含糖腹透液对大鼠腹膜间皮细胞功能的影响

目的 探讨含糖腹透液对大鼠腹膜间皮细胞功能的影响.方法 体外培养的大鼠腹膜间皮细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,同时观察细胞内游离钙的水平和ICAM-1表达水平.结果 腹膜透析液刺激1 h后,体外培养的大鼠腹膜间皮细胞早期凋亡率增高;随着腹透液中糖浓度越高,刺激时间越长,凋亡率增高越明显,ICAM-1表达显著增加,细胞内游离钙水平下降.结论 高糖腹透液可以增加腹膜间皮细胞其凋亡率,降低细胞游离钙水平和增加ICAM-1的表达,这些改变可能是长期腹透病人腹膜纤维化和发生失超滤的原因.

Abstract：

Objective To investigate the effects of peritoneal dialysis solution (PDS) on apoptosis and intracellular free calcium ([Ca~(2+)]i), cell surface ICAM-1 expression of rat peritoneal mesothelial cells (RPMCs). Methods The RPMCs apoptosis rate were determined by flow cytometry. [Ca~(2+)]i in the cells were monitered the fluorescence at 528 nm by confocus laser microscopy. Cell surface ICAM-1 expression were detected by flow cytometry. Results After PDS treatment for 1 h, the RPMCs apoptosis rate were increased. Such increase was more manifest with higher glucose concentration in PDS and longer treatment time of the cells. At the same times, after 3 hours, ICAM-1 expressions of the PDS containing glucose and mannitol are all increased. With the increase of glucose concentrations, the descend of [Ca~(2+)]i levels were aggravated.Conclusion PDS containing high- concentration glucose can induce significant apoptosis of RPMCs in vitro. This may be related with the enhanced level of ICAM-1 expressions and the decreased level of [Ca~(2+)]i. Which may due to the occurrence of peritoneal fibrosis and ultrafiltrate failure in patients suffering long term peritoneal dialysis.     

腹透液相关浓度葡萄糖对体外腹膜间皮细胞的影响

目的 研究腹透液相关的三种浓度葡萄糖（1．5％、2．5％、4．25％）对体外培养的腹膜间皮细胞凋亡及其形态的影响。方法 胰蛋白酶消化法从腹膜组织中分离间皮细胞，建立体外培养模型。采用Hoechst 33258荧光染色法及流式细胞仪技术测定体外培养的腹膜间皮细胞在腹膜透析液相关浓度葡萄糖作用下的凋亡率；采用透射电子显微镜技术观察高浓度葡萄糖对体外培养的腹膜间皮细胞形态学的影响。结果Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞仪结果显示：与对照组比较，1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖均能引起明显的腹膜间皮细胞的凋亡（P〈0．05），三种浓度葡萄糖组间也有显著的差异（P〈0．05），4．25％甘露醇能引起明显的凋亡（P〈0．01），4．25％葡萄糖与4．25％甘露醇比较，前者能引起明显的凋亡（P〈0．05）；与正常对照组比较，1．5％葡萄糖分别作用于腹膜间皮细胞24h、72h、120h，各时间组均出现明显的凋亡（P〈0．05）。腹膜间皮细胞的凋亡率与葡萄糖浓度和作用时间呈正相关（r〉0．7．P〈0.05）。透射电子显微镜观察4．25％葡萄糖作用72h后大鼠腹膜间皮细胞的形态变化：细胞表面的微绒毛倒伏、脱失；细胞质内出现线粒体空泡样变；细胞核内的染色质浓缩、边集；出现凋亡小体。结论 腹膜透析液相关的三种浓度葡萄糖和4．25％的甘露醇均能引起腹膜间皮细胞的凋亡；葡萄糖诱导的腹膜间皮细胞凋亡具有浓度和时间依赖性；葡萄糖引起的细胞凋亡不仅与其渗透压有关，还与葡萄糖代谢有关；葡萄糖引起的细胞形态改变有：腹膜间皮细胞表面的微绒毛倒伏、缺失；细胞质内的线粒体出现空泡样变：细胞核内出现染色质浓缩、边集的改变。     

