去甲斑蝥素干扰 HL-60 肿瘤细胞周期及其机制研究

目的 明确去甲斑蝥素 (norcantharidin, NCTD) 对肿瘤细胞周期的影响,进一步阐明 NCTD 的抗肿瘤作用机制。方法 体外培养 HL-60 细胞,NCTD 作用后采用3H-TdR 掺入实验检测 DNA 复制;流式细胞术检测细胞周期进程;Western blotting 检测细胞周期调控蛋白 Cdk1、Cyclin B1、Cdc 25c 表达变化。结果 不同浓度 (16～128 μmol/L) NCTD 作用于 HL-60 细胞 12 h 后,DNA 复制受到抑制,细胞周期出现明显的 S 期累积,并呈剂量依赖性趋势;同时观察到 G2/M 的阻滞,且调控 G2/M 周期进程的调节蛋白 Cdk1、Cyclin B1 及 Cdc 25C 蛋白表达下调。结论 NCTD 可抑制 HL-60 细胞 DNA 复制、下调周期调控蛋白从而干扰肿瘤细胞的周期进程。     

细胞周期激酶CHEK2和p53在恶性肿瘤细胞周期和凋亡中的作用

细胞周期检测点激酶2(cell cycle checkpoint ki-nase 2,CHEK2)是由抑癌基因CHEK2编码的丝氨酸/苏氨酸激酶,CHEK2激酶是DNA双链断裂损伤中重要的信号转导蛋白,参与细胞周期G1、S或G2/M期的阻滞,促进细胞对损伤进行修复。CHEK2基因发生突变后,其编码的激酶会丧失活性,无法修复DNA的损伤,受损伤的DNA不断复制,产生大量异     

S期激酶相关蛋白2与胃癌关系的研究

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率一直居恶性肿瘤的第一位。细胞周期失控与肿瘤发生密切相关。细胞周期的调控是个复杂的过程,主要有两个调控点。一个是G1/S转折点,控制细胞进入S期(G1期检测点);另一个处于G2/M转折点,控制细胞进入M期(G2期检测点)。细胞周期是在细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)共同调节下进行的。泛素蛋白酶体(SCF)途径具有降解细胞周期调控因子作用,而S期激酶相关蛋白2(Skp2)是泛素连接酶复合物的底物识别序列,对细胞周期关卡起调控作用。近几年…     

SCF-Skp2与肿瘤关系的研究

肿瘤的发生与细胞周期的失控密切相关，泛素蛋白酶体(SCF)途径降解细胞周期调控因子、而S期激酶相关蛋白2(Skp2)是泛素连接酶复合物的底物识别序列，对细胞周期G1期关卡起调控作用，在多数恶性肿瘤中表达增高。研究发现SCF—Skp2与肿瘤的进程、治疗、预后均有密切关系。     

对MOLT-4细胞用cyclin E+A/DNA流式细胞术分析 - 细胞周期六分法的建立

目的　越来越多的资料表明肿瘤是一类细胞周期性疾病 ,从而使得细胞周期分析在细胞生物学 ,肿瘤生物学领域显得格外重要。迄今为止 ,有很多方法应用于细胞周期分析中 ,但这些方法因为这样或者那样的缺点已无法适应今天的细胞周期分析。本研究的目的是建立一种新的 ,更为合理的细胞周期分析方法。方法　将cyclinE以及cyclinA的单克隆抗体按一定的比例混合后与固定了的MOLT 4细胞孵育 ,后用流式细胞仪检测。结果　我们发明的CyclinE A/DNA多参数流式细胞术能将细胞分为六个细胞群体 :G0 、早G1、晚G1、S、G2 、M期细胞。而在DNA含量直方图仅能区分三个细胞群体 :G0 /G1、S、G2 /M期细胞。结论　CyclinE A/DNA多参数流式细胞术能同时在同一样本中将细胞分为六个细胞群体 :G0 、早G1、晚G1、S、G2 、M期细胞。其对细胞周期分析明显优于目前采用的细胞周期分析方法 ,并且有明显的生物学基础。     

