TGF-β及HSP70在rhIL-1β介导的TMJ髁状突软骨炎症损伤中的作用

目的 探讨TGF－β及HSP70在人重组白细胞介素－1（rhIL-1β）介导颞颌关节炎症损伤中的作用。方法 SD大鼠颞下颌关节腔内反复多次注射rhIL-1β，建立颞凳关节炎症损伤模型，利用免疫组织化学检测髁状突软骨炎症损伤过程中TGF－β及HSP70的表达变化。结果 注射后1－3d，实验侧髁状突软骨全层均可见TGF－β阳性软骨细胞，以增殖层阳性表达最明显，7d除髁状突软骨增殖层表达仍较强，前肥厚层TGF－β表达开始减弱，30d髁状突软骨全层TGF－β表达与对照侧相近。HSP70的表达与TGF－β具有相似的特点，注射后1－3d，实验侧髁状突软骨浅层HSP70的表达明显增强，7d后表达逐渐减弱，15d后HSP70表达与对照侧相近。结论 在rhIL-1β介导的髁状突软骨关节炎症损伤中，早期TGF－β与HSP70的表达增强，提示TGF－β及HSP70可能参与了软骨炎症损伤的修复过程。     

rhIL—1β及TGF—β对髁状突软骨细胞增殖影响的研究

目的：探讨rhIL-1β及TGF－β对髁状突软骨细胞增殖的影响。方法：以酶消化法获得兔髁状突软骨细胞。用MTT法及PCNA免疫组化染色检测不同浓度rhIL-1β及TGF－β对体外培养的兔髁状突软骨细胞增殖的影响。结果：MTT检测，rhIL-1β（10，20ng/ml）处理软骨细胞48h后，可明显抑制软骨细胞增殖，经统计学检验，处理3－6d有显著性差异（P＜0．01,t检验）；加入TGF－β（10，20ng/ml)可明显拮抗rhIL-1β对软骨细胞增殖的抑制作用，并且浓度愈高对rhIL-1β的抑制作用愈强。PCNA检测，rhIL-1β处理软骨细胞后PCNA阳性细胞率降低，随rhIL-1β的刺激浓度增加，阳性率明显降低；加入外源性TGF－β可以使PCNA的阳性率提高。结论：rhIL-1β对髁状突软骨细胞增殖具有报制作用，外源性TGF－β对该作用具有明显的拮抗效应。     

rhIL-1α/rhTGF-β1诱导下大鼠髁突软骨细胞PRG4的表达

目的:观察rhTGF-β1对rhIL-1α作用下大鼠髁突软骨细胞蛋白多糖4(PRG4)表达的影响.方法:酶消化法获取髁突软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定.细胞上清液中加入10 ng/ml的rhIL-1α,48 h后加入10 ng/ml的rhTGF-β1.不同时间点应用RT-PCR检测PRG4 mRNA的表达情况,ELISA法检测PRG4蛋白的分泌变化.结果:加入rhIL-1α 24、48、72 h组的PRG4表达量与对照组均有统计学差异(P<0.05),且逐渐降低.48 h组再加入rh TGF-β1 24h后PRG4表达量与对照组无统计学差异(P>0.05),而48 h后与各组均有统计学差异(P<0.05),且最高.结论:rhTGF-β1可以上调髁突软骨细胞PRG4的表达,且可逆转IL-1α的下调作用.     

静张应力与TGF-β_1对大鼠髁突软骨细胞增殖效应调节初步研究

目的：探讨转化生长因子-β(TGF-β1)在静张应力环境下对髁突软骨细胞增殖效应的影响。方法：（1）将传代培养至第4代大鼠下颌髁突软骨细胞在12孔培养板上培养，采用流式细胞仪测定加入不同浓度TGF-β1（0.1、1、10ng/ml）0.6、12、18、24h后，对髁突软骨细胞增殖活性（PI值）的影响。（2）将第4代大鼠下颌髁突软骨细胞增殖活性（PI值）的影响。结果：不同浓度TGF-β1（0.1、1、10ng/ml）在模拟生理环境下以剂量依赖型的方式整体促进了髁突软骨细胞增殖效应，对髁突软骨细胞的增殖活性调节作用主要在12、18h段，增殖峰值在18h左右；在5kPa静张应力联合TGF-β1刺激下培养较TGF-β1的单独效应具有更强的促髁突软骨细胞增殖作用。结论：静张应力联合TGF-β1可以调节髁突软骨细胞的增殖活性。     