乳酸盐腹膜透析液对人腹膜间皮细胞凋亡及bcl-2、bax表达和caspase-3活性的影响

目的： 探讨不同浓度乳酸盐腹膜透析液(L-PDS)对腹膜间皮细胞(HPMC)凋亡和bcl-2、bax表达及caspase-3活性的影响。方法:采用酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型,分别用浓度为1.50%、2.50%和4.25%的L-PDS与HPMC共同培养,同时设对照组。采用流式细胞术检测HPMC凋亡,采用RT-PCR法测定bcl-2及bax mRNA的表达,采用免疫荧光法检测caspase-3的活性。结果:与对照组比较,L-PDS各组HPMC凋亡率增加,bcl-2 mRNA的表达降低,bax mRNA表达升高,caspase-3活性增加,上述指标变化中2.50%及4.25%L-PDS组与对照组比较差异有显著性(P<0.05),4.25%L-PDS组与2.50%L-PDS组比较差异也有显著性(P<0.05),而1.50%L-PDS组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论： L-PDS可诱导HPMC 凋亡,其机制可能是通过对bcl-2及bax mRNA表达的改变以及激活caspase-3活性而实现。     

黄芪注射液拮抗腹膜透析液诱导腹膜间皮细胞凋亡的研究

目的:了解黄芪注射液对体外培养的人腹膜间皮细胞凋亡的影响。方法:培养液中添加含不同浓度黄芪注射液的1.5%葡萄糖腹膜透析液(PDS),观察细胞caspase-3活性变化,应用Annexin V/PI双染色流式细胞仪方法以及末端标记技术(TUNEL)观察各组腹膜间皮细胞凋亡的情况。结果:以对照组caspase-3活性为1,PDS组细胞caspase-3相对活性为3.26±0.91,显著高于黄芪一组(1.87±0.43)和黄芪二组(1.67±0.32),P<0.05。An-nexin V-FITC/PI双标记结果显示,PDS组细胞凋亡率和死亡率分别为(46.8±14.2)%和(25.7±12.4)%,显著高于对照组的(9.04±4.86)%和(7.96±4.28)%,P<0.05;黄芪一组和黄芪二组的细胞凋亡率和死亡率显著低于PDS组(P<0.05)。TUNEL研究结果显示,PDS组细胞凋亡明显高于对照组、黄芪一组和黄芪二组。结论:黄芪注射液可抑制PDS诱导的腹膜间皮细胞凋亡的发生。     

不同浓度腹透液对大鼠腹膜间皮细胞单核细胞趋化蛋白-1的影响

目的探讨非感染状态下,腹透液（PDF）对腹膜间皮细胞（PMCs）产生单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响,及其与持续性不卧床腹膜透析（CAPD）相关性腹膜硬化的关系。方法将40只大鼠随机分为5组,除正常对照组外分别给予1.5%、2.5%和4.25%PDF及NS腹腔注射,40ml/d,第15天取标本检测PMCs中MCP-1mRNA表达,血清和PDF中MCP-1浓度,腹膜纤维连接蛋白（FN）的表达。结果3个腹透液实验组PMCs中MCP-1mRNA表达,4.25%腹透液组高于2.5%组和1.5%组,差异具有显著性（P〈0.05）;PDF中MCP-1水平和腹膜中FN表达,4.25%腹透液组最高,但与2.5%和1.5%组比较差异没有显著性。血清中的MCP-1水平在5组中未见显著差异（P〉0.05）,且均低于PDF中。FN水平与PMCs中MCP-1mRNA表达和PDF中MCP-1蛋白质水平均呈正相关。结论高浓度PDF可使PMCs中MCP-1mRNA表达升高。MCP-1升高可能是CAPD相关性腹膜硬化的原因之一。大量NS灌入腹腔也可导致腹腔炎症状态。     