细胞周期蛋白G1、G2与恶性肿瘤的研究进展

肿瘤的形成是细胞增殖、凋亡和分化异常的结果。基于细胞分子生物学的现代医学研究表明细胞周期与细胞癌变已不是两个独立的事件,肿瘤是一种细胞周期紊乱性疾病。细胞周期蛋白目前分Cyclin A、B、C、D、E、F、G、H、I、K十大类。除Cyclin G以外,细胞周期蛋白多数通过在细胞周期时相性地合成与降解,调节对其依赖的蛋白激酶（CDK）活性,从而调控细胞周期进程。细胞周期人为分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和分裂期（M期）。     

G2／M 期阻滞因素及常用诱导方法

细胞周期检查点（ checkpoint ）是真核细胞为保证染色体数目的完整性及细胞周期正常运转而存在的重要控制机制。虽然正常细胞存在多个周期检查点,但肿瘤细胞普遍存在G1期检查点缺陷,并且肿瘤细胞在DNA损伤后,都有选择性地滞留于G2期的趋势。因此G2／M期检查点成为肿瘤治疗的一个诱人靶标［1］。当把肿瘤细胞长时间阻滞于G2／M期,一方面能够抑制肿瘤的生长,另一方面使肿瘤细胞累积DNA损伤而触发凋亡［2］,起到治疗肿瘤的效果,而采用此种治疗策略的前提就是要用有效的方法把肿瘤细胞阻滞于G2／M期。当前,国内外对G2／M期阻滞的研究主要集中于周期素依赖激酶1（CDK 1）和细胞周期素B（Cyclin B）的信号调控和细胞骨架对有丝分裂的影响,本文就G2／M阻滞的因素及常用的G2／M阻滞方法作一回顾,为发现G2／M期阻滞的新机制和方法奠定基础。     

细胞周期及其调控研究进展

细胞周期是指正常连续分裂的细胞从前一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的连续动态过程，也是多阶段、多因子参与的精确而有序的调控过程，可分为5期：即G0期(Gap0。静息期)、G1期(Gap1，DNA合成前期)、S期(DNA synthesis phase，DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(Mitosis，有丝分裂期)，有两个主要限制点，即G1／S限制点(控制细胞从G1期进入S期，能防止受损的碱基复制，修复染色体中的突变)和G2／M限制点(细胞一分为二的控制点．     

乳腺癌中ATM基因的作用机制与突变种系

目前针对共济失调毛细血管扩张症的致病基因ATM基因的研究不断增多,该基因位于人类染色体的11q22～23,主要参与DNA损伤识别和修复,参与多个复杂的细胞周期关卡G1/S,S和G2/M,通过相应的信号转导途径,介导特定的分子间相互作用激活或抑制相应的细胞因子,起到调节细胞周期的作用。自从Swift等第一次报道了ATM杂合子患乳腺癌的风险增加后,作为乳腺癌危险因子ATM基因受到国内外学者的关注。本文将对ATM基因的作用机制以及乳腺癌中存在的ATM突变种系简要概述。     

过氧化氢诱导同步化HepG2细胞DNA损伤和凋亡的敏感时相研究

目的:探讨过氧化氢(H2O2)诱导HepG2细胞的DNA损伤和凋亡效应在细胞周期不同时相的敏感性.方法:利用胸腺嘧啶核苷(TdR)阻断肝癌HepG2细胞于G1期末后,去除胸苷,培养不同时间,分别得到同步化的G1期、S期和G2/M期细胞,150 μmol/L的H2O2处理12 h,采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)测定细胞的DNA损伤;将各期细胞用200 μmol/L的H2O2处理,采用流式细胞术测定细胞凋亡.同时实验设立未同步化和正常对照组.结果:①分别获得 88.6%的G1期细胞、78.1%的S期细胞、66.8%的G2/M期细胞.② SCGE结果显示,同步化于S期和G2/M期细胞的DNA尾长明显增长,尾部DNA百分比含量和尾矩明显增加,其中S期细胞效应最为显著.③凋亡检测结果显示,同步化各组细胞的凋亡率明显高于未同步化组,以S期最为显著.结论:H2O2诱导HepG2细胞DNA损伤和细胞凋亡在细胞周期的不同时相效应敏感性不同,主要诱导S期细胞的DNA损伤和凋亡.     

