双向电泳-质谱法分析人CD4+CD25+T细胞与CD4+CD25-T细胞蛋白质组差异

目的 用双向凝胶电泳-质谱法(2．DE／MS)分析人CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达的蛋白质组，建立二者之问的差异表达谱。方法 提取人脾脏源CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞总蛋白质，双向电泳分离蛋白，比较两种细胞的蛋白质组表达差异，对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间问质谱(Matrix-assisted laser des-orpfion／ionization time of flying maass spectrometry，MAIDI-TOF-MS)进行鉴定。结果 胶图差异分析发现25个表达水平存在明显差异的蛋白质点，其中17个点在CD4^ CD25^-T细胞上调，8个点在CD4^ CD25^ T细胞上调。质谱初步鉴定出15个差异蛋白质点。结论 CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达蛋白质组存在差异，这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究调节性T细胞功能相关蛋白质。     

支气管哮喘病人CD8+T细胞CD25,CD30表达状况

目的：通过观察哮喘病人外周血CD8^ T细胞CD25，CD30表达水平，了解哮喘病人CD8^ T细胞功能状态。方法：将所分离出的CD8^ T细胞分别用PPD，PHA刺激，最后用流式细胞仪检测细胞表面CD25，CD30表达水平。结果：PHA刺激组CD8^ T细胞CD25表达水平高于健康对照(P＜0．05)，而CD60表达则无差异；PPD刺激组CD8^ T细胞CD25，CD30表达与健康对照组相比无显著差异；哮喘病人自然状态下(即未受抗原剁激)CD8^ T细胞CD25表达与健康对照无差异，而CD30表达低于健康对照(P＜0．05)。结论：哮喘病人CD8^ T细胞活化状态明显异常。     

CD4+CD25+调节性T细胞在肺癌患者外周血中的表达

目的探讨肺癌患者外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的变化及其与临床病理因素的关系。方法用流式细胞术检测60例肺癌患者和60例健康对照者的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数量变化。结果肺癌患者外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平明显高于正常组（P〈0．05），其变化与病理分期和是否有转移有关（P〈0．05），而和性别、家族史、病理类型和肿瘤体积等无关。结论CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可能在肿瘤免疫中发挥重要作用，导致和促进肺癌的发生和转移。     

CD+4CD+25调节性T细胞在干燥综合征患者外周血和唇腺组织的表达

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞在干燥综合征（SS）患者外周血和唇腺组织的表达。方法用流式细胞术检测57例SS患者和46例健康对照组外周血和唇腺组织单细胞悬液CCD4^＋CD25^＋调节T细胞的表达;用免疫组化的方法,对唇腺石蜡组织的连续切片进行CD4、CD25、CD68和CD8染色。结果SS组CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平中位数为6．9％（2．84％-13．50％）,对照组为5．77％～15．30％,两者比较P〈0．001。SS组CD4^＋CD25^high T细胞水平为0．001％～1．83％,对照组为0．13％～2．45％,两者比较P〈0．001。唇腺组织免疫组化染色显示ss组患者唇腺中浸润的淋巴细胞中,CD4^＋T细胞占大多数,两组均无CD25的表达。结论SS患者唇腺中缺乏CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞降低,提示调节性T细胞在SS的发病机制中起重要作用。     

胰腺癌患者IAP与CD4^＋CD25^＋T细胞的相关性

目的探讨胰腺癌患者血清血清免疫抑制酸性蛋白（immunosuppressive acidic protein,IAP）和外周血CD4^＋CD25^＋T细胞的相关性及临床意义。方法分别采用ELISA法和流式细胞技术检测55例胰腺癌患者血清IAP水平和外周血CD4^＋CD25^＋T细胞数量并进行相关性分析,同时与胰腺良性疾病组和健康对照组比较。结果胰腺癌患者外周血中CD4^＋CD25^＋T细胞和血清IAP的表达水平明显高于胰腺良性疾病组和对照组（P〈0．05）,且与肿块的大小、远处转移及临床分期显著相关性（P〈0．05）,胰腺癌患者外周血CD4^＋CD25^＋T细胞数量和血清IAP的表达成正相关。结论胰腺癌患者CD4^＋CD25^＋T细胞和血清IAP的水平与肿瘤的浸润转移和病程发展有关,胰腺癌患者外周血中CD4^＋CD25^＋T细胞数量的增多可能诱导IAP表达水平的增高。     