左旋肉碱对高糖条件下人腹膜间皮细胞增殖、凋亡及纤维连接蛋白分泌的影响

目的：探讨左旋肉碱对高糖条件下体外培养人腹膜间皮细胞增殖、凋亡及纤维连接蛋白（FN）分泌的影响。方法：以不同浓度左旋肉碱作用体外培养人腹膜间皮细胞，MTT法测定细胞增殖，Annexin V-FITC／PI双标记法检测细胞凋亡，ELISA法检测培养液中FN浓度。结果：不同浓度左旋肉碱作用24h后，0．1％左旋肉碱组细胞增殖活性显著升高（P〈0．05），作用72h后0．5％及1．0％左旋肉碱组细胞增殖活性明显降低（P〈0．05）。作用48及72h后0．05％及0．1％左旋肉碱组细胞凋亡率降低。作用24h后0．05％左旋肉碱组培养液中FN浓度升高（P〈0．05），作用72h后左旋肉碱组培养液中FN浓度均下降（P〈0．01）。结论：高糖条件下一定浓度的左旋肉碱可以促进人腹膜间皮细胞增殖、减少其凋亡。     

黄芪液拮抗乳酸盐腹透液对人腹膜间皮细胞的损伤作用

目的 :研究黄芪液对乳酸盐腹透液致腹膜间皮细胞增殖及损伤作用的影响。方法 :采用胰蛋白酶 -ED TA消化法 ,从人腹膜组织中分离间皮细胞 ,并建立体外人腹膜间皮细胞 (HPMC)培养模型。以MTT法测定HPMC增殖程度 ,采用自动生化分析仪检测 ,培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)水平示细胞损伤程度。结果 :2 .5 %乳酸盐腹透液中加用黄芪液 (1mg/ml)与HPMC作用 4 5min ,其培养液中LDH水平较腹透液对照组明显降低(P <0 .0 1) ,HPMC增殖能力明显增强 (P <0 .0 1)。结论 :黄芪液能拮抗乳酸盐腹透液致HPMC的损伤。     

腹透液CA125水平与腹膜转运的关系

目的探讨腹透患者检测癌抗原125(CA125)的临床意义以及间皮细胞在腹膜转运中的作用。方法采用4.25%葡萄糖浓度的腹透液对34例腹透患者行腹膜平衡试验,于腹透液留腹4h时采集10mL用放免法测定CA125浓度,并用体表面积校正。收集0、1、4h的透析液及1h的血标本,测定肌酐和葡萄糖浓度,记录净超滤量(nUF),计算4h透析液肌酐与血肌酐浓度之比(D/Pcr)、肌酐转运面积系数(MTACcr)、葡萄糖吸收率(Glu%)、1h透析液钠与血钠比值(D/PNa+)等溶质和液体转运参数。结果腹透液CA125平均浓度为(7.39±4.47)U·mL-1·1.73m～2。腹透液CA125水平与患者腹透龄呈显著负相关(P<0.05);与D/PNa+弱正相关(P<0.05);与溶质转运参数D/Pcr、MTACcr、Glu%、nUF不相关。结论动态观察腹透液CA125水平可间接了解腹膜间皮细胞状态。随着腹透治疗时间的延长,腹膜间皮细胞的数量会逐渐减少。腹透时间皮细胞不是溶质转运的一道重要滤过屏障。     

