基孔肯亚病毒中和单克隆抗体的筛选与鉴定

目的 :建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体细胞株 ,筛选具有中和活性的特异性单克隆抗体。方法 :利用细胞融合技术建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,用细胞培养中和试验初筛具有中和活性的单克隆抗体 ,用固定单克隆抗体稀释病毒方法进行乳鼠中和试验 ,进一步验证单克隆抗体的保护作用 ;用中和交叉试验鉴定中和单克隆抗体反应的特异性。结果 :用免疫荧光法检测建立了 9株能稳定分泌抗基孔肯亚病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,初筛出 4株具有中和活性的单克隆抗体 ,其中 1F1单克隆抗体稀释 2 0 0倍时可保护 50 %细胞不产生细胞病变 ;乳鼠中和试验1F1单克隆抗体中和指数为 10 3.3,对试验小鼠有较强的保护作用。中和交叉试验表明 ,1F1单克隆抗体只中和基孔肯亚病毒 ,与其他病毒无交叉反应 ,特异性较高。结论 :制备了 9株抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,筛选得到了 1F1具有较强中和活性的特异性单克隆抗体 ,可望为基孔肯亚病毒病的诊断、紧急预防与治疗提供良好试剂     

人源抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中的表达

目的 :构建人源抗_HAV全分子抗体的CHO细胞表达体系。方法 :将抗_HAV抗体轻链全分子 (信号肽与VL_CL)基因克隆至表达载体pCI_neo中 ;将重链信号肽、重链 (γ)VH_CH1 和Fc基因进行重组形成重链全分子基因 ,再将其克隆到真核表达载体pCdhfr1中。将轻、重链全分子表达载体共转染CHO dhfr_细胞 ,用G_4 18和甲氨蝶呤(MTX)筛选细胞克隆 ,ELISA法检测细胞培养上清中的抗_HAV活性 ,增加MTX浓度进行加压筛选。用蛋白L亲和层析柱从培养上清中纯化重组抗体。结果 :构建的真核表达载体可实现抗_HAV全分子抗体在CHO细胞中的分泌表达 ,纯化的重组抗体在还原SDS_PAGE中表现为相对分子质量约 2 5 0 0 0、5 0 0 0 0两条带 ;Western印迹表明 ,重组抗体全分子和重链分子均可和羊抗人Fc抗体发生特异性免疫反应。结论 :抗_HAV全分子抗体在CHO细胞中表达 ,为基因工程生产具有完整功能的全分子抗体奠定了基础     

基于IRES序列的抗体定点整合载体构建和表达

目的：比较不同全功能抗体基因之间的表达量。方法：构建了基于FLP-IN／FRT-pcDNA5和ECMV-IRES的抗体双表达载体，把抗HBsAg抗体轻链、重链基因克隆到该表达栽体上进行表达。结果与结论：在CHO细胞中瞬时表达时没有检测到抗体表达，但在用抗性筛选到的克隆中有稳定的表达，各克隆之间表达量差异小于40％，为各种不同基因工程抗体表达量的筛选和优化提供了方法。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体—突变体人TNFα融合基因在CHO（dhfr^—）细胞中的表达

目的：提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子（hScFv25-hTNFα)的稳定性和杀伤活性,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体－突变体人TNFα融合基因（ds-ScFv-hTNFα）,并在CHO细胞中表达。方法：常规构建ds-ScFv-hTNFα融合基因,并克隆入真核表达载体pCI(dhfrl）,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO－dhfr^-）,甲氨蝶呤（MTX）高压筛选高表达细胞株,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果：目的基因在CHO（dhfr^－）中获得了表达,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性,且稳定性得到大幅度提高,达到4℃放置4个月活性无明显下降。结论：抗肝癌人源化ds-ScFv-hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

