淫羊藿苷基于雌激素受体对糖皮质激素诱导的MC3T3-E1成骨抑制的影响

目的 研究淫羊藿苷(icariin,ICR)对雌性激素受体(estrogen receptor,ER)与地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导的MC3T3-E1成骨抑制效应的影响。方法 分别以DEX 10^-5 mol·L^-1、ICR 10^-6 mol·L^-1、雌激素(E2)10^-8 mol·L^-1及ICI182780(IN)10^-5 mol·L^-1干预MC3T3-E1成熟分化过程,并通过real-time RT-PCR、Westen blot、MTT和茜素红染色法分别测定对应组各指标变化情况。结果 ICR和E2一样能够明显提高成骨细胞ALP、OPG、OC和Runx2的表达,并能够显著降低RANKL和Dickkopf的表达,对应的OPG和RANKL蛋白的表达量与mRNA的表达量相一致。ALP活性、细胞增殖能力以及Ga²⁺结节数量与对照组相比也有明显提高。同时ICR和E2都能够有效回复DEX诱导的成骨抑制效应,这种调节效应能够被IN有效的阻断。结论 ICR具有促成骨细胞增殖分化和抑制破骨细胞激活效应,并能够有效的缓解DEX诱导的成骨抑制效应;其促成骨效应具ER依赖性。     

染料木素促成骨样细胞增殖作用及其机制研究

目的观察染料木素(genistein)对成骨样细胞MC3T3-E1细胞增殖及骨形成蛋白-2(BMP-2)、β-连环素(β-catenin)表达的影响。方法培养成骨样细胞MC3T3-E1,加入不同浓度的染料木素(1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol·L-1),以1×10-9mol·L-1雌激素(β-estradiol,E2)作为阳性对照组,采用MTT比色试验法和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法,观察染料木素作用后MC3T3-E1的增殖及分化情况,以Westernblot方法检测成骨样细胞中BMP-2和β-catenin蛋白的表达。结果染料木素可促进MC3T3-E1细胞增殖,染料木素作用后细胞的ALP值也明显升高,呈浓度依赖性;染料木素可增加BMP-2和β-catenin表达,且呈浓度依赖性。结论染料木素促进MC3T3-E1细胞增殖与分化,可通过调节BMP-2和Wnt/β-catenin信号通路而影响成骨样细胞的活性。     

双酚S在T47D乳腺癌细胞中雌激素活性的研究

目的评价双酚S(Bisphenol S,BPS)在T47D乳腺癌细胞中的雌激素活性,探讨雌激素受体α(ERα)在BPS诱导的雌激素效应中的作用。方法以不同浓度的BPS刺激T47D乳腺癌细胞,通过新型四唑盐WST-8方法检测BPS诱导的细胞增殖,观察其增殖情况;通过Real-time PCR检测BPS对ERα下游基因(CTSD、GREB1、TFF1)mRNA表达的影响;利用ER抑制剂ICI182780研究ER在BPS诱导雌激素活性中的作用。结果细胞增殖实验显示当BPS达到1μmol/L时能显著刺激细胞增殖(P0.05),并且随着剂量的升高呈现出剂量-效应关系。1~10μmol/L BPS能够显著诱导ERα下游基因mRNA的表达(P0.01)。然而,雌激素受体抑制剂ICI182780能够显著抑制BPS诱导的细胞增殖和基因表达(P0.01)。结论在1~10μmol/L剂量下,双酚S能够在T47D细胞中具有明显的雌激素活性,并且该活性与ER的激活有关。     