偏侧咀嚼对生长发育期大鼠髁突软骨细胞热休克蛋白70表达的影响

目的:初步探讨偏侧咀嚼致颞下颌关节病的致病机理。方法:间断磨除大鼠单侧上下颌磨牙至龈缘,建立生长发育期大鼠偏侧咀嚼模型,采用免疫组织化学方法检测正常对照组及实验组大鼠髁突软骨热休克蛋白70(HSP70)的表达。结果:正常组大鼠髁突软骨各带(表面带、增殖带、肥大带、钙化软骨带)均存在HSP70基础表达;实验组大鼠咀嚼侧髁突软骨细胞HSP70表达增强,而非咀嚼侧髁突软骨细胞HSP70表达无明显改变。结论:偏侧咀嚼可使生长发育期大鼠髁突软骨细胞HSP70表达增强,其致病机理仍有待进一步研究。     

rhIL-1β及TGF-β对髁状突软骨细胞增殖影响的研究

目的 :探讨rhIL 1β及TGF β对髁状突软骨细胞增殖的影响。 方法 :以酶消化法获得兔髁状突软骨细胞。用MTT法及PCNA免疫组化染色检测不同浓度rhIL 1β及TGF β对体外培养的兔髁状突软骨细胞增殖的影响。结果 :MTT检测 ,rhIL 1β( 10、2 0ng/ml)处理软骨细胞 4 8h后 ,可明显抑制软骨细胞增殖 ,经统计学检验 ,处理 3～ 6d有显著性差异 (P <0 .0 1,t检验 ) ;加入TGF β( 10、2 0ng/ml)可明显拮抗rhIL 1β对软骨细胞增殖的抑制作用 ,并且浓度愈高对rhIL 1β的抑制作用愈强。PCNA检测 ,rhIL 1β处理软骨细胞后PCNA阳性细胞率降低 ,随rhIL 1β的刺激浓度增加 ,阳性率明显降低 ;加入外源性TGF β可以使PCNA的阳性率提高。 结论 :rhIL 1β对髁状突软骨细胞增殖具有抑制作用 ,外源性TGF β对该作用具有明显的拮抗效应     

RUNX蛋白在不同发育时期小鼠髁状突中的表达

目的：探索小鼠髁状突形态发育及此过程中RUNX蛋白的表达变化及意义。方法：取胚胎14．5d（E14．5）至出生后7．5d（P7．5）的小鼠下颌骨,制备髁突矢状位切片,苏木素一伊红（HE）染色观察。免疫组化方法检测RUNX蛋白表达分布。结果：E14．5开始,髁突间充质细胞聚集,而后逐渐分化出完整的软骨细胞分层,髁突逐渐由半圆变扁平。免疫组化示RUNXl、2阳性信号主要位于增殖层、前软骨细胞层及部分肥大层细胞,RUNX3阳性信号主要位于前软骨细胞层及肥大层。髁突前后部,RUNXl、2在前软骨细胞层的信号强度较肥大层更高。RUNX整体的表达呈现双峰曲线。结论：髁突前后部成熟较晚,更易发生改建。RUNXl、2协同作用于软骨细胞分化早期,RUNX3调节作用于软骨细胞成熟期。     

TNF-α刺激髁突软骨细胞产生白细胞介素-34的研究

目的通过观察TNF-α对髁突软骨细胞分泌白细胞介素-34(IL-34)及表达IL-34 mRNA基因的影响,探讨IL-34在颞下颌关节紊乱病中的致病机制。方法取第三代髁突软骨细胞,培养过程于培养液中加入不同浓度(0、1、10、20、50 ng/m L)的TNF-α培养24 h以及同一浓度(10 ng/m L)TNF-α分别培养1、3、6、10、24 h后,收集培养上清液及细胞,分别用ELISA和RT-PCR方法测定IL-34浓度以及IL-34 mRNA的表达情况。结果 1实验组和对照组髁突软骨细胞上清液中均能检测到IL-34。2TNF-α刺激髁突软骨细胞IL-34mRNA基因表达,并呈正相关关系。结论 TNF-α能刺激髁突软骨细胞产生IL-34。     