高糖对人腹膜间皮细胞的增殖和损伤及分泌细胞因子的影响

目的：探讨高糖介导腹膜纤维化的可能机制。方法：原代培养的第3代人腹膜间皮细胞（HPMCs）分为不同时间（24,48h）的对照组（F12）和高糖组（F12＋4％葡萄糖）。用MTT法测定细胞增殖,乳酸脱氢酶（LDH）法观察细胞损伤程度,采用酶联免疫法（ELISA）测定纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGF）蛋白水平以及采用RT-PCR测定FN,TGF-β1和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA表达。结果：①高糖明显抑制细胞增殖,24h和48h高糖组与同一时间点对照组比较,MTT吸光度值均明显下降（P〈0．001或P〈0.01）;②高糖明显导致细胞损伤,24h和48h高糖组与同一时间点对照组比较,培养液中LDH含量均明显增加（均P〈0.001）;③高糖培养24,48h均使FN,CTGF和TGF-β1蛋白表达增加（P〈0．05或P〈0.001）;④高糖使FN,TGF-β1和PAI-1 mRNA表达均上调。结论：高糖能够抑制HPMCs增殖,损伤HPMCs,并刺激HPMCs分泌更多的TGF-β1,CTGF,FN和PAI-1,从而使HPMCs细胞外基质生成增多、降解减少,最终导致腹膜纤维化的形成。     

腹透液相关浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞周期蛋白的影响及葛根素的拮抗作用

目的研究腹透液相关浓度葡萄糖（1.5%、2.5%）对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白p21的影响及葛根素的拮抗作用。方法人腹膜间皮细胞在含糖（1.5%、2.5%）、含糖含葛根素（葛根素终浓度为100 mg/L）的无血清培养基中培养24 h后,用流式细胞仪分析细胞周期,Western blot测定p21蛋白的表达。结果经含糖1.5%和含糖2.5%培养基培养24 h后人腹膜间皮细胞大多出现肥大和停滞于细胞周期的G1期。高浓度葡萄糖刺激p21蛋白表达,含糖2.5%组和含糖1.5%组无显著性差异（P〉0.05）。含葛根素含糖组腹膜间皮细胞中处于G1期细胞数较相应浓度含糖组减少,p21表达减少（P〈0.05）。结论高糖可刺激人腹膜间皮细胞p21蛋白的表达,且可能与高糖作用下细胞肥大及G1期阻滞有关,葛根素可在一定程度上拮抗高糖对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白的影响。     

腹膜透析液对腹膜间皮细胞TLR2和TLR4表达的影响

目的：观察不同浓度葡萄糖（dextrose）腹膜透析液、艾考糊精（icodextrin）腹膜透析液对人腹膜间皮细胞 Toll 样受体2（TLR2）和 TLR4表达的影响。方法体外培养人腹膜间皮细胞株第5～10代（HMrSV5,DMEM ／F12培养基含10％胎牛血清）用于实验研究。 M TT 检测细胞活力,实验分为5组：阴性对照组、1．50％ dextrose 组、2．50％ dextrose 组、4．25％ dextrose 组、7．5％ icodextrin 组,应用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 TLR2和 TLR4的表达水平。结果不同浓度 dextrose 腹膜透析液作用24 h 对腹膜间皮细胞 TLR2和 TLR4的表达无明显影响。作用48 h ,1．50％ dextrose 组、2．50％ dextrose 组、4．25％ dex-trose 组 TLR2分别降低（5．5±2．8）％、（31．4±7．5）％、（54．9±1．9）％,TLR4分别降低（32．9±17．6）％、（47．7±13．5）％、（66．4±13．5）％;作用72 h ,1．50％ dextrose 组、2．50％ dextrose 组、4．25％ dextrose 组 TLR2表达分别降低（29．4±14．7）％、（38．9±9．9）％、（63．5±16．5）％,TLR4表达分别降低（59．5±16．8）％、（63．1±9．5）％、（79．2±14．0）％;7．5％ icodextrin 组TLR2和 TLR4表达与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 dextrose 透析液下调 HM rSV5 TLR2和 TLR4的表达;icodextrin 透析液对 TLR2和 TLR4的表达无显著影响。     