用IRES及dhfr构建哺乳动物细胞双表达载体

目的 :构建同时表达抗体的重链和轻链的哺乳动物细胞双表达载体。方法 :将微小RNA病毒内部核糖体进入位点 (IRES) ,亚克隆到质粒载体 pCdhfr1多克隆位点 ,构建了哺乳动物细胞双表达载体 pCdhfr5。 结果 :pCdhfr5具有两处多克隆位点 ,由IRES相连。能同时表达两个外源基因。把绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因分别亚克隆到 pCdhfr5的上下游多克隆位点MCS1和MCS2构建了表达质粒 pFN ,经脂质体法转染CHO细胞 ,筛选到同时表达新霉素磷酸转移酶和绿色荧光蛋白的表达株。结论 :双表达载体的构建成功为进一步研究表达抗体全分子的CHO细胞株奠定了基础     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体-突变体人论著TNFα融合基因在CHO(dhf)细胞中的表达

目的 :提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子 (hScFv2 5 hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体 突变体人TNFα融合基因 (ds ScFv hTNFα) ,并在CHO细胞中表达。方法 :常规构建ds ScFv hTNFα融合基因 ,并克隆入真核表达载体pCI(dhfr1) ,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株 (CHO dhfr ) ,甲氨蝶呤 (MTX)高压筛选高表达细胞株 ,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果 :目的基因在CHO(dhfr )中获得了表达 ,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性 ,且稳定性得到大幅度提高 ,达到 4℃放置 4个月活性无明显下降。结论 :抗肝癌人源化ds ScFv hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达 ,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

新型抗EGFR人源化抗体基因的构建和表达

目的：构建并表达进一步人源化且效果显著增强的抗EGFR抗体。方法：通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗EGFR抗体的轻链和重链可变区序列,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双表达载体。瞬时转染293T细胞,用rProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中纯化抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定。采用Biacore3000技术检测抗体结合抗原的能力;细胞侵袭实验初步检测抗体的功能。结果：成功构建3种不同突变体表达载体C2、C3和C5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×103和50×103两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合。Biacore3000实验结果表明,C3抗体与抗原具有良好亲和活性（亲和力为6.13×10-10mol/L）;细胞侵袭实验结果表明,C2和C3抗体对肿瘤细胞生长迁移均具有一定的抑制作用。结论：成功构建、表达了3种抗EGFR人源化抗体C2、C3和C5,其中C3具有良好的抗原结合能力和抑制肿瘤细胞生长迁移能力。     

抗人CD40功能性嵌合抗体的制备及其高效表达

目的构建抗CD40嵌合抗体的真核表达载体,实现在真核细胞中的高效表达。方法采用RT-PCR法,从分泌鼠源抗人CD40抗体的杂交瘤细胞系5C11中钓取其轻、重链基因,进行序列测定。将5C11轻重链可变区基因分别克隆入表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体（c5C11）的轻链真核表达载体5C11L-pCMV及重链真核表达载体5C11H-pCMV。将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,利用夹心ELISA法测定上清中c5C11的浓度,通过流式细胞术检测c5C11与膜抗原的特异性结合。通过生物信息学相关方法对c5C11的氨基酸序列进行合理改造,尝试在保持生物学功能的基础上提高c5C11的表达量。结果成功钓取鼠源单抗5C11的轻重链可变区基因并构建了真核表达载体,实现了c5C11的分泌表达;嵌合抗体较好地保留了鼠源母本抗体的抗原识别能力。利用计算机辅助设计,一定程度上提高了c5C11的表达量。结论为后续研究嵌合抗CD40抗体对B淋巴瘤等肿瘤的治疗提供了一定的依据。     

新型抗uPAR人源化抗体的表达和活性检测

目的制备抗尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）人源化抗体并初步检测它们与抗原的亲和能力。方法通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗uPAR抗体的轻链和重链可变区基因序列,通过重叠PCR方法,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双向表达载体。瞬时转染293T细胞,收取细胞上清,rProtein A亲和层析法纯化目的抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,采用Biacore3000技术检测抗体与抗原的结合能力。结果成功构建5种表达载体S1~S5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×103和55×103两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合。Biacore3000实验结果表明,S2、S4和S5抗体与抗原具有良好的亲和活性,且亲和活性分别为1.74×10-8,1.49×10-8和1.05×10-8mol/L。结论成功构建并表达了5种抗uPAR人源化抗体,其中S2、S4和S5具有良好的抗原结合能力。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

Single amino acid substitution in the Fc region of chimeric TNT-3 antibody accelerates clearance and improves immunoscintigraphy of solid tumors.

