筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因

目的探讨最适退火温度和核酸扩增（PCR）周期,利用筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病（CML）的bcr-abl融合基因类型,并进行PCR荧光定量（RQ—PCR）,研究其与疾病的关系。方法通过改变PCR条件,将退火温度由55℃增加到60℃,反应周期由原来的30周期增加到45周期,检测14例22份标本。同时用荧光定量试剂检测标本。结果退火温度为58℃,45周期可测出10^3 copies／μl定量标准品的PCR产物。22份标本6cr-abl融合基因巢式PCR结果均阳性。其中b2a2型9份,b3a2型13份。定量检测18例阳性,量值在10^2-10^6copies／μg,两例急变患者急性期和慢性期有明显差异。结论筑巢式PCR是一种敏感而准确的检测方法,对bcr—abl进行定量有助于反映白血病细胞负荷、评价疗效及判断疾病预后。     

bcr-abl融合基因特异性siRNA对K562细胞生物学特性的影响

目的 应用特异性siRNA(小干涉RNA)抑制慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因表达,观察其对K562细胞生物学特性的影响。方法 以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21ntsiRNA,应用Western blot法检测bcr-abl融合基因的表达;^3H-TdR掺入法检测K562细胞的增殖活性;Annexin V-FITC／PI染色法检测K562细胞的存活状况;流式细胞仪法检测K562细胞周期变化以及联苯胺染色法检测K562细胞的分化状况;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-xL／Bax的表达。结果 (1)RNA干涉组：K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降;(2)RNA干涉组的CPM值(每分钟脉冲数)在siRNA转染K562细胞第24h,48h,72h和96h均明显低于对照组(下降率依次为33．06％,52．25％,57．64％,70．87％),(3)RNA干涉组转染48h时有43．2％的K562细胞发生凋亡;(4)RNA干涉组：K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL的表达水平下调,但Bax的表达无明显变化;(5)RNA干涉组：K562细胞联苯胺染色阳性比例增加,部分K562细胞向红系分化;(6)RNA干涉组K562细胞出现明显的G1期阻滞。结论 特异性siRNA分子可以显著抑制bcr-abl融合基因的表达,影响：K562细胞的基本生物学特性,最终导致K562细胞分化或凋亡。     

表达bcr-abl基因片段的可移植小鼠细胞系的生物学特性

目的建立稳定表达bcr-abl融合基因的、可移植的小鼠肿瘤细胞系,解决慢性粒细胞白血病疫苗研究的瓶颈问题。方法从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进反转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组反转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行反转录病毒滴度测定,计算病毒效价为2×107CFU/mL。收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击同品系BALB/c小鼠,观察SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的情况。结果经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。SP2/0/bcr-abl细胞能够在同品系小鼠体内形成移植肿瘤。结论该表达bcr-abl融合基因片段的小鼠肿瘤细胞系将作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定物质基础。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体的构建及其对K562细胞的影响

目的进一步研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法利用ＤＮＡ重组技术将所设计、合成的针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头型”核酶的基因用ＨＩｎｄⅢ、ｐｓｔⅠ酶切后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ±质粒相应酶切位点获得ｐＢＲＺ重组子。测定ＲＺ基因序列与设计的一致。用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ从ｐＢＲＺ上切下ＲＺ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，得到携带ＲＺ基因的重组逆转录病毒载体ＰＬＲＺＸＳＮ。通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将ＰＬＲＺＸＳＮ导入慢性粒细胞白血病细胞株Ｋ５６２细胞，通过克隆分析法、ＲＴ－ＰＣＲ、流式细胞仪、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果（１）核酶转染４８ｈ后，Ｋ５６２细胞克隆抑制率达８５％；（２）核酶转染７２ｈ后Ｋ５６２细胞Ｐ２１０ｂｃｒ—ａｂｌ蛋白表达率比未转染组低５２％；（３）核酶转染４８ｈ后，Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平比未转染组低７３％；（４）核酶处理的Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为核酶转染Ｋ５６２细胞７２ｈ后，用流式细胞仪可检测到明显凋亡峰，凋亡率为３７．１％，而空载体及脂     