胰高血糖素样肽-1及其类似物EX-4促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化

目的:观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其受体激动剂exendin-4(EX-4)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:取大鼠股骨和胫骨全骨髓,采用贴壁法分离BMSCs并传代至第三代,培养2d后分成4组:BMSC组、诱导成骨组(osteoblast induced medium,OIM组)和诱导加药组,诱导加药组细分为GLP-1(10-9~10-7 mol/L)或EX-4(10-9~10-7 mol/L)的不同浓度组,MTT法检测细胞增殖能力;测定碱性磷酸酶(ALP)活性;通过ALP染色及茜素红染色观察药物诱导BMSCs向成骨细胞分化、矿化的效果;采用RT-PCR方法检测ALP和Runx2成骨相关基因的表达情况。结果:与诱导对照组相比,GLP-1及EX-4各浓度处理组呈剂量依赖性显著促进细胞增殖(P<0.05);ALP染色与茜素红染色结果显示,对照组无显色或显色不明显,而GLP-1及EX-4组均有阳性显色。GLP-1及EX-4可以显著提高ALP活性,并提高Runx2、ALP的表达水平。结论:GLP-1及EX-4不仅能够直接促进BMSCs增殖,并促进其向成骨细胞分化,GLP-1及EX-4可能在骨重建中发挥重要的作用。     

高糖环境中吡格列酮对MC3T3-E1成骨细胞的作用及其机制

目的观察高糖环境下吡格列酮对MC3T3-E1成骨细胞的作用并探讨其可能机制。方法高糖(22.5 mmol·L~(-1))环境培养MC3T3-E1细胞,分为对照组,吡格列酮2.5、5、10μmol·L~(-1)组,干预24、48 h。检测细胞增殖活性、凋亡率、骨钙素和碱性磷酸酶(ALP)分泌水平,以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、成骨因子runt相关基因2(Runx2)和骨形态蛋白2(BMP-2)mRNA的表达水平。并分析PPARγ、Runx2的表达与骨钙素、ALP、BMP-2的相关性。结果在相同干预时限,吡格列酮各组MC3T3-E1成骨细胞增殖活性、骨钙素和ALP的分泌水平、Runx2 mRNA和BMP-2 mRNA的表达均低于对照组,凋亡率和PPARγmRNA的表达高于对照组(P<0.05)。随吡格列酮浓度增加,细胞增殖活性、骨钙素和ALP的分泌、Runx2 mRNA和BMP-2 mRNA的表达均降低,而细胞凋亡率和PPARγmRNA的表达增高(P<0.05)。与干预24 h相比,干预48 h时相同浓度吡格列酮组细胞增殖活性,骨钙素和ALP的分泌水平,PPARγ、Runx2、BMP-2 mRNA的表达或无变化或略增加。结论高糖环境下吡格列酮对成骨细胞有损害作用,促进PPARγ表达、抑制Runx2的表达可能为其作用机制之一。     

瘦素对绝经后骨质疏松病人骨髓间质干细胞定向分化后增殖的影响及相关机制研究

目的 探讨瘦素对绝经后骨质疏松病人骨髓间质干细胞(BMSCs)增殖分化的影响以及相关机制研究.方法 留取20例因股骨颈骨折行股骨头置换股骨头,分离获得骨髓间质干细胞,利用成骨诱导培养液诱导培养,检测BMSCs诱导前后细胞表面抗原表达,将细胞分为5组:A组、B组、C组和D组分别加入10、1×102、1×103、1×104 μg·L-1浓度的瘦素(leptin),对照组不加入leptin.MTT法检测各组成骨样细胞增殖能力,实时荧光定量PCR检测各组细胞中ALP、OCN、RANKL和OPN基因表达.结果 相比于诱导前,诱导后细胞表面CD44和HLA-DR表达量显著增加,而CD90和CD105表达量下降(P<0.05);与24 h时相比,A组、B组、C组、D组和对照组48、72、96 h时细胞增殖能力均增强(P<0.05);与对照组相比,A组、B组和C组48、72、96 h时细胞增殖能力显著增强(P<0.05),尤其是B组促增殖能力最强,而D组各时点细胞增殖能力则降低(P<0.05);与24 h时相比,A组、B组、C组、D组和对照组48、72、96 h时细胞中ALP、OCN和OPN mRNA相对表达量和OPN/RANKL比值均升高(P<0.05),且呈现随时间推移逐渐升高趋势,而RANKL mRNA相对表达量均降低(P<0.05),且呈现随时间推移逐渐降低趋势;A组、B组、C组和D组组间相比,48、72、96 h时细胞中ALP、OCN和OPN mRNA相对表达量和OPN/RANKL比值:B组>C组>A组>D组,而RANKL mRNA相对表达量:D组>A组>C组>B组.结论 leptin可促进绝经后骨质疏松病人BMSCs定向分化后成骨样细胞增殖分化,且具有时间依赖性,但存在最宜浓度.     

