羊膜培养液抑制角膜新生血管的实验研究

目的　研究羊膜培养液对小鼠角膜新生血管的抑制作用及机制。方法　应用cornealmicropocket方法 ,将含 10 0ng碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和 12 %hydronpolymer的缓释颗粒植入角膜层间 ,制备小鼠角膜新生血管模型。实验分对照组、羊膜组和去上皮羊膜组 ,每组 10只眼 ,收集各组培养液于模型制作当日起 ,每日滴眼 4次至术后 7d摄片观测角膜新生血管长入情况并处死动物。对脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)进行体外培养 ,并应用Boyden小房技术和荧光结合(CyQUANT)实验分别检测羊膜培养液对HUVEC细胞迁移和细胞增殖的影响。利用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组培养液中金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP1)和 2 (TIMP2 )的含量。结果　羊膜培养液明显抑制由bFGF诱发的小鼠角膜新生血管的形成 ,对照组、羊膜组和去上皮羊膜组角膜新生血管面积分别是 (2 4 8± 0 76 )mm2 、(0 6 4± 0 5 2 )mm2 和 (1 96± 0 6 5 )mm2 。羊膜培养液明显抑制血管内皮细胞的迁移和增殖 ,而对照组和去上皮羊膜组对HUVEC细胞迁移无作用。羊膜培养液中TIMP2水平明显增高 ,而TIMP1的含量无变化。结论　羊膜培养液中TIMP1的含量未增加。而羊膜上皮产生或释放大量的TIMP2 ,抑制血管内皮细胞的迁移和增殖 ,其可能是羊膜培养液抑制角膜新生血管的     

羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达

目的:探讨羊膜培养液对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子(vascula rendothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:刮除并收集新鲜兔角膜上皮细胞,传代培养接种于35mm培养皿及自制的羊膜培养皿上。实验分为4组,Ⅰ组(对照组):无血清的DMEM培养液,Ⅱ组:去上皮的羊膜培养液,Ⅲ组:未去上皮的羊膜培养液,Ⅳ组:将细胞直接接种于无上皮羊膜。作用48h后用Trizol法提取各组样本的总RNA,进行RT-PCR一步法反应检测各组VEGF mRNA表达并与β-actin比较。结果:正常角膜上皮细胞中有VEGF基因表达,在Ⅲ,Ⅳ组中表达受到明显抑制(P<0.01,n=5)。结论:羊膜培养液明显抑制VEGF mRNA在角膜上皮细胞中的表达。     

体外角膜上皮细胞凋亡的研究

为观察离体角膜上皮细胞经传代培养后细胞死亡的规律及确定其性质。本文应用流式细胞仪 ( FACStarplus)检测凋亡细胞的亚 2倍体 DNA以及细胞凋亡的形态学观察 ,对体外培养的每一代兔角膜缘上皮细胞的凋亡情况进行了观察及分析。结果显示 :角膜缘原代上皮细胞被检测出 7.0 0± 2 .2 3 %的凋亡细胞 ;从第 6代开始 ,角膜上皮细胞凋亡数目显著升高 ( P<0 .0 1) ;之后细胞凋亡数目急剧增加 ,第 8～ 9代后细胞出现集体“自杀”现象。透射电镜观察到这些细胞出现了核浓缩、胞膜发泡、凋亡小体等典型细胞凋亡的形态学改变。结论 :离体角膜缘上皮细胞因外部生长环境的改变 ,在培养到第 6代时出现了细胞凋亡现象。     