MCM7与肿瘤相关因子的研究进展

微小染色体维持蛋白7(MCM7)属于微小染色体维持蛋白家族,参与细胞周期的调控过程,与细胞生成、细胞增殖、DNA复制和延伸及肿瘤形成密切相关。因MCM7在细胞周期的G1期和S期可被检测出,但在G0期和分化、衰老时表达水平逐渐下降甚至不能测出,因此其可作为监测细胞增殖过程的可靠生物标志物,亦可与其他肿瘤相关因子联合检测肿瘤的生成及增长。     

转化生长因子β_1与细胞周期的调控

典型的一个细胞周期包括有严格顺序为4个周期，即G1→S→G2→M。并受到信号传导途径和反馈环路的精确调控，随着细胞生物学理论和分子生物学技术的不断发展。对细胞周期调控机制的研究取得了突破性进展，其中最令人瞩目的是确立了以Cyclins（细胞周期素）－CDKS（细胞周期素依赖性蛋白激酶cyclinsdependentkinases）－CKIs（细胞周期素依赖性蛋白激酶的抑制蛋白cyclinsdependentkinasesinhibitors）为中心的细胞周围网络调控系统。细胞周期的调控模式还揭示了不同期相之间，在若干个关卡（checkpoint）的调控具有特殊的生物学意义［1，…     

PI三步法DNA定量检测技术

DNA定量检测技术是根据细胞周期中不同时相DNA含量的变化来检测细胞周期中G0/G1、S及G2/M各时相的细胞比例,在临床肿瘤诊断和医学科研中都有重要作用.本文介绍了一种简便实用的碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色方法,同时对染色中容易忽视的技术细节提出了一些规范性的建议.     

胃癌中负性细胞周期调节因素研究概况

胃癌在世界上的恶性肿瘤中占第二位 ,是严重危害健康的主要疾病之一。研究胃癌的发生机制具有重要意义。目前 ,对肿瘤发生机制的研究中 ,细胞周期的调控紊乱被认为是很重要的一个方面。细胞周期被分为 G1、S、G2、M四期。其中 ,G1期决定着细胞周期的长度。目前认为细胞周期分别在一个位于 G1 / S交界处和 G2 / M交界处存在着控制点。如果调控的机制出现混乱 ,就有可能出现恶变和肿瘤的发生。现在 ,人们把已经发现的一些因子主要分为 3大类。即 CDK(周期素依赖性激酶 )、cyclin(周期素 )和 CDKI(CDK抑制物 )。其中 ,CDK是整个系统的…     

人VIGILIN参与调控肝癌细胞H19和IGF2印记基因表达的研究

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控.方法 通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、H19、IGF2基因表达.结果 ① HepG2细胞周期约为20 h;其中0～9 h、20～28 h约为S期,9～20 h、28～39 h约为G2/M、G1期,并选定6 h、20 h、43 h、60 h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末; ②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,H19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰.而IGF2的表达也增加但没有明显的周期性.H19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,P<0.05).③用VIGILIN shRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染HepG2细胞48 h后,相对于3个对照组(未转染组, 脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组), 实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,IGF2 mRNA表达增加30.13%,H19 mRNA表达减少12.08%.结论 VIGILIN和H19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控H19、IGF2印记基因的表达.     

p27Kip1与卵巢肿瘤

近年来,越来越多的学者注意到细胞增殖周期的失调在肿瘤的发生中所起的关键作用,特别是G1期的启动和失调与肿瘤的发生、发展密切相关.p27Kip1是新近发现的一种重要的细胞周期依赖性激酶抑制因子,即细胞周期的负性调节因子,具有阻止细胞通过G1/S期转化的"关卡"作用,可能是候选的抑癌基因,对肿瘤细胞的增殖有重要的调控作用.     

放射敏感性不同的鼻咽癌细胞DNA倍体及细胞周期分布

目的　研究不同放射敏感潜能的人鼻咽癌细胞亚克隆株F1、S1的DNA倍体及细胞周期分布,并探讨与放射敏感性异质性的关系。方法　采用细胞培养及裸鼠体内实验,用Feulgen染色法和图像分析方法观察F1、S1细胞及其裸鼠移植瘤的DNA倍体及细胞周期的分布情况。结果　F1、S1细胞及其裸鼠移植瘤均为异倍体细胞或肿瘤。F1细胞及裸鼠移植瘤DNA含量、5C、>5C比S1组高(P<0.01),F1细胞及裸鼠移植瘤3-4C比例低于相应S1组(P<0.01)。F1细胞及其裸鼠移植瘤G2M比例均高于相应S1组,G0G1期低于S1组(P<0.05-0.01),F1细胞的S期比例低于S1细胞(P<0.01)。结论　F1DNA含量较高、倍体分布较广而右移,较多细胞处于对放射线敏感的G2M期,S1DNA含量较低、倍体分布较窄,较多细胞处于G0G1期和S期。DNA倍体及细胞周期分布地不同可能是F1、S1存在放射敏感性差异的原因之一。     