HCV感染者外周血T淋巴细胞亚群的变化

目的研究HCV感染者在病程各阶段外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法流式细胞仪检测丙型肝炎患者CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞,并将其分为急性期组,慢性期组检测CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD28^-T淋巴细胞。结果丙型肝炎患者CD4^＋T细胞降低,CD8^＋T细胞升高,CD4^＋／CD8^＋降低,与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。急性期组CD4^＋CD25^＋与正常对照组差异无统计学意义（P〉0．05）,但CD4^＋／CD28^-T细胞显著高于对照组（P〈0．05）、慢性期组CD4^＋CD25^＋T细胞显著增高,而CD4^＋CD28^-T细胞显著低于对照组（P〈0．05）。结论丙型肝炎患者CD4^＋／CD8^＋明显降低,机体免疫状态紊乱,在各病程阶段CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD28^-T细胞比率明显变化,说明此淋巴细胞亚群与丙型肝炎的发病及发展有密切关系。     

脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离及功能特征的比较

目的分离成人外周血、脐血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,并检测其功能,以了解脐血CD4^＋CD25^＋T细胞的特性。方法应用免疫磁珠分选法从健康成人外周血、脐血淋巴细胞中分离纯化CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞。应用流式细胞术检测分离纯度,胎盘蓝染色检测细胞存活率;RT-PCR技术检测CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞中Foxp3的mRNA的表达;体外增殖实验检测其对CD4＋CD25-T细胞的免疫抑制作用。结果 MACS分离的CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4＋CD25-T细胞纯度达（92.7±1.6）%、（90.3±1.2）%,细胞存活率达（95.3±2.1）%;体外经抗CD3、CD28单克隆抗体刺激培养的脐血及成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞同时得到扩增,而且高表达Foxp3;CD4^＋CD25^＋T细胞能有效的抑制效应T细胞的增殖,当效靶比为1︰1时,其抑制效应T细胞的作用最强,成人外周血抑制率为（81.36±1.61）%、脐血抑制率为（90.74±2.43）%。结论脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞是一群具有免疫抑制功能的调节性T细胞,与成人外周血相比,培养后的脐血CD4^＋CD25^＋T细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能。     

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的体外扩增

【目的】探讨有效的体外培养扩增CD4^＋CD25^＋Treg的方法。【方法】收集健康志愿者外周血5例,免疫磁珠法分选出CD4^＋CD25^＋Treg。将实验分为3组,第1组在CD4^＋CD25^＋Treg中加入100nmol／L rapamycin（1μg／mL）和包被了CD3／CD28单抗的磁珠培养3周,第8天开始加入1000U／mL的IL．2,第2组培养条件除不加rapamycin外其余与第1组相同,第3组培养细胞为CD4^＋CD25^＋细胞,培养条件同第1组。培养第7、14、21天收集细胞计数,第21天收集细胞行流式细胞术三标法检测CD4、CD25、FOXP3的表达。MTY法检测体外扩增的CD4^＋CD25^＋Treg对自体和异体的CD4^＋T细胞增殖的抑制作用。【结果】三组细胞均有明显的扩增。加rapamycin培养的CD4^＋CD25^＋Treg细胞的扩增率比不加rapamycin扩增倍数低,但细胞的纯度明显增加。CD4^＋CD25^＋T细胞组在培养第1周扩增迅速,从第2周开始增殖减慢,其中CD4^＋CD25^＋Treg细胞的比例较培养前无明显的差别。三组至第3周时扩增倍数分别为89±21、338±78、216±55（F=484．655,P〈0．0001）,细胞的纯度分别为84．32％±4．62％、34．04％±5．78％、0．68％±0．39％（F=24．660,P〈0．0001）。体外抑制实验显示体外扩增的CD4^＋CD25^＋T细胞对自体和异体的CD4^＋T细胞增殖均有明显的抑制作用,并且随着效靶比浓度的降低而降低。在CD4^＋T／Treg比例为8：1、4：1、2：1、1：1时对自体CD4^＋F细胞的抑制率分别为9．65％、16．43％、28．75％、55．34％,对异体CD4^＋T细胞的抑制率分别为6．43％、14．72％、26．47％、50．25％,而且在各浓度梯度其抑制作用在自体和异体之间均无明显的差异。【结论】我们采用rapamycin＋CD3／CD28单抗标记的磁珠＋IL-2在体外成功扩增了CD4^＋CD25^＋Treg,其扩增的倍数为89．4±20．53,具有免疫抑制功能,有望进一步应用于临床。     