抗bcr/abl mRNA特异性核酶作用于靶基因的细胞内外切割实验

目的 将已构建的具有抗慢性粒细胞性白血病(CML)融合基因bcr／ablmRNA的含核酶载体,进行细胞内外实验,了解抗bcr／ablmRNA核酶的切割效应。方法 含有抗靶基因的真核表达载体pAVGS4经酶切后,其中抗CML核酶M1-GSRNA的DNA序列被构建到pUCl9上得到pGS210,并经酶切和测序鉴定;合成bcr／abl融合位点前后的一段靶序列,克隆到pGEM-7zf( )上得到Pbcr-abl经测序鉴定,将pGS210和pbcr-abl进行体外转录,获得M1-GS RNA及其作用底物,将两者混合、孵育,通过放射自显影术检测切割的效果;将pAVGS4转染到CML细胞株K652细胞内,通过RT-PCR方法了解核酶对于目标RNA的作用效应。结果 Pbcr-abl经酶切电泳及测序证实载体中含有目标序列,M1-GSRNA作用于底物后,放射自显影术检测显示底物RNA被有效切割。pAVGS4转染到K562细胞48和72h后,RT-PCR显示bcr／ablmRNA被有效切割。结论 pAVGS4可以有效地切割K562细胞内的bcr／ablmRNA,预期可作为CML池分子靶向治疗的工具。     

慢性粒细胞白血病骨髓的体外净化

目的 :探讨白细胞介素、干扰素α2α、bcr -abl反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病骨髓体外净化效果。方法 :采用体外克隆形成培养技术 ,分别用白细胞介素、干扰素α2α、bcr-abl反义寡核苷酸不同的组合方案 ,进行体外净化 5例慢性粒细胞白血病 (CML)骨髓。结果 :联用IL - 2、IFN -α2α(各 80 0um/ml)、bcr-ablAS -ODN(30ug/ml)方案 ,对白血病细胞克隆形成单位 (L -CFU)抑制作用有显著差异 (P <0 .0 1 ) ,而相同条件下 ,GM-CFU及L -CFU的集落存活率分别为 2 6 .91 %和 3 .49% (P <0 .0 1 )。结论 :联用IL - 2、IFN -α2α(各 80 0u/ml)、bcr-ablAS -ODN(30ug/ml)方案 ,选择性体外净化慢性粒细胞白血病细胞的效果好 ,可用于临床净化CML骨髓。     

慢性粒细胞白血病骨髓体外净化的实验研究

目的　探讨白细胞介素、干扰素 α2 a、bcr- abl反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病骨髓体外净化效果。方法　采用体外克隆形成培养技术 ,分别用白细胞介素、干扰素 α2 a、bcr- abl反义寡核苷酸不同的组合方案 ,体外净化 5例慢性粒细胞白血病 (CML)骨髓。结果　联用 IL- 2、IFN- α2 a(各 80 0 u/ m l)、bcr- abl AS- ODN(30 μg/ ml)方案 ,对白血病细胞克隆形成单位 (L- CFU)抑制作用有显著差异 (P<0 .0 1) ,而相同条件下 ,GM- CFU及 L- CFU的集落存活率分别为 2 6 .91%和 3.49% (P<0 .0 1)。结论　联用 IL- 2、IFN- α2 a(各 80 0 u/ m l)、bcr- abl AS- ODN(30 μg/ml)方案 ,选择性体外净化慢性粒细胞白血病细胞的效果好 ,可用于临床净化 CML 骨髓     

白血病患者融合基因检测

目的 测白血病患者融合基因水平,评估实时定量RT-PCR技术在辅助白血病临床诊断和药物疗效判定方面的价值.方法 30例慢性粒细胞白血病(CML)患者,15例急性早幼粒细胞白血病(APL)患者,实时定量RT-PCR技术检测骨髓或外周血单个核细胞中白血病融合基因M-bcr/abl或PML/RARα的表达,结合临床资料进行分析.结果 1)30例CML患者的 bcr/abl融合基因检测阳性率为93.3%(28/30);检测15例APL患者的PML/RARα融合基因检测阳性率为96.7%(13/15).2)3例CML患者应用甲磺酸-伊马替尼治疗后定量检测bcr/abl 融合基因的拷贝数较治疗前明显降低或转阴(2/3).15例APL患者融合基因检测阳性经亚砷酸+化疗治疗后PML/RARα融合基因的拷贝数较治疗前明显降低或转阴(7/15).结论 实时定量RT- PCR 技术操作简便,检测白血病融合基因的准确性高,在辅助临床诊断和白血病患者药物疗效判定方面都有较大的应用价值.     