不同静压力对大鼠髁突软骨细胞生物学特性的影响

目的探讨不同静压力对髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法对培养到第3代的新生SD大鼠髁突软骨细胞加载12、24、36 kPa的静压力,1 h后立即收集样本,同时设不加载力的对照组,用免疫组织化学技术对样本细胞进行染色,用病理图像分析仪分析细胞胞浆中胶原表达强度的变化。结果对于对照组、12、24 kPa组,随着压力的增加,髁突软骨细胞表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及蛋白多糖（ PG）增加。与24 kPa组相比,36 kPa组髁突软骨细胞表达Ⅰ型胶原及PG减弱,而Ⅱ、Ⅲ型胶原表达则增加。结论适当的压力刺激可能会使髁突软骨细胞分化更加成熟,但是过大的应力则可能导致髁突软骨细胞生物学特性减弱,从而表现出去分化的某些特征。     

体外周期性单轴压应力作用下大鼠髁突软骨细胞肌动蛋白和中间丝波形蛋白的早期变化研究

目的探讨体外周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞细胞骨架蛋白肌动蛋白（Actin）和中间丝波形蛋白（Vimentin）的早期影响。方法利用四点弯曲加力装置对第3代大鼠髁突软骨细胞进行周期性单轴压应力加载,力值为4 000 μstrain,时间为15、30、60、120、240 min。同时设有不加力的对照组。采用免疫荧光技术和Westernblot免疫印迹技术研究大鼠髁突软骨细胞在周期性单轴压应力作用下Actin和Vimentin的早期动态变化。结果在4 000 μstrain压应力作用下,细胞骨架荧光逐渐下调,60 min表达最低,但120 min后细胞骨架的荧光表达逐渐恢复。Vimentin蛋白表达水平在30 min开始下降,Actin蛋白表达在60 min明显下调,几乎消失;但120 min后两种蛋白表达水平开始迅速回升。结论4 000 μstrain压应力刺激对大鼠髁突软骨细胞Actin、Vimentin蛋白的表达存在时间效应性,表现为先下调后反馈增强的趋势,提示细胞对力学刺激的反应存在“自我调控保护”的机制。     

体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的分离、体外培养以及差异蛋白质组学观察

目的：观察体内压应力刺激下大鼠髁突软骨细胞的生物学活性和蛋白质表达谱。方法：对大鼠进行III类矫形力应力加载2周,观察髁状突大体形态和组织形态学;体外培养实验鼠和对照鼠软骨细胞,计数细胞收获数和细胞存活率,检测总蛋白质组学水平上差异。结果：压力刺激后的大鼠髁突软骨明显变薄,表面无光泽,缺乏弹性,重量降低（P＜0．01）;力学刺激后髁突软骨细胞收获率和存活率均下降（P＜0．01）,形态更加狭长;蛋白质组学结果主要为应激蛋白上调,信号转导蛋白活化,细胞骨架蛋白和细胞增殖代谢相关蛋白的下降。结论：经体内力学加载后,体外分离培养的关节软骨细胞形态、生物学活性以及在蛋白质水平均发生了明显的变化。     

IL一1及L-NMMA对兔髁状突软骨细胞NO生成和iNOS表达的影响

目的：观察白细胞介素-1(IL-1)和L-单甲基精氨酸（L-NMMA）对兔髁状突软骨细胞一氧化氮（NO）合成和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因表达的影响。方法：用硝酸还原酶法和RT-PCR反应分别检测软骨细胞培养上清液中NO浓度细胞内iNOSmRNA表达的变化。结果：单独使用IL-1，软骨细胞培养液中NO水平和iNOS表达水平显著升高，配伍加入L-NMMA能有效降低由于IL-1刺激引起的NO水平升高，但不能降低iNOS表达的升高幅度。结论：IL-1能显著增加体外培养的兔髁状突软骨细胞iNOS的表达而促进NO的生成，而L-NMMA对这种效应有明显抑制作用。     

大鼠髁突软骨细胞发育中差异蛋白的表达变化

目的：初步建立大鼠髁突软骨细胞发育过程中蛋白表达差异谱,寻找并鉴定其差异表达蛋白。方法：体外培养出生后1、7、14、28d共4组SD大鼠髁突软骨细胞,应用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定软骨细胞。提取各组软骨细胞总蛋白．采用iTRAQ标记定量蛋白．2Dnano—HPLC和基质辅助激光解吸／电离串联飞行时间质谱（MALDI—TOF—TOF）技术动态、定量观察出生后大鼠髁突软骨细胞发育过程中差异蛋白的表达及其量变情况,所得数据用MASCOT软件处理,筛选样本之间有意义的差异蛋白,运用GO法进行蛋白分类。结果：共鉴定500种差异蛋白．其中137种具有可信度表达．包括15种高可信度表达,相对分子量在7806．24～608459．2．主要功能为参与各类代谢及发育过程、细胞骨架结构、信号转导,响应各类刺激、免疫应答以及细胞间联系及运输等。结论：本研究获得了目前较为全面的大鼠髁突软骨细胞发育中差异蛋白表达谱．并运用质谱技术成功鉴定了差异表达蛋白．为进一步研究髁突软骨细胞内蛋白功能及在颞下颌关节疾病中的改变与作用奠定基础。     