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对HCV感染者疾病进程影响的研究

目的：探讨HCV感染者外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的表达状况以及与疾病进程的相关性。方法：选取HCV感染者69例及健康对照23例,应用流式细胞术检测外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的表达。结果：HCV感染组外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞占CD4^＋T细胞比例明显高于对照组（P〈0.01）;慢性感染组外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞比例高于HCV无症状携带组（P〈0.05）;肝硬化组外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞比例高于慢性感染组（P〈0.05）。结论：HCV感染者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平与疾病进程具有相关性。     

多发性硬化患者外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞FOXP3 mRNA的表达及临床意义

目的探讨多发性硬化（MS）患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数量以及叉头样转录因子（FOXP3）表达水平及其临床意义。方法（1）按Poser诊断标准结合头颅MRI增强扫描,排除合并其他神经系统疾病和免疫系统疾病,选择临床确诊和临床可能的MS患者53例（男15例,女38例）。所有患者近期均未行特殊免疫治疗。以统一标准进行登记临床评价、扩展的残癌状态评分;以健康体检者作为对照组,共51例（男14例,女37例）;（2）流式细胞仪检测外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数量的变化;（3）免疫磁珠分离出CD4^＋CD25^＋T细胞,RT-PCR法检测CD4^＋CD25^＋T细胞FOXP3 mRNA的表达,并进行半定量分析。结果（1）MS患者外周血中CD4^＋CD25high T细胞数量与正常组比较没有明显变化（P〉0.05）,但在活动期低于正常组,且差异有统计学意义（P〈0.05）;（2）同一个体在疾病活动期外周血中CD4^＋CD25 high T细胞数量较非活动期减少（P〈0.05）;（3）MS患者外周血中CD4^＋CD25^＋T细胞的FOXP3 mRNA表达降低（P〈0.05）,在活动期降低更明显（P〈0.01）。结论（1）就总体而言MS患者外周血CD4^＋CD25 high T细胞数量变化不明显,但CD4^＋CD25 high T细胞抑制活性降低,FOXP3 mRNA表达减少且与MS疾病活动性有关;（2）就个体而言MS患者外周血中CD4^＋CD25 high T细胞数量与疾病的活动性有关。     

大鼠CD4+CD25+调节性T细胞的分选和提取

目的 分选提取大鼠脾脏和淋巴结CD4+CD25+调节性T细胞并进行纯度和活性检测.方法 用免疫磁珠两步法既阴性选择和阳性选择分选提取大鼠CD4+CD25+调节性T细胞,流式细胞仪检测细胞纯度,台盼蓝染色计算细胞存活率.结果 免疫磁珠分选提取的CD4+CD25+调节性T细胞纯度在86% 以上,并且活性良好,活细胞百分率大于97%.结论 通过免疫磁珠分选能够提取高纯度高活性的CD4+CD25+调节性T细胞.     

