法：采用脂质体转染法将携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）启动子－人胰岛素原基因的质粒转染到体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，转染后48h，用放射免疫分析方法（RIA）分别测定NIH3T3细胞内外的胰岛素水平。结果：NIH3T3细胞外的胰岛素水平于转染前后无显性变化（P＞0．05），而细胞内的胰岛素水平则于转染后明显升高（P＜0．05）。结论：转染后48h的人胰岛素原基因在NIH3T3细胞内有较高的胰岛素表达水平，使I型糖尿病的基因治疗成为可能。     

Lipofectamine^TM 2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠耳蜗成纤维细胞的实验研究

目的检测真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。方法培养新生小鼠耳蜗成纤维细胞，用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导的方法，将含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP．NT3对其进行转染，转染后24h，通过Confocal显微镜观察新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。结果通过阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导，真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3能有效转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的有效转染为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

脂质体介导CDKN2基因抑制肺癌细胞的实验研究

转染野生型CDKN2cDNA—SA脂质体复合物到NSCLC细胞系A549和SCLC细胞系SH77，用MTT方法测量细胞增殖活力，观察CDKN2基因是否能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。结果：SA阳离子脂质体介导CDKN2基因转染A549细胞后第1、3、5、8日OD值显著小于对照组（P＜0．01），而SH77细胞转染CDKN2基因后1、3、5、8日OD值与对照组比较无差别（P＞0．05）。在体外转染CDKN2基因能显著抑制NSCLC细胞增殖，对SCLC细胞无作用。结果表明肿瘤抑制基因CDKN2可望成为NSCLC基因替代治疗的候选基因。     

阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率的比较研究

目的 提高阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率。方法 采用表达Ｅ．ｃｏｌｉβ－半乳糖苷酶的ｐＣＭＶβ报告基因质粒及组化染色评价阳离子脂质体的转染效率。优化脂质体介导肺癌细胞基因转染效率的条件包括：脂质体：ＤＮＡ电荷比率，ＤＮＡ转染剂量，阳离子脂质体的类型。结果 当阳离子脂质体：ＤＮＡ电荷比率（＋／－）为３：１时，ｐＣＭＶβ的剂量为４ｕｇ／孔（２４孔板）时，阳离子脂质体ＤＯＳＰＥＲ介导肺癌细胞株Ｓ     

包裹E1A基因的纳米粒子制备及转染人肺腺癌细胞A549实验研究

目的制备包裹E1A基因（腺病毒早期表达基因）的纳米粒子,并观察其介导E1A基因转染人肺腺癌细胞A549的可行性和效率。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人肺腺癌细胞A549,并以阳离子脂质体为对照,用PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A基因DNA整合和mRNA表达。结果制备的纳米粒子粒径为150～280nm,包埋率为0.78%,体外释放约为22d;在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数较脂质体组多（P〈0.05）;PCR、RT-PCR结果表明纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因整合和mRNA表达。结论成功制备了纳米粒子,纳米粒子可携带外源基因进行基因转染。     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

转染wt-53基因对SHG44细胞恶性表型的影

目的：转染ｗｔ－ｐ５３基因对ＳＨＧ４４细胞恶性表型的影响。方法脂质体介导法,将ｗｔ－ｐ５３基因转导入ＳＨＧ４４人胶质瘤细胞,斑点霜交证实转染成功;观察阳性转染细胞在体外常规培养中生长速率,细胞培增时间;平板集落形成率,结果转染ｗｔ－ｐ５３的细胞生长速度明显减慢,倍增时间延长（Ｐ〈０．０１）;细胞集落形成数明显减少（Ｐ〈０．０１）,结论外源性野生型Ｐ５３基因对ＳＨＧ４４细胞的恶性表型有抑制作用。     

脂质体介导p53基因对腩癌细胞生长的抑制作用

目的观察外源野生型p53基因在肝癌基因治疗方面的可行性。方法：将载有人野生型p53-cDNA的真核表达质粒pcDNA3-p53，用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG3B细胞，用流式细胞仪检测pcDNA3-p53对HepG3B细胞生长的影响。结果：通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现，HepG3B细胞生长受到明显的抑制。结论：脂质体介导的p53基因可在HepG3B细胞中表达，且明显抑制该细胞的生长。     

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV－TK／ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV－TK基因的真核表达载体pCR3-5K,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ905中，筛选出阳性克隆，给予不同浓度的ACV，观察不同时间对细胞的杀伤情况，并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高（P＜0．01），ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3-TK转移，进行胶质瘤HSV－TK／GCV基因治疗的研究，为胶质瘤的治疗提供一种新方法。     

多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的 制备多聚胺阳离子脂质体（Polyamine Cationic liposome，PCL），转染哺乳动物细胞，评估其转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法 多聚胺阳离子脂质TC—Chol与中性磷脂DOPE以一定比例，制备PCL，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞毒性，筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果 多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4：1时可达到高效低毒，转染后48h转染效率最高。结论 由TC—Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率，在一定条件下可达到相对高效低毒，为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。     

野生型p53基因抑制胆囊癌细胞裸鼠体内生长的实验研究

目的：研究转染野生型p53（wtp53）基因对胆囊癌细胞裸鼠体内生长的影响。方法：在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV—p53，导入GBC—SD细胞中。用G418筛选，建立转染克隆细胞系。以PCR、RT—PCR和蛋白质印迹法证实外源p53基因的整合与表达。用裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响。结果：野生型p53基因成功的导入胆囊癌细胞系，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。表达外源wtp53的GBC—SD—wtp53细胞，裸鼠体内致瘤性受到显著抑制。结论：野生型p53基因可有效抑制胆囊癌细胞在裸鼠体内的生长。     