Genistein后处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤保护作用的机制初探

目的探讨Genistein后处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤产生保护效应的可能机制。方法实验分7组:假手术组、缺血/再灌注组、Genistein组,ICI182780组,正钒酸钠组,Genistein+ICI182780组,Genistein+正钒酸钠组;利用Langendorff离体心脏灌流技术,建立离体大鼠心脏局部缺血/再灌注Genistein后处理模型,应用工具药物雌激素受体拮抗剂(ICI182780)和酪氨酸磷酸酶抑制剂(正钒酸钠)给予干预,观察干预前后,离体心脏局部缺血/再灌注Genistein后处理模型大鼠心肌梗死面积、心肌酶和心功能等指标变化。结果与对照组相比,缺血再灌注组增高了心肌梗死区面积,降低了心脏灌流漏出液样品中超氧化物歧化酶(SOD)活力、左室收缩压(LVSP)-左室舒张压(LVEDP)恢复率等(P<0.05)。经不同药物干预后,ICI182780组、正钒酸组、Genistein+ICI182780组的心肌梗死区面积占危险区面积的百分比高于Genistein组(P<0.05),T-SOD活力低于Genistein组(P<0.05)。结论Genistein后处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤所发挥的保护作用,与Genistein本身具有的雌激素特性有关;而其本身具有的酪氨酸蛋白激酶抑制作用,对心肌保护是不利的。     

山柰酚体外促成骨分化作用研究

目的 探究不同浓度的山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响。方法 使用含不同浓度山柰酚的培养基培养骨髓间充质干细胞,通过CCK8检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶活力检测细胞的碱性磷酸酶表达水平,茜素红染色观察钙化结节形成情况,实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞Runx2、OCN成骨相关基因的表达水平。结果 10^-4mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖分化有明显抑制作用(P <0.05),10^-5、10^-8mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖分化无影响(P> 0.05),10^-6、10^-7mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖有明显促进作用(P <0.05),其中10^-6mol/L山柰酚还可促进骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达、成骨矿化以及Runx2、OCN成骨相关基因的表达。结论 10^-6mol/L山柰酚可以促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化。     

低温冻存对人牙周膜干细胞生物学特性的影响

目的观察超低温冻存对人牙周膜干细胞(PDLSCs)生物学特性的影响。方法体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限元稀释法筛选PDLSCs。将第3代人PDLSCs经液氮冻存半年后复苏,测其存活率,检测细胞免疫表型,对PDLSCs进行成骨诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及体外矿化能力,观察超低温冻存对PDLSCs生物学特性的影响。结果第3代人PDLSCs冻存、复苏前后两组细胞在细胞形态、生长过程、免疫表型、成骨分化能力等方面均无显著性差异(P>0.05)。结论超低温冻存对人PDLSCs活性、增殖、细胞免疫表型及成骨分化能力没有明显影响。     

异槲皮苷对MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响作用

目的研究异槲皮苷对体外培养MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化的影响作用。方法以细胞矿化结节染色鉴定MC3T3-E1成骨细胞株骨矿化功能,以MTT法测定成骨细胞的增殖率,以试剂盒法测定细胞内碱性磷酸酶(ALP)的活性。结果在终浓度为1.08×10-6mol·L-1、1.08×10-7mol·L-1、1.08×10-8mol·L-1时,异槲皮苷能极显著促进MC3T3-E1成骨细胞增殖(P<0.01);终浓度为1.08×10-6mol·L-1时,异槲皮苷作用96h后能极显著提高细胞内ALP的活性(P<0.01)。结论一定浓度的异槲皮苷能够显著促进MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化。     

骨髓来源成骨细胞体外成骨表达的研究

目的探索在体外诱导兔骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化及成骨表达的特性。方法抽取兔骨髓,通过离心法获取单个核细胞,在体外经条件培养基培养21d,通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞的形态学特点;应用MTT法测定成骨细胞活性;并检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性及形成矿化结节情况。结果体外BMSCs可在成骨条件培养液下诱导培养后可向成骨细胞分化,经倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察证实,诱导后BMSCs由长梭形转变为短胖形的成骨细胞,MTT检测成骨细胞活性良好,分泌碱性磷酸酶并形成矿化结节。结论骨髓基质干细胞在体外可定向诱导为成骨细胞,并具有成骨细胞功能,有希望成为理想的种子细胞应用于临床。     