IL-15诱导CD4+CD25- T细胞向CD4+CD25+调节性T细胞转化的机制探讨

目的初步探讨IL-15诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)转化的机制。方法采用免疫磁性细胞分离法分离人外周血中的CD4+CD25-T细胞,依据加入细胞因子不同分为4组:对照组、IL-15组、拮抗1组、拮抗2组,其中后3组均于培养的第1天加入IL-15,而拮抗1组和拮抗2组分别于培养第1、3天加入STAT5a封闭性肽。流式细胞仪检测细胞表型变化,3H-TdR掺入法检测IL-15诱导产生的Tregs抑制CD4+CD25-效应T细胞(Teff)增殖的免疫功能,Western blot法检测细胞内p-STAT5的变化。结果与对照组比较,IL-15能诱导CD4+CD25-T细胞中CD25和Foxp3表达上调,IL-15诱导生成的Tregs具有较天然Tregs稍弱的免疫抑制功能。Western blot检测结果显示,IL-15组p-STAT5表达较对照组明显上调。加入STAT5a封闭性肽后,拮抗1组和拮抗2组中CD4+CD25-T细胞中CD25和Foxp3表达下调,但拮抗2组[细胞表型分别为(47.9±6.0)%、(20.7±3.4)%]改变较拮抗1组[细胞表型分别为(30.7±8....     

慢性粒细胞白血病患者PBMCs中CD4+CD25+细胞体外增殖及对CD4+CD25-细胞增殖的影响

目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血单个核细胞(PBMCs)来源的CD4 CD25 细胞体外增殖及对CD4 CD25-细胞增殖的影响.方法 以免疫磁性分离方法(MACS)分选出CML患者外周单个核细胞中的CD4 CD25 及CD4 CD25-细胞后,用流式细胞仪分析细胞的纯度及活力;再以小鼠抗人CD3单抗、小鼠抗人CD28单抗及rh IL-2作为刺激因子,CD4 CD25 细胞与CD4 CD25-细胞共培养,观察CD4 CD25 细胞对CD4 D25-细胞增殖的抑制效应.结果 (1)分选后健康对照组及CML患者PBMC中CD4 CD25 细胞纯度分别为(84.93±2.55)%、(86.32±2.40)%,两者相比,无显著差异(P＞0.05);(2)经MACS分选后正常对照组与CML患者CD4 CD25 细胞活力分别为(98.12±0.68)%、(97.33±0.78)%,两者相比,无显著差异(P＞0.05);(3)无论是健康对照还是CML患者的CD4 CD25 细胞均具有明显抑制效应性细胞如CD4 CD25-细胞的增殖,随着CD4 CD25 细胞数的增加,这种抑制增殖的能力也相应增加,当CD4 CD25 T:CD4 CD25-T为1:1时,抑制率最大.结论 MACS分选法能够分选出高纯度及高活力的CD4 CD25 细胞,分选后CD4 CD25 细胞在体外均能抑制CD4 CD25-细胞增殖,且这种抑制效应呈一定效靶比关系.     

氨茶碱、地塞米松对哮喘患者CD4+CD25+T调节细胞抑制功能的影响

目的探讨哮喘患者CD4+ CD25+ T调节细胞的作用是否存在缺陷及药物(地塞米松、小剂量氨茶碱)对其作用的影响,为有效控制哮喘提供依据。方法分离哮喘患者及健康对照者外周血CD4+ CD25+ T调节细胞及CD4+CD25-T淋巴细胞并培养,设CD4+ CD25+ T调节细胞组、CD4+CD25-T淋巴细胞组及CD4+ CD25+ T调节细胞联合CD4+CD25-T淋巴细胞组,第3组又分为氨茶碱干预组、地塞米松干预组及空白对照组,72h后取培养上清液用ELISA法检测IFN-γ、IL-5、IL-13水平。结果健康对照者CD4+ CD25+ T调节细胞可抑制IFN-γ、IL-5及IL-13的生成(P<0.01),哮喘患者仅抑制IFN-γ、IL-5的生成(P<0.01);地塞米松预处理CD4+ CD25+ T调节细胞后,健康对照者CD4+ CD25+ T调节细胞抑制IFN-γ(P<0.05)、IL-5(P<0.01)、IL-13(P<0.01)生成能力增强,哮喘患者抑制IL-5、IL-13生成能力增强(P<0.01);采用氨茶碱预处理后,健康对照者CD4+ CD25+ T调节细胞抑制IL-5(P<0.01)、IL...     