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目的研究发育期SD大鼠髁状突颈部骨折对下颌髁状突软骨细胞中上游刺激因子1(USF1)表达的影响。方法本研究于2011年7—9月在昆明医科大学口腔医学院研究所完成。选择4周龄雄性SD大鼠12只,其中6只大鼠用于制作下颌单侧髁状突颈部骨折动物模型,6只大鼠为对照。分别在术后1、3、5周时处死大鼠,取出骨折侧、骨折对侧以及空白对照的髁状突软骨。采用免疫组织化学方法检测髁状突软骨细胞中USF1表达情况。结果术后1周,骨折对侧空白对照组与骨折侧的USF1表达有显著性差异(P<0.01);术后3周,空白对照组与骨折侧USF1表达有显著性差异(P<0.01)。骨折侧术后3周、5周与术后1周USF1表达有显著性差异(P<0.01)。结论单侧髁状突颈部骨折引起应力变化,使患侧髁状突软骨细胞中USF1表达异常,进而影响髁状突的生长发育。     

Ihh-PTHrP信号轴介导髁突软骨细胞对压力微环境改变的调控研究

目的 探究Ihh-PTHrP负反馈信号通路与静压力下髁突软骨细胞生物学响应的关系。方法 体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,100 kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3、4 h的加压处理;采用Western印迹的方法比较分析髁突软骨细胞COL2A1、Ihh和PTHrP的蛋白表达变化;通过RT-qPCR检测分析静压力对Ihh和PTHrP基因水平表达的影响;选取0 h和3 h组,使用扫描电子显微镜扫描分析静压力对髁突软骨细胞形态的影响;采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Western印迹实验发现：压力加载3 h后,COL2A1出现明显高表达;Ihh蛋白表达在0～2 h内逐渐升高,在2～4 h内却逐渐降低;PTHrP在0～2 h内蛋白表达逐渐升高,并在2～4 h内维持着一个较高水平的表达。RT-qPCR检测发现Ihh在压力加载1 h时出现明显高表达,而PTHrP则在2 h时出现明显高表达。100 kPa静压力加载3 h后,髁突软骨细胞突起增多、变长。结论 兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力;适宜的静压力可以提高髁突软骨细胞的成软骨能力;Ihh-PTHrP负反馈信号通路参与髁突软骨细胞对压力微环境改变的适应性改建过程。     

IGF-1信号通路相关蛋白在大鼠髁突软骨细胞增殖分化中的表达

目的:研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号转导通路在大鼠髁突软骨细胞增殖分化调控过程中相关基因的表达。方法:体外单层培养并鉴定出生后1、7、14、28 d共4组SD大鼠髁突软骨细胞。免疫组织化学方法检测细胞内IGF-1表达情况,Real-time PCR及Western印迹法检测细胞内IGF-1R、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达。饥饿培养24 h后,实验组加入质量浓度为100 ng/mL的重组大鼠IGF-1细胞因子(rrIGF-1)继续培养24、48 h,CCK-8检测细胞增殖情况,Real-time PCR技术检测各组髁突软骨细胞内IGF-1R、IGF-2R、Raf1、GSK-3、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、Bax、integrin、TGF-βmRNA表达情况;对照组培养液不加rrIGF-1。结果:各鼠龄组SD大鼠髁突软骨细胞内IGF-1表达均阳性,IGF-1R mRNA及蛋白表达相对平稳,Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达逐渐增强,在出生14 d后表达下降(P<0.05)。加入100 ng/mL rrIGF-1后,髁突软骨细胞增殖速度显著增加,细胞凋亡减少,Real-time PCR结果显示实验组IGF-1R、GSK-3、Bax、integrin mRNA表达整体呈下降趋势;IGF-2R、Raf1、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、TGF-βmRNA表达水平总体呈上调趋势,差异有统计学意义。结论 :IGF-1介导的信号转导途径参与了髁突软骨细胞的增殖、分化以及软骨形成早期的调控,并可能与integrin、TGF-β等其他蛋白相互作用,共同参与髁突发育过程。     