针对bcr/abl融合蛋白的治疗研究进展

bcr/abl融合蛋白在慢性粒细胞白血病的发生与发展中扮演着重要的角色,针对bcr/abl为靶点的治疗已成为当前研究的热点。结合近年来的大量相关文献,对目前的研究现状进行综述并给予相应的评价。     

应用改良的多聚酶链反应诊断慢性粒细胞性白血病BCR／ABL融合基因

应用改良的多聚酶链反应诊断慢性粒细胞性白血病ＢＣＲ／ＡＢＬ融合基因生化教研室伞德忠，张乃忠，王莉琳，宋磊二院于军，武宝珍，夏丽娟海拉尔地区医院刘昌勋慢性粒细胞性白血病（ＣＭＬ）是首先被发现的细胞染色体异常的疾病，此异常染色体称ｐｈ染色体。研究表明这种...     

BCR/ABL融合蛋白对鞘氨醇激酶和1-磷酸鞘氨醇分泌的影响

目的 研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响.方法 使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞.利用RT-PCR鉴定病毒转染.Western Blot检测SPK表达,γ-32P-ATP掺入法检测细胞SPK活性和培养上清的S1P含量.应用同样方法检测不同剂量Gleevec对K562细胞培养上清中S1P的影响.结果 RT-PCR结果显示bcr/abl基因转染成功. 高表达BCR/ABL融合蛋白的HL-60和ECV304均比转染空载体后的细胞SPK表达、活性和S1P分泌均显著提高.随着Gleevec浓度的增加,K562细胞培养上清中S1P的含量逐渐减少.结论 BCR/ABL融合蛋白可提高细胞SPK表达、活性和S1P分泌.     

格列卫对慢性粒细胞白血病病人Foxo3a和bcr-abl融合基因表达影响

目的 探讨初发及格列卫治疗的慢性粒细胞白血病(CML)病人骨髓中转录因子Foxo3a和bcr-abl融合基因的表达及其临床意义.方法 采用SYBR Green Ⅰ建立的实时荧光RT-PCR的方法,检测18例初发及10例格列卫治疗的CML病人骨髓样本中Foxo3a和ber-abl融合基因的表达,以GAPDH为内参基因,以行骨髓穿刺排除诊断的非血液病病人的骨髓为对照组;各实验组基因表达水平的差异采用AACT相对定量法计算.结果 初发CML病人骨髓bcr-abl融合基因的表达水平与格列卫治疗组比较差异有显著性(X<'2>=4.25,P<0.05);3组骨髓样本中Foxo3a的表达水平比较差异均有显著性(X<'2>=5.73～13.73,P<0.01);且初发CML病人的ber-abl融合基因的高表达与转录因子Foxo3a的低表达呈明显负相关(r=-0.674,P<0.01).结论 格列卫降低CML病人bcr-abl融合基因表达的同时可以增加Foxo3a的表达;转录因子Foxo3a的低表达与bcr-abl融合基因的高表达密切相关,二者可能共同参与CML的发生.     

BCR-ABL融合基因阳性的急性混合细胞白血病2例并文献复习

目的 探讨BCR-ABL融合基因阳性的急性混合细胞白血病的特点及其可能原因.方法 对2例BCR-ABL融合基因阳性的急性混合细胞白血病患者的临床资料、细胞形态学、流式细胞仪免疫分型结果及荧光原位杂交术进行分析,并结合文献进行复习.结果 文献及本组病例共6例,6例患者均BCR-ABL融合基因阳性或t(9;22)(q34,q1l)即Ph染色体阳性;3例慢性粒细胞白血病急变为BCR-ABL融合基因阳性的急性混合细胞白血病,3例无慢性粒细胞白血病病史,初发诊断为BCR-ABL融合基因阳性的急性混合细胞白血病;4例双系列型,1例双表型,1例系列转换型.结论 初发的 BCR-ABL融合基因阳性的急性混合细胞白血病鲜有报道,部分病例由慢性粒细胞白血病急变而来.     