Recent studies in antibody catabolism have identified residues at the CH2-CH3 interface of the IgG heavy chain critical for serum persistence of immunoglobulins. Amino acid substitutions in the Fc region of murine IgG1 were shown to drastically accelerate antibody clearance in mice. Our laboratory has previously described a human-mouse chimeric TNT-3 (chTNT-3) monoclonal antibody directed against a universal nuclear antigen that has potential for the radioimmunotherapy of many solid tumors. In the current study, we engineered a chTNT-3 mutant containing a single amino acid substitution, to determine whether a more rapid clearance profile would make the antibody suitable for diagnostic imaging. METHODS: A single amino acid substitution in the CH2 domain of the human gamma1 constant region was made by polymerase chain reaction mutagenesis. High-level expression was achieved using the Glutamine Synthetase Gene Amplification System, and the chTNT-3 mutant was purified by protein A affinity and ion-exchange chromatography. A radioimmunoassay was performed to examine antigen binding, and in vivo studies were undertaken to evaluate clearance and tumor targeting in human tumor xenograft models. RESULTS: The chTNT-3 mutant retained the high affinity of chTNT-3, with a binding constant of 1.5 x 10(-9) mol/L. The mutant was eliminated rapidly from BALB/c mice, with a beta-phase half-life of 33.8 h, compared to 134.2 h for chTNT-3. Moreover, biodistribution studies in human colon tumor-bearing nude mice reflected this accelerated clearance. Tumor levels of the mutant were, respectively, 65%, 39%, and 36% of the tumor levels achieved with the parental chTNT-3 6, 12, and 24 h postinjection. The rapid clearance of the chTNT-3 mutant from the blood resulted in higher tumor-to-normal organ ratios for many normal tissues. Imaging of tumor-bearing mice with 99mTc-labeled chTNT-3 mutant demonstrated early visualization of tumors in 3 different solid tumor xenograft models. CONCLUSION: The accelerated clearance produced by a single amino acid substitution in the Fc region of chTNT-3 leads to improved imaging in tumor-bearing mice. These studies suggest that a rapidly clearing antibody generated by this approach may be useful for the immunoscintigraphy of human tumors.     

抗人红细胞单链抗体基因的克隆与表达

目的：获得抗人红细胞单链抗体（single-chain antibody,ScFv)基因,并在大肠杆菌中表达具有能与人红细胞特异性结合的ScFv。方法：以从分泌抗人红细胞单克隆抗体细胞株中提取细胞的总RNA为模板,利用扩增鼠源性抗体可变区基因的通用引物,通用RT－PCR分别获得轻链（VL）、重链（VH）可变区基因,并通过15个氨基酸的加接肽（Gly4Ser)3按VL－接头－VH的顺序连接起来,组建成ScFv基因。结果：核苷酸序列分析证明,获得的单链抗体基因VH基因属于小鼠抗体重链可变区基因家族的V（A）组,VL基因属于小鼠抗体k轻链可变区基因家族的IV组。与PGEX－5X－3表达载体上的GST融合蛋白表达后,在相对分子质量54000有一明显的空载体对照没有的蛋白带（ScFv28000,GST26000）。间接免疫荧光证明该表达产物能与人红细胞特异性结合。结论：获得抗人红细胞ScFv基因和具有抗体活性的抗人红细胞ScFv,为建立患者自身红细胞凝集试验奠定了基础。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

Effects of genetic engineering on the pharmacokinetics of antibodies.