雌激素浓度对大鼠髁突软骨细胞中雌激素受体表达的影响

目的:探索有利于原代髁突软骨细胞生长、促进Ⅱ型胶原蛋白(collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)表达的有效雌激素浓度.方法:提取4周龄雌性SD大鼠髁突软骨细胞,进行髁突软骨细胞鉴定,并测定细胞生长曲线.应用不同浓度雌激素对软骨细胞进行处理后,CCK-8试剂盒对软骨细胞增殖进行测定,实时定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)技术测定软骨细胞雌激素受体(ertrogen receptor,ER)α、β和Col ⅡmRNA和蛋白的表达量.结果:与对照组相比,10-9mol/L的雌激素对软骨细胞增殖和ERα表达的促进作用优于其他组(P＜0.05);10-7mol/L的雌激素对Col Ⅱ的促表达作用优于其他组(P＜0.05);而雌激素浓度的变化会对ERβ的表达产生抑制作用,10-10mol/L较其他组为显著(P＜0.05).结论:雌激素在一定浓度下可促进髁突软骨细胞增殖及ERα和Col Ⅱ表达,抑制ERβ的表达.     

周期性单轴压应力下大鼠髁突软骨细胞早期应答机制的蛋白质组学初探

目的探讨体外周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞蛋白质表达的早期影响，为阐明髁突软骨细胞的力学应答反应机制奠定基础。方法对第三代大鼠髁突软骨细胞进行周期性单轴压应力加载，分为2000μstrain加力组和对照组、4000μstrain加力组和对照组，加力时间为60min；采用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定分析软骨细胞蛋白质表达的变化。结果与对照组相比，2000μstrain加力组细胞蛋白质表达变化无统计学意义（P〉0．05）；4000μstrain加力组细胞蛋白质表达改变，3个新蛋白点出现，5个蛋白点消失，22个蛋白点表达下调，7个蛋白点表达升高（P〈0．05）。质谱鉴定其中8个差异蛋白点分别为细胞骨架相关蛋白（丙种肌动蛋白和中间丝波形蛋白）、糖代谢相关蛋白（烯醇酶α和应激70糖调控蛋白）、信号传导相关蛋白（Raf激酶抑制蛋白），以及几种蛋白复合物。结论在体外4000μstrain周期性单轴压应力刺激下，大鼠髁突软骨细胞的蛋白表达谱明显改变，这些差异蛋白可能参与早期的力学应答反应。     

雌二醇浓度对大鼠髁突软骨细胞中雌激素受体mRNA表达的影响

目的：探讨雌二醇(estradiol,E2)对体外培养的髁突软骨细胞雌激素受体(estrogen recerptor,ER)基因表达的影响。方法：体外培养大鼠髁突软骨细胞,分别加入浓度为10-12、10-9、10-6、10-3 mmol/L的17β E2 24 h,实时定量PCR法检测所培养的髁突软骨细胞 ERα、ERβmRNA的表达。采用SPSS10.0软件包对结果进行统计学分析。结果：ERα和ERβ在体外培养的髁突软骨细胞中均有表达,17β E2能够上调ERα的基因表达,同时下调ERβ表达。在10-9 mmol/L的17β E2作用下,上调ERα基因表达最为明显。结论：E2浓度的改变可上调ERα的表达并下调ERβ的表达,在生理范围的雌激素浓度下,E2上调ERα基因表达的作用最为明显。     

功能矫形前伸大鼠下颌后髁突软骨β转化生长因子Ⅰ型受体(TβR-Ⅰ)表达变化的研究

目的：了解青春期ＳＤ大鼠髁突软骨β转化生长因子Ⅰ型受体（ＴβＲ－Ⅰ）在功能矫形前伸下颌后分布的变化，探讨ＴβＲ－Ⅰ与ＴＧＦ－β１表达的关系。方法：实验组戴模拟临床功能矫治器，引导大鼠下颌前伸，并在实验３ｄ，１，２，３和４周各处死５只大鼠，取下髁突，应用免疫组织化学方法探测β转化生长因子Ⅰ型受体（ＴβＲ－Ⅰ）在髁突中的含量及分布。结果：髁突各层软骨细胞均有Ⅰ型受体（ＴβＲ－Ⅰ）的分布，以成熟层阳性强度最高；功能矫形前伸下颌后，髁突软骨细胞各层ＴβＲ－Ⅰ的表达均增强。结论：机械刺激调节了ＴＧＦ－β的功能，从而促进骨的生长代谢