人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜新生血管的实验研究

背景 角膜新生血管(CNV)是一种常见的眼部病变,研究其发病机制及其抑制剂是眼科研究的热点和难点. 目的 研究人羊膜上皮细胞(AECs)培养液对CNV的抑制作用及机制. 方法 消化法培养及鉴定人AECs,并收集培养液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测色素上皮衍生因子(PEDF)和白细胞介素1受体拮抗剂( IL-1Ra)在培养液中的质量浓度.兔角膜上皮细胞分离后分别用无血清DMEM培养基、人AECs培养液、混合培养液(DMEM+人AECs培养液)培养48 h,采用实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测不同培养液培养的角膜上皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养人脐静脉血管内皮细胞(UVECs),并分别加入无血清DMEM、混合培养液和人AECs培养液,划痕法和细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组培养液对人UVECs迁移的影响.分别在上述3种培养基中加入终质量浓度为50 μg/L的bFGF,CCK8法检测各培养液中人UVECs的增牛情况.在原子力显微镜(AFM)下观察人AECs培养液对人UVECs超微结构的影响. 结果 人羊膜培养和传代细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性证实为人AECs.与无血清DMEM组相比,人AECs培养液组的兔角膜上皮细胞VEGF mRNA(1.00±0.22 vs.2.98±0.46)及bFGF mRNA( 1.00±0.36vs.2.55±0.48)的表达均明显下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.002);培养后不同时间人AECs培养液组人UVECs的增生吸光度(A)值明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),人UVECs的迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05).AFM观察见人AECs培养液组的血管内皮细胞膜粗糙、表面颗粒紊乱,细胞间连接及伪足减少.ELISA法检测人AECs培养液中PEDF的质量浓度为(70.41 ±0.68) μg/L,IL-1Ra的质量浓度为(153.56±0.36) ng/L,无血清DMEM组中未检出.结论 人AECs培养液可抑制角膜上皮VEGF及bFGF的表达,抑制血管内皮细胞的增生和迁移,细胞结构和功能改变,这可能是其抑制CNV的机制之一.     

羊膜对免角膜上皮细胞影响的实验研究

目的：观察羊膜对在其上皮面培养的免角膜上皮细胞增生的影响。方法：将免角膜上皮细胞原代培养后,接种于羊膜上皮面,并用ＭＴＴ自动比色法分别于接种后１、３、５、７天检测羊膜对免角膜上皮细胞增生的影响。结果：接种后１,３,５天,羊膜对免角以细胞有显示的促增生作用（Ｐ〈０．０５）。结论：羊膜有保进免角膜上皮细胞增生的作用,可用做角膜表结构重建的理想材料。     

人羊膜上皮细胞混悬液治疗兔急性角膜碱烧伤的实验研究

目的:结合体外细胞实验和在体动物实验研究羊膜上皮细胞(amnion epithelial cell,AEC)混悬液对兔角膜上皮细胞(cornea epithelial cell,CEC)生物学行为的影响及对急性角膜碱烧伤的治疗作用.方法:细胞实验:实验组将AEC及CEC于Transwell小室中培养,上室为AEC混悬液,下室接种CEC,对照组上室仅为培养基,于不同时间点行CCK-8法检测CEC的增殖活性;免疫细胞化学法检测PCNA表达;细胞划痕法观察细胞迁移能力.动物实验:采用改良的兔角膜碱烧伤模型制备方法:将10 mm直径环钻轻置于角膜中央,向环钻中央加入NaOH溶液,1 min后去环钻迅速冲洗兔眼,随机分三组(空白对照、AEC混悬液滴眼液治疗组、结膜下注射治疗组),于术后每周行裂隙灯显微镜及荧光素钠染色观察角膜情况.第28 d摘除眼球并固定行HE染色,免疫组织化学法检测角膜VEGF、mcp-1的表达.结果:CCK-8法示AEC混悬液作用后的CEC增殖活性增强(P<0.05);免疫细胞化学法显示PCNA阳性表达增强(P<0.05);划痕试验示AEC干预后CEC迁移加快.动物实验表明,滴眼液组和结膜下注射组的角膜恢复时间明显缩短,CNV面积均少于对照组(P<0.05),滴眼液组和结膜下注射组之间差异无统计学意义(P>0.05);HE染色示治疗组角膜组织炎症细胞浸润更少,组织排列更规则;免疫组化显示组织中VEGF、mcp-1表达更低(P<0.05),而滴眼液组和结膜下注射组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论:AEC混悬液促进CEC增殖和迁移,影响CEC生物学行为变化.经AEC混悬液点眼及结膜下注射治疗兔眼碱烧伤后角膜修复加快,且两种方法抑制炎症反应及CNV形成,有望成为治疗急性角膜碱烧伤的新方法.     