人天然CD4+CD25+调节性T细胞的体外扩增培养及鉴定

目的：建立有效的体外培养扩增人天然CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的体系,并检测扩 增细胞的表型及体外免疫抑制功能,为Treg应用于临床免疫治疗提供实验基础。方法：免疫磁珠分离(MACS)方法从 人外周血单个核细胞中分离CD4+CD25+Treg,加入抗CD3/CD28包被磁珠刺激扩增;用台盼蓝染色法测定新鲜分选 的和扩增的Treg的数量和活性,用流式细胞法检测新鲜的和扩增的Treg主要表型标志和纯度,用混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte reaction,MLR)法检测扩增的Treg对羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酶(CFSE)标记的自体和异体的 CD4+CD25–T细胞增殖的抑制作用。结果：扩增3周后Treg数目约为新鲜分选细胞数的2 000倍(由5.23×105±1.52×105扩增 至1.02×109±0.20×109),活性>97%。扩增3周后的Treg与新鲜分选细胞保持了相似的表型特征：CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺三阳细 胞约占(94.22±2.12)%,与新鲜分选细胞相似。扩增3周后的Treg对自体和异体的CD4+CD25–T细胞的增殖均有明显的抑 制作用,抑制率随着效靶比浓度的增高而增高(P<0.01),而且其各浓度梯度对自体和异体CD4⁺CD25^–T细胞的抑制率 无明显差异(P>0.05)。结论：创建的分离和体外扩增人CD4⁺CD25⁺Treg的方法,可以大量扩增出高纯度且保留其免疫 抑制功能的Treg,解决了Treg数目少的问题,有利于进一步的免疫研究和治疗。     

CD4+ CD25+调节性T细胞在肺癌中的表达及其临床意义

目的：：探讨CD4+ CD25+调节性T细胞在晚期肺癌中的表达及其临床意义。方法：应用流式细胞术分析42例肺癌患者(肺癌组)外周血CD4+ CD25+调节性T细胞表达水平,与15名健康志愿者作对照。结果：肺癌组患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞数量为(7.17±3.63)%,明显高于对照组的(4.25±2.11)%(P<0.01)。肺癌组患者外周血中调节性T细胞数量在病理类型间差异无统计学意义(P>0.05),晚期肺癌患者外周调节性T细胞数量高于早期患者(P<0.05)。结论：调节性T细胞在肺癌患者中比率明显升高,并与临床进展有关。     

慢性乙型肝炎肝纤维化患者外周血CD4+CD25+CD127low/-T细胞与人肝星状细胞共培养的实验研究

目的探讨CD4+CD25+CD127low/-T细胞在慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化发病机制中的作用。方法按肝纤维化S分期将慢性乙型肝炎肝纤维化患者分为S1~S2期6例和S3~S4期7例;采用磁激活细胞分选法(MACS)提取13例患者和6例健康对照者外周血CD4+CD25+CD127low/-T细胞;分别将CD4+CD25+CD127low/-T细胞以不同比例与人肝星状细胞株(hepaticstellate cell,HSC)共培养5天,检测各组HSC的增殖及TGF-β1的分泌。结果 CD4+CD25+CD127low/-T细胞与HSC之比,当健康对照组和S1~S2期组为1.5∶1,S3~S4期组为2∶1时,HSC的增殖速度和TGF-β1分泌量均在同组不同比例中达最高值。各组同比例之间,当比例为1.5∶1时,健康对照组HSC的增殖速度显著高于S3~S4期组(P<0.05);在比例为1∶1~2∶1范围内,S1~S2期组和S3~S4期组HSC的TGF-β1分泌量远高于同比例健康对照组(P<0.05)。结论 CD4+CD25+CD127low/-T细胞可能通过自身细胞数量和功能的双重调节,影响肝星状细胞的增殖和分泌,参与了慢乙肝肝纤维化的进展。