Inhibiting effect of short hairpin RNA on expression of transforming growth factor-β1 in human peritoneal mesothelial cells induced by peritoneal dialysis solution

The peritoneum response to peritoneal dialysis can lead to fibrosis. The transforming growth factor-β1 （TGF-β1） plays an important role in regulating tissue repair and remodeling after injury. Excessive synthesis and deposition of matrix proteins by peritoneal mesothelial cells can lead to structural and functional changes in the peritoneal membrane, jeopardizing the long-term efficacy of peritoneal dialysis （PD）. Prolonged exposure to high glucose concentrations in PD fluid has been implicated as a major stimulus to matrix accumulation, through the induction of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）.     

不同含糖浓度腹膜透析液对腹膜间皮细胞紧密连接影响的动物实验

目的观察含不同葡萄糖体积分数的商用乳酸盐腹膜透析液对大鼠腹膜功能和腹膜间皮细胞紧密连接的影响。方法正常清洁级SD雄性大鼠36只,随机分为对照组(0.9%氯化钠溶液)、低糖组(葡萄糖体积分数为1.50%)和高糖组(葡萄糖体积分数为4.25%),腹腔内灌液后8周检测腹膜透析超滤量、腹膜对尿素氮、肌酐清除率和蛋白丢失量,苏木精-伊红(H～E)染色光学显微镜下观察腹膜结构,透射电子显微镜观察腹膜紧密连接的形态,采用免疫组织化学法观察大鼠腹膜间皮细胞封闭蛋白-1(ZO-1)表达的阳性细胞数。结果与对照组相比,低糖组、高糖组腹膜透析8周后腹膜透析液超滤量均减少(P值均<0.05);高糖组腹膜透析8周后的尿素氮清除率较对照组明显降低(P<0.05);3组间肌酐清除率的差异无统计学意义(P值均>0.05)。低糖组、高糖组腹膜透析8周后的腹膜引流液蛋白含量均较对照组明湿增加(P值均<0.05)。光学显微镜下,低糖组、高糖组大鼠腹膜组织出现不同程度的问皮细胞损伤、炎性细胞渗出,以高糖组更加明显。电子显微镜下,高糖组腹膜透析8周后紧密连接消失。腹膜透析4周后,3组间ZO-1阳性表达细胞数的差异无统计学意义(P值均>0.05);腹膜透析8周后,高糖组的ZO-1阳性表达细胞数为10.88±0.99,明显低于对照组的12.80±2.10(P<0.05),低糖组与高糖组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论用含葡萄糖的乳酸盐透析液尤其是高糖透析液进行长期的腹膜透析可对腹膜间皮细胞的形态和功能造成损伤,破坏细胞间的紧密连接,抑制ZO-1的表达,导致腹膜透析超滤量减少,尿素氮和肌酐清除率降低,蛋白丢失增加。     

高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞分子机制的研究

目的：探讨高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞的机制。方法：（1）人腹膜间皮细胞分别经含1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖的M199培养基培养48小时后，检测间皮细胞线粒体膜电位（Ψ）、凋亡率、caspase-3活性、bax和bcl-2基因mRNA表达；（2）分别用0．1μmol／L和0．01μmol／L环孢素A（CsA）与4．25％葡萄糖共同作用人腹膜间皮细胞，检测细胞凋亡率和caspase-3活性。结果：（1）随着葡萄糖浓度增加，Ψ丧失的细胞百分率、bax mRNA表达量、caspase-3活性、凋亡率增加（P〈0．05），而bcl-2 mRNA表达量减少；（2）随着葡萄糖浓度增加，bax mRNA的表达量与皿丧失的间皮细胞百分率呈显著正相关（P〈0．01）；bcl-2 mRNA的表达量与Ψ丧失的间皮细胞百分率呈显著负相关（P〈0．01），Ψ丧失的间皮细胞百分率与间皮细胞凋亡率、caspase-3活性呈显著正相关（P〈0．01）：（3）0．1μmol／L CsA组间皮细胞凋亡率和caspase-3活性显著低于高糖对照组（P〈0．05）。结论：（1）高糖可能通过上调bax基因表达和下调bcl-2基因表达，诱导人腹膜间皮细胞线粒体活化、caspase-3活化和凋亡。（2）高糖诱导人腹膜间皮细胞caspase-3活化和凋亡可能依赖于线粒体活化。     