槲皮素的植物雌激素作用及其受体机制研究

目的:探讨槲皮素(quercetin,Que)的植物雌激素作用及其可能的受体作用机制.方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法测定槲皮素对雌激素依赖性乳腺癌细胞T47D和非雌激素依赖性乳腺癌细胞MDA-MB231的细胞增殖作用,流式细胞术对T47D细胞的增殖情况进行分析.Western blot方法测定槲皮素对T47D细胞雌激素受体两种亚型ERα和ERβ表达的影响,并以雌激素受体拮抗剂ICI182,780为工具药来评价槲皮素发挥雌激素样作用与雌激素受体的关系.结果:与溶剂对照组相比较,槲皮素(10,20,40 μmol·L^-1) 能显著促进T47D细胞的增殖,而抑制雌激素受体阴性MDA-MB231细胞,并将T47D细胞周期由G₁期向S期推进,促进DNA合成,提高细胞分裂增殖指数;且槲皮素促进T47D细胞增殖作用被雌激素受体拮抗剂所拮抗,槲皮素在10 μmol·L^-1可明显诱导T47D细胞ERα蛋白表达,而对ERβ表达没有影响.当与ICI 182,780共孵育T47D细胞ERα表达被拮抗.结论:槲皮素具有雌激素活性,此作用是通过影响雌激素受体ERα蛋白表达介导的.     

柚皮素对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的影响

目的：观察柚皮素对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的治疗作用。方法50只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、柚皮素低、中、高剂量组,每组10只。假手术组施行假手术,其余4组均行卵巢摘除术,术后4周开始灌胃给予35、70、140 mg/kg柚皮素。12周后分别检测5组大鼠血清雌二醇(E2)、孕激素(P)、抗酒石酸酸性磷酸酶( TRACP)、碱性磷酸酶( ALP)、骨钙素( BGP),尿液钙( Ca)、磷( P)及脱氧吡啶啉( DPD)、骨密度( GMD)、股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷及骨小梁形态变化。结果与假手术组比较,模型组大鼠体重明显增加,子宫脏器系数明显降低,差异有统计学意义( P <0.05);柚皮素低、中、高剂量组大鼠体重较模型组明显降低,子宫脏器系数较模型组明显增加,差异有统计学意义( P <0.05),并呈剂量依赖性。与假手术组比较,模型组大鼠血清E2、P明显降低,差异有统计学意义( P <0.05);柚皮素低、中、高剂量组大鼠血清E2、P较模型组明显增加,差异有统计学意义( P <0.05),呈剂量依赖性。与假手术组比较,模型组大鼠血清TRACP及尿液Ca、P、DPD明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);柚皮素低、中、高剂量组血清 TRACP及尿液 Ca、P、DPD较模型组明显降低,差异有统计学意义( P <0.05),且呈剂量依赖性。与假手术组比较,模型组大鼠血清ALP明显增加,BGP明显降低,差异有统计学意义( P <0.05);柚皮素低、中、高剂量组大鼠血清ALP较模型组明显降低,BGP较模型组明显增加,差异有统计学意义( P <0.05),呈剂量依赖性。与假手术组比较,模型组大鼠BMD明显降低,差异有统计学意义( P <0.05);柚皮素低、中、高剂量组大鼠BMD较模型组明显增加,差异有统计学意义( P <0.05),呈剂量依赖性。与假手术组比较,模型组大鼠股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷明显降低,差异有统计学意义( P <0.05);柚皮素低、中、高剂量组大鼠股骨三点弯曲应力、L5腰椎抗压缩载荷较模型组明显增加,差异有统计学意义( P <0.05),呈剂量依赖性。与假手术组比较,模型组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁数、骨小梁厚度明显降低,骨小梁分离度明显增加,差异有统计学意义( P <0.05);柚皮素低、中、高剂量组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁数、骨小梁厚度较模型组明显增加,骨小梁分离度较模型组明显降低,差异有统计学意义( P <0.05),呈剂量依赖性。结论柚皮素对去卵巢所致大鼠骨质疏松症具有良好的治疗作用。     