Monoclonal antibodies (MAbs) may be considered 'magic bullets' due to their ability to recognize and eradicate malignant cells. MAbs, however, have practical limitations for their rapid application in the clinics. The structure of antibody molecules can be engineered to modify functional domains such as antigen-binding sites and/or effector functions. Advances in genetic engineering have provided rapid progress in the development of new immunoglobulin constructs of MAbs with defined research and therapeutic application. Recombinant antibody constructs are being engineered, such as human-mouse chimeric, domain-dispositioned, domain-deleted, humanized and single-chain Fv fragments. Genetically-engineered antibodies differ in size and rate of catabolism. Pharmacokinetic studies show that the intact IgG (150 kD), enzymatically derived fragments Fab' (50 kD) and single chain Fv (28 kD) have different clearance rates. These antibody forms clear 50% from the blood pool in 2.1 days, 30 minutes and 10 minutes, respectively. Genetically-engineered antibodies make a new class of immunotherapeutic tracers for cancer treatment.     

将抗体库所获抗HBs Fab转换为全长人IgG

目的：将大肠杆菌表达的抗乙肝表面抗原（ＨＢｓ）人Ｆａｂ转换为真核表达的全长人ＩｇＧ１。方法：用重叠ＰＣＲ法将人工合成的人Ｖｋ前导序列拼接到抗ＨＢｓ的ＶＨ和Ｖｋ上,构建人ＩｇＧ１真核表达载体,转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测抗ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结果：用轻链和重链同时表达的单一莲体在ＣＨＯ细胞中获得了抗ＨＢｓ人ＩｇＧ的表达。结论：通过噬菌体抗体库所获Ｆａｂ段可通过拼接人Ｖｌ     

抗体可变区稳定性评价及其初步应用

目的：通过研究抗体轻、重链间的结合能与其构象特征、理化性质间的内在关系,建立相应的数学模型,合理评价抗体分子的热稳定性,为抗体分子的设计、合理改造及亲和力成熟奠定基础。方法采用生物信息学和计算生物学相关方法对已有晶体结构的抗体结构信息进行分析,通过距离几何学、计算机图形学技术对抗体可变区的构象特征进行研究;基于分子间氢键形成理论、反应自由能理论,从热力学、动力学对抗体分子轻、重链可变区相互作用的动态结构及能量特征进行探讨;借助统计学原理、非线性拟合、回归分析等分析手段对抗体轻、重链作用能与其构象特征、理化性质建立相关性分析。结果通过分子模拟与统计学分析,抗体的轻、重链可变区结合能与其轻、重链间的氢键形成数目、范德华作用均存在线性相关性;与抗体理化性质存在基于多项式的非线性相关性。基于关键位置氨基酸的使用频率以及建立的分析模型,针对无法获得稳定工程细胞株的抗蓖麻毒素人源化功能抗体进行合理的评价及优化,借助理论指导,获得抗蓖麻毒素人源化抗体稳定的工程细胞株。结论抗体可变区的自身结构（构象、理化性质）对其稳定性有很大影响,可以通过抗体结构优化来提高抗体的稳定性。     

抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体在大肠杆菌中的表达

 目的 制备可溶性抗甲状腺刺激性免疫球蛋白(TSI)单链抗体。方法 构建的抗TSI单链抗体可溶性表达载体,转化E.coli XL 1-blue进行表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和ELISA检测,同时对表达条件作了初步探索。结果 抗TSI单链抗体可溶性表达于细菌培养上清和周质间隙,大小约30 KDa,具有抗TSI活性。温度、诱导物浓度及蔗糖对抗TSI单链抗体的表达产量有一定影响。结论 抗TSI单链抗体可溶性表达成功,为制备基因工程抗体奠定了基础。     

基孔肯雅病毒结构蛋白的免疫印迹分析

本文应用免疫印迹法(Western blot)初步分析了基孔肯雅病毒结构蛋白组分及其抗原性.结果指出,基孔肯雅病毒含有3种结构蛋白(E_1,E_2和C),另一种病毒特异性蛋白E_3可能与完整毒粒无结构上的联系.病毒的初提样品与精提样品的免疫印迹试验结果基本一致,因而病毒的提纯程序可简化.基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒在结构多肽水平上呈现相互交叉免疫反应.