P27、CyclinE在卵巢癌中的研究进展

细胞周期正常运行受细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白激酶抑制因子的共同调节.细胞周期调控机制失常会使细胞增殖失控从而导致癌变.卵巢肿瘤的形成与细胞周期调控关卡G1/S具有密切的联系,CyclinE、P27是此关卡中具有重要作用的蛋白.P27蛋白、周期蛋白CyclinE表达异常不仅与卵巢癌发生发展有关,而且是独立的预后因素.此外,目前已将其作为抗卵巢肿瘤的靶点.     

DNA复制起始的复制压力诱导子代细胞非对称分布的染色体损伤

【立论依据】 细胞对染色体在有丝分裂后子代中分布的精密调控是生物遗传过程中最基本的特征之一。迄今对染色体在有丝分裂过程中的编程机制尚不清楚。本研究着力于研究DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息。 【设计思路】 通过对细胞周期的同步化处理,在DNA复制起始位点诱导复制压力,再免疫荧光染色观察染色体损伤在下一个细胞周期子细胞中的分布。从DNA损伤的角度探讨染色体分布的可能调控机制和生理意义。 【实验内容】 (1)用去血清方法将大部分细胞同步于细胞周期的G₁期,通过流式细胞术进行鉴定;(2)在细胞进入G₁期后给予血清培养,使细胞同步化开始DNA复制,实验组给予APH(DNA聚合酶抑制剂)干预,对照组给予不含APH的血清。同时加入脱氧核苷酸异构物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)参与合成中的DNA,并可作为后续荧光标记DNA复制的起始位置;(3)流式细胞术观察细胞周期进入有丝分裂M期和到达下一个细胞周期G₁期所需的时间;(4)分别进行细胞爬片和滴片固定收样,并标染EdU(DNA复制起始位置)和FANCD2(DNA损伤修复蛋白)。观察各对子细胞中的DNA损伤情况,并进行统计分析。观察统计染色体的断裂频率,判断断裂位点与EdU染色位点的相对位置关系。 【材料】 人HBE上皮细胞;FANCD2抗体(美国Gibco公司);APH;EdU;1640培养基(美国Gibco公司)。 【可行性】 已完成的前期实验:(1)明确了DNA复制起始位点通过抑制DNA聚合酶更容易导致染色体损伤;(2)这些DNA起始位点的损伤在有丝分裂后的两个子代细胞中呈现明显的非随机、非对称分布,表现为一个子代细胞损伤明显增多,而另一个子细胞基本没有或很少出现损伤。这些前期实验结果与预期结果相符。 【创新性】 (1)首次在体细胞水平探讨DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息;(2)探讨DNA复制起始位点在复制压力下与染色体断裂的关系;(3)首次从DNA损伤的角度阐释染色体分布的可能调控机制。     

血管平滑肌细胞不同细胞周期中Mfn2的表达变化

目的 探讨血管平滑肌细胞不同细胞周期中线粒体融合蛋白 2(mitofusin 2,Mfn2)表达水平的变化.方法 通过血清饥饿法、胸腺嘧啶核苷(thymidine)和诺考达唑(nocodazole)干预,使血管平滑肌同步化在不同的细胞周期(G0/G1期、G1/S期、S期、G2/M期);流式细胞仪鉴定细胞周期;Western blot检测Mfn2在不同细胞周期中的表达水平.结果 (1)流式细胞仪鉴定各组DNA含量百分比显示G0/G1期、G1/S期、S期、G2/M期均已同步化,符合本次实验要求.(2)Western blot示:同步化干预后,Mfn2在G0/G1期(静止期)的表达量显著高于G1/S期及S期(增殖期);自然状态下,Mfn2在G0/G1期表达量亦明显高于S期.结论 Mfn2表达量随细胞周期的变化而变化,Mfn2在细胞周期的静止期的表达量明显高于增殖期.