淫羊藿次苷Ⅱ通过激活雌激素信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化

目的研究淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ,ICSⅡ)对大鼠体外培养骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,rBMSCs)成骨性分化过程中雌激素信号通路的影响。方法贴壁筛选法体外培养rBMSCs,采用1×10-5 mol.L-1的ICSⅡ进行药物干预,比较ICSⅡ组、ICI组(ICI 182.78)、ICSⅡ+ICI组、Estrogen组、Esreogen+ICI组和不加药的对照组之间雌激素通路相关因子(包括ERα、PR和PS-2)的表达量,同时对比各组之间的成骨性指标,包括碱性磷酸酶活性、骨钙素和Ⅰ型胶原分泌量及钙盐沉积量。提取TotalRNA,Real Time RT-PCR检测Runx-2、Osterix(OSX)、ERα、PR、及PS-2 mRNA的表达情况,同时提取总蛋白,Westernblot法检测Ⅰ型胶原蛋白、ERα、PR和PS-2的分泌量。结果 ICSⅡ可明显增强碱性磷酸酶(ALP)活性,促进骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的分泌和钙盐沉积,与成骨性分化相关的因子OSX和Runx-2的基因表达量也升高,但这些效应均可被雌激素通路的特异性阻断剂ICI 182.780所抑制。结论 ICSⅡ可促进rBMSCs的成骨性分化,但采用ICI 182.780阻断雌激素信号通路后,成骨性分化的指标随之降低,提示ICSⅡ是通过激活雌激素信号通路来促进rBMSCs成骨性分化的。     

克罗米酚对骨髓间质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响

目的　在离体条件下研究克罗米酚(CLO)对小鼠骨髓间质干细胞(BMSCs)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法　在含经活性炭吸附的 10%血清的无酚红α MEM中加入β 磷酸甘油和维生素C诱导小鼠BMSCs向成骨细胞分化,同时加入 0 1nmol·L-1至 10nmol·L-1CLO处理细胞。用细胞计数来反映细胞增殖情况;测定碱性磷酸酶 (ALP)活性与钙的沉积量反映细胞向成骨细胞分化状态;用试剂盒来检测一氧化氮 (NO)的产物。结果　CLO ( 0 1 ~10nmol·L-1 )呈剂量依赖性地增加小鼠BMSCs的数目,ALP活性和钙的沉积量,同时培养基中NO代谢产物明显增加。分别加入雌激素受体 (ER)拮抗剂ICI182, 780 (0 1μmol·L-1 )及一氧化氮合酶抑制剂L NAME( 6mmol·L-1 )均可阻止CLO促进BMSCs的增殖及向成骨细胞分化的作用,并取消NO代谢产物的增加。结论　CLO在 0 1 ~10nmol·L-1剂量范围内具有雌激素样受体激活效应,可通过ER/NO途径促进小鼠骨髓间质干细胞的增殖及向成骨细胞分化。     

Effects of anti-inflammatory drugs on proliferation, cytotoxicity and osteogenesis in bone marrow mesenchymal stem cells

Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) were found to suppress proliferation and induce cell death in cultured osteoblasts, and steroids were found to decrease the osteogenesis potential of mesenchymal stem cells. In this study, we further tested the effects of anti-inflammatory drugs (AIDs) on the functions of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). The BMSCs from mice (D1-cells) and humans (hBMSCs) were treated with dexamethasone (10(-7) to 10(-6) M), cyclooxygenase-2 (COX-2) selective NSAIDs (10(-6) to 10(-5) M) and non-selective NSAIDs (10(-5) to 10(-4) M). Drug effects on proliferation, cell cycle kinetics, cytotoxicity and mRNA and protein expressions of cell cycle regulators were tested. The osteogenesis potential of D1-cells were evaluated by testing mRNA expressions of type Ialpha collagen and osteocalcin 2-8 days after treatments, and testing mineralization 1-3 weeks after treatments. The results showed that all the tested drugs suppressed proliferation and arrested cell cycle of D1-cells, but no significant cytotoxic effects was found. Prostaglandin E1, E2 and F2alpha couldn't rescue the effects of AIDs on proliferation. The p27kip1 expression was up-regulated by indomethacin, celecoxib and dexamethasone in both D1-cells and hBMSCs. Higher concentrations of indomethacin and dexamethasone also up-regulated p21Cip1/Waf1 expression in hBMSCs, and so did celecoxib on D1-cells. Expressions of cyclin E1 and E2 were down-regulated by these AIDs in D-cells, while only cyclin E2 was down-regulated by dexamethasone in hBMSCs. All the tested NSAIDs revealed no obvious detrimental effects on osteogenic differentiation of D1-cells. These results suggest that the proliferation suppression of AIDs on BMSCs may act via affecting expressions of cell cycle regulators, but not prostaglandin-related mechanisms.     