脂质体介导TGF-β1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究

为证实TGF-β1质粒DNA能否由脂质体携带进入家兔角膜上皮细胞，用多聚阳离子脂质体携带重组的人TGF-β1质粒转染体外培养的家兔角膜上皮细胞，在转染12h后，表达2d时，用免疫组化方法（SABC）检测TGF-β1质粒DNA的表达情况，结果显示：外源TGF-β1质粒DNA在家兔角膜上皮细胞可以获得表达，基因转染率为23.37%。提示：脂质体作为角膜上皮细胞基因类药物介入的基础研究和应用研究的介导体具有广阔的应用前景。     

胰腺癌细胞 BXPC-3转染条件的优化

目的：探讨实验室常用的人胰腺癌细胞株BXPC-3的有效转染方法及最佳转染参数。方法通过脂质体法和电穿孔法将表达绿色荧光蛋白的质粒（ pGFP-N3）导入人胰腺癌细胞株BXPC-3中,24 h后观察并比较细胞的存活率及瞬转效率,确定最佳转染参数。结果常规脂质体法BXPC-3细胞瞬转阳性率为1．36％,细胞存活率为87．45％;而电穿孔法在电压120 V电击时程70μs条件下,BXPC-3细胞瞬转阳性率为54．78％,细胞存活率为64．01％,2种转染方法的瞬转阳性率差异有统计学意义（P＜0．05）。结论转染BXPC-3细胞,电穿孔法可取得比常规脂质体法更高的转染效率。通过条件的优化,电穿孔法可以用于某些脂质体法难以有效转染的细胞株。     

阳离子脂质体介导IL-2基因治疗SCCⅦ移植瘤的初步研究

目的：探讨多价阳离子脂质体介导的白细胞介素2（IL－2）基因治疗头颈鳞癌的最佳比例和免疫机理。方法：利用SCCⅦ细胞株在C3H／HeJ小鼠口底建立头颈鳞癌荷瘤动物模型。用不同比例的脂质体与DNA混合物及裸DNA进行体内外转染，用ELISA方法检测其转染后IL－2基因的蛋白表达水平，用乳酸脱氢酶（LDH）法检测荷瘤小鼠脾脏的自然杀伤细胞（NK）和细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性。结果：最佳IL－2分泌水平在体外细胞株与体内瘤内转染时的脂质混合物比较不一致。与裸DNA和空载体相比，合适比例的脂质混合物转染可增强脾脏NK和CTL的杀伤活性。结论：脂质复合物在瘤内直接基因转染的良好效能取决于其合适的构成比例，体外细胞转染的最佳脂质混和物比例不能作为体内转染的参考；与裸DNA转染相比，多价阳离子脂质体适于作为头颈肿瘤进行直接瘤内基因治疗的非病毒载体。     

阳离子脂质体介导BEL-7402、QBC、BXPC-3瞬时转染率比较

目的: 探讨阳离子脂质体瞬时转染消化道肿瘤细胞的差异.方法: 采用pEGFP-N1质粒为报告基因,流式细胞仪技术(FACS)来分析阳离子脂质体介导3种细胞的瞬时转染率,设立裸质粒的转染为空白对照组,将转染的细胞在倒置荧光显微镜下观察并摄像;采用MTT法检测3种细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线;分析细胞倍增时间和阳离子脂质体介导的转染之间的联系.结果: BEL-7402,QBC,BXPC3 3系细胞阳离子脂质体介导的瞬时转染率分别为26.99%、2.25%和30.36%,BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P＜0.05);3个细胞系裸质粒的转染率分别为0.22%、0.29%和0.18%,3者之间差异无显著性(P＞0.05);BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48 h、64.94 h和26.29 h,QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P＜0.05).结论: 阳离子脂质体对高度恶性的消化道肿瘤细胞有更好的转染效率.     

脂质体介导E1A—TK基因转染人肺腺癌细胞A549体外研究

目的用脂质体转染真核表达质粒PcDNA3E1A-TK入人肺腺癌细胞A549,观察丙氧鸟苷(GCV)、X射线及二者联合对转染细胞的体外杀伤作用。方法用阳离子脂质体介导真核表达质粒PcDNA3E1A-TK转染人肺腺癌细胞A549,PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A-TK基因DNA整合、mRNA表达。MTT法测不同浓度GCV、不同剂量X射线及一定剂量X线照射后再给一定量GCV对转染细胞的生长抑制率。结果PCR、RT-PCR结果表明转染细胞有E1A-TK基因整合、mRNA表达。根据IC50,转染细胞对GCV、X射线的敏感性分别比亲代细胞提高111.3倍和2.9倍,在作用相同时间后,GCV+X线照射治疗对转染细胞的生长抑制作用比单纯GCV或X线治疗明显增强(P<0.01)。结论脂质体介导外源基因E1A-TK成功转入人肺腺癌A549细胞并获得表达;转染细胞获得了对GCV和X线的敏感性,GCV和X线对转染细胞有协同杀伤作用。     

重组人癌胚抗原cDNA基因转染小鼠肝癌细胞体外实验模型的建立

目的：建立表达人癌胚抗原（CEA）的小鼠肝癌细胞模型。方法：用脂质体介导转染法将含人CEA-cDNA的逆转录病毒重组质粒pLXSN-CEA导入小鼠肝癌细胞,利用含G418的选择培养基筛选及放免法测定癌细胞CEA表达量进行鉴定。结果：成功建立表达人CEA的小鼠肝癌细胞模型。结论：利用基因转染技术能将人癌胚抗原cDNA基因导入小鼠肝癌细胞中,并能在选择培养基中生长,且表达人的癌胚抗原。