Destruction of gastric cancer cells to mesothelial cells by apoptosis in the early peritoneal metastasis

This study examined the mechanism by which the gastric cancer cells lead to early peritoneal metastasis. HMrSV5 cells, a human peritoneal mesothelial cell line, were co-incubated with the supernatants of gastric cancer cells. Morphological changes of HMrSV5 cells were observed. The cell damage was quantitatively determined by MTT assay. The apoptosis of HMrSV5 cells was observed under transmission electron microscope. Acridine orange/ethidium bromide-stained condensed nuclei was detected by fluorescent microscopy and flow cytometry. The expressions of Bcl-2 and Bax was immunochemically evaluated. The results showed that conspicuous morphological changes of apoptosis were observed in HMrSV5 cells 24 h after treatment with the supernatants of gastric cancer cells. The supematants could induce apoptosis of HMrSV5 cells in a time-dependent manner. The supernatants could up-regulate the expression of Bax and suppress that of Bcl-2 in HMrSV5 cells. These findings demonstrated that gastric cancer cells can induce the apoptosis of HPMCs through supernatants in the early peritoneal metastasis, The abnormal expressions of Bcl-2 and Bax may contribute to the apoptosis. Anti-apoptosis drugs promise to be adjuvant chemotherapeutic agents in the treatment of peritoneal metastasis of gastric cancer.     

癌抗原125检测在腹膜透析中的临床意义

目的 :探讨癌抗原 12 5 (CA12 5 )检测在腹膜透析中的临床意义。方法 :采用 EL ISA方法 ,检测 5 0例连续性不卧床腹膜透析 (CAPD)患者在非感染期与感染期及其治疗前后的透出液 CA12 5水平的变化。 结果 :随着腹膜透析时间的延长 ,非感染期患者透出液 CA12 5水平逐渐下降 ,两者呈负相关 (r=- 0 .6 7,P<0 .0 1)。感染期患者透出液 CA12 5水平明显增高达(6 3.12± 11.72 ) U/ ml,治疗后明显下降为 (39.2 0± 6 .97) U/ ml,差异有显著性 (P<0 .0 1)。结论 :动态观察 CA12 5在 CAPD患者透出液中的变化 ,可作为评价腹膜功能、判断预后的参考指标之一。     

氧化应激在腹膜纤维化大鼠模型腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的:研究氧化应激在腹膜纤维化大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用;观察抗氧化剂普罗布考的干预效应.方法:采用4.25%高糖腹透液以100 mL/kg 腹腔注射法复制腹膜纤维化大鼠模型,实验分为正常对照组、生理盐水对照组、腹膜纤维化模型组和普罗布考干预组.4周后行腹膜平衡试验,处死大鼠,准确测量超滤量,检测腹膜功能;取肠系膜...     

人腹膜间皮细胞的分离培养

目的体外培养的人腹膜间皮细胞（ＨＰＭＣ）是研究腹膜功能的有用模型,我们为此建立了一种改良消化法,以从人大网膜分离腹膜间皮细胞。方法用０．２％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡＮａ２消化人大网膜组织碎片,细胞悬液经１００目筛网滤过后进行培养：瑞士姬姆萨染色观察细胞形态,计算细胞纯度：免疫组化（ＡＢＣ法）鉴定细胞。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状,纯度达９５％以上。细胞表面标志鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞ＣＤ４５抗原阴性,证实分离培养的确是ＨＰＭＣ。结论胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离ＨＰＭＣ的方法。