槲皮素、补骨脂素对乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响

目的探讨槲皮素(quercetin,Que)和补骨脂素(psor-alen,Pso)对人类乳腺癌细胞株增殖的影响。方法采用流式细胞术和蛋白印迹法检测槲皮素和补骨脂素对雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7的影响,并以雌激素受体拮抗剂ICI182,780为工具药来评价槲皮素和补骨脂素发挥雌激素样作用与雌激素受体的关系。结果①槲皮素、补骨脂素在10μmol.L-1可使MCF-7细胞增殖指数明显升高,增加S期细胞的比例,与10-3μmon.L-1E2阳性对照组的变化趋势一致。当ICI182,780分别与E2、金雀异黄素、槲皮素、补骨脂素共孵育48 h后,E2、金雀异黄素、槲皮素、补骨脂素的增殖效应被抑制,细胞周期S期细胞数比例下降,G0/G1期细胞数比例上升。②10μmol.L-1槲皮素和10μmol.L-1补骨脂素均上调MCF-7细胞ERα蛋白水平,而对ERβ蛋白表达没有影响;当分别与ICI182,780共孵育MCF-7细胞ERα蛋白表达被拮抗。结论槲皮素和补骨脂素具有雌激素活性,此作用是通过雌激素受体(ER)介导的;产生的类似金雀异黄素促进MCF-7细胞增殖的作用是通过增加ERα表达实现的。     

Chronic ethanol intake inhibits in vitro osteogenesis induced by osteoblasts differentiated from stem cells

The study investigated whether chronic ethanol (ETH) intake and subsequent ETH exposure of cell cultures affects osteoblast differentiation by evaluating key parameters of in vitro osteogenesis. Rats were treated with 5-20% (0.85-3.43 mm) ETH, increasing by 5% per week for a period of 4 weeks (habituation), after which the 20% level was maintained for 15 days (chronic intake). Bone-marrow stem cells from control (CONT) or ETH-treated rats were cultured in osteogenic medium which was either supplemented (ETH) or not supplemented (CONT) with 1.3 mm ethanol. Thus, four groups relating to rat treatment/culture supplementation were evaluated: (1) CONT/CONT, (2) ETH/CONT, (3) CONT/ETH and (4) ETH/ETH. Cell morphology, proliferation and viability, total protein content, alkaline phosphatase (ALP) activity and bone-like nodule formation were evaluated. Chronic ethanol intake significantly reduced both food and liquid consumption and body weight gain. No difference was seen in cell morphology among treatments. Cell number was affected at 7 and 10 days as follows: CONT/CONT = CONT/ETH < ETH/CONT = ETH/ETH. Doubling time between 3 and 10 days was greater in groups of CONT animals: ETH/ETH = ETH/CONT < CONT/ETH = CONT/CONT. Cell viability and ALP activity were not affected by either animal treatment or culture exposure to ethanol. At day 21, the total protein content was affected as follows: ETH/ETH = CONT/ETH < ETH/CONT = CONT/CONT. Bone-like nodule formation was affected as follows: ETH/ETH < CONT/ETH < ETH/CONT < CONT/CONT. These results show that chronic ethanol intake, followed by the exposure of osteoblasts to ethanol, inhibited the differentiation of osteoblasts, as indicated by an increased proliferation rate and reduced bone-like nodule formation.