非病毒载体H1s-EGFc的构建及其功能的初步研究

目的 探讨和构建一种用于靶向性基因治疗的非病毒载体。方法 采用基因工程的方法构建H1s—EGFc融合蛋白表达载体,在毕赤酵母表达系统中获得分泌表达的融合蛋白。使用阴离子交换柱及分子筛进行纯化。制备H1s—EGFc融合蛋白与pKG杀伤基因表达重组体的复合物。选用表皮生长因子受体高表达的HeLa细胞及表皮生长因子受体不表达的Jurkat细胞进行复合物特异性杀伤活性测试。结果 构建并表达了H1s—EGFc融合蛋白,所获融合蛋白纯度可达90％以上。该融合蛋白能够有效地包装杀伤基因表达载体,将其导入表皮生长因子受体特异性表达的肿瘤细胞中,达到靶向性杀伤作用,当融合蛋白／杀伤基因复合物使用剂量分别是3、6、9μg／ml时,杀伤率分别为30．6％、36．2％和58．1％;而对表皮生长因子受体不表达的细胞无杀伤作用。结论 融合蛋白H1s—EGFc能够有效地用于功能基因的包装及转运,可以作为非病毒载体应用于恶性肿瘤的靶向性基因治疗。     

初发慢性粒细胞白血病采用甲磺酸伊马替尼治疗临床检验观察

目的评价甲磺酸伊马替尼治疗初发慢性粒细胞白血病(CML)疗效和安全性。方法 28例初发慢性粒细胞白血病患者应用甲磺酸伊马替尼治疗,观察随访期内患者血液学、骨髓细胞学、细胞遗传学、分子遗传学改变、骨髓抑制及感染等不良反应。随访期结束后对2例有附加染色体异常的慢性期及8例进展期(5例加速期和3例急变期)患者进行追踪观察。结果 28例CML患者中位治疗和随访时间均为18个月,血液学总有效率为92.86%,细胞遗传学总有效率为85.71%,分子遗传学总有效率为60.71%。慢性期患者血液学、细胞遗传学及分子遗传学疗效明显优于进展期患者(P0.01,P0.05,P0.05)。治疗相关性不良反应多为1~2级,患者均能耐受完成治疗。结论甲磺酸伊马替尼治疗CML慢性期能获得较好的血液学、细胞遗传学及分子遗传学疗效,对于进展期患者疗效较差。     

bcr/abl反义寡聚脱氧核苷酸抑制慢性粒细胞白血病细胞生长的研究

目的：研究bcr/abl基因的反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASON）对K562细胞生长的影响。 方法：根据bcr/abl基因类型（b₃/a₂）的cDNA序列分析,以其 mRNA融合区的18个核苷酸为作用靶序列,人工合成了18聚ASON片段,同时合成18聚无义ASON片段,作为序列特异性对照。用ASON和无义ASON片段与K562细胞共同培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学、³H-TdR掺入率、bcr/abl mRNA和P210蛋白的表达。 结果：3.5～30.0 μmol•L^-1的ASON对K562细胞生长有不同程度的抑制作用,ASON浓度低于10.0 μmol•L^-1 时抑制作用很小,大于10.0 μmol•L^-1时抑制作用显著,这种作用有浓度、时间依赖关系,而无义ASON与空白对照组比较差异无显著性(P<0.05)。同时发现ASON使细胞的 ³H-TdR掺入率下降, bcr/abl mRNA及P210蛋白的表达下降。结论：ASON的抑制作用是从基因水平上封闭了bcr/abl mRNA转录及P210蛋白的翻译,抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。ASON对慢性粒细胞白血病(CML)细胞有抑制作用。     

携SH2-Caspase8融合基因重组腺病毒的构建及对K562细胞增殖的影响

目的构建并鉴定携SH2 -Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法采用RT-PCR、重叠PCR扩增SH2-Caspase8融合基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-SC-EGFP,进行酶切和测序鉴定。将PmeⅠ酶...     

一种灵敏检测慢性粒细胞性白血病融合基因的方法:RT-nested-PCR

应用RT-nsted-PCR方法检测15例慢性粒细胞性白血病患者的融合基因bcr/abl，检出率高达93％。此方法是当前检测慢性粒细胞性白血病残留细胞较灵敏、较可靠的方法。