以羊膜为底物培养鸡角膜缘上皮细胞的实验研究

目的为眼表面重建术提供良好的移植材料。方法用胰酶及EDTA消化法去除羊膜上皮将消化、离心获得的鸡角膜缘上皮细胞调成1×107/mlDMEM悬液,接种在6孔培养板底的羊膜基底膜面,放人37℃,5％CO2孵箱培养。结果48h羊膜上培养细胞形成单层,较培养板上培养的同种细胞小,细胞表面的微绒毛及侧面足状突丰富,立体感明显。结论以羊膜基底膜为底物培养的鸡角膜缘上皮细胞可以着床生长并形成完整的单层上皮,为眼表重建使用羊膜及基底膜面培养的角膜上皮细胞提供了实验材料。同时表明羊膜在体外也可以促进鸡角膜缘上皮细胞生长。     

丝裂霉素C诱导PRK后角膜基质细胞凋亡的实验研究

目的 探讨丝裂霉素C(MMC)对准分子激光角膜切削术(PRK)后角膜基质细胞凋亡的影响.方法 30只兔随机取1只眼行PRK并术中使用0.02%MMC为PRK MMC组,另1只眼仅行PRK设为PRK组,2只兔设为正常对照组.观察角膜上皮下混浊(haze)程度;采用苏木精-伊红染色法、TUNEL法和免疫组织化学法观察角膜细胞.结果 术后1周,1、2、3个月角膜haze差异均有统计学意义(P＜0.05).术后1周,1、2、3个月PRK MMC组与PRK组TUNEL染色、α-SMA阳性细胞数相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 术中眼局部应用0.02%MMC溶液可促进活化的角膜基质细胞凋亡,减轻PRK术后haze.     

新鲜羊膜、冻干羊膜、羊膜细胞外基质的形态研究

目的：从组织形态学角度观察、比较新鲜羊膜(Fresh amniotic membrane，FSAM)、冻干羊膜(Frozen amniotic membrane，FZAM)、羊膜细胞外基质(Amniotic extracellular matrix,AECM)的结构特点。方法：采用目前国际公认的羊膜制备与保存方法，制备FSAM、FZAM、AECM，分别经HE、PAS组织染色、透射电子显微镜、扫描电子显微镜检查，观察并比较它们的形态与结构特点。结果：FSAM、FZAM在光镜和电镜下均与正常球结膜组织结构相近。两者形态上的主要差别表现在上皮细胞的结构变化上。而AECM结构较为独特，无细胞结构，其主要成分为胶原纤维、网状纤维和基质。结论：从组织结构特点分析，FSAM、FZAM、AECM是目前较为理想的结膜替代材料并可有效地用于角、结膜表面重建；同时，AECM作为一种极为特殊的细胞外基质，有重要的研究与应用价值。     

紫外线致大鼠角膜上皮细胞凋亡的研究

目的：探讨紫外线对角膜的损伤机制中是否有细胞亡的存在。方法：用400μw/cm^2的紫外线照射大鼠角膜,取下后迅速固定,作石蜡切片,然后用原位末端标记技术（ISEL）检测凋亡的细胞。结果：照射5min组与对照组无明显差异（P＞0．05）,而照射15min组与对照组及照射5min组均有明显差异（P＜0．001）。结论：紫外线照射大鼠角膜,经过一定的潜伏期后,可以诱导其上皮细胞凋亡。     

羊膜匀浆上清液对兔角膜上皮细胞增殖的影响

目的　为角膜上皮损伤修复寻找新的有效方法。方法　运用MTT比色法 ,观察羊膜匀浆上清液在不同浓度及不同时相点 ,对兔角膜上皮细胞增殖的影响。运用活细胞计数方法检测兔角膜上皮细胞在不同羊膜匀浆上清液及不同时相点时的细胞活力。结果　羊膜匀浆上清液对兔角膜上皮细胞生长有促进作用 ,并呈剂量依赖性。结论　羊膜匀浆上清液可能能够应用于临床 ,促角膜上皮细胞修复。     

羊膜对角膜成纤维细胞CTGF表达及凋亡的影响

目的观察羊膜对在其基质面生长的角膜成纤维细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达以及凋亡的影响。方法将传代的家兔角膜成纤维细胞接种于羊膜基质面，培养5d后，用RT-PCR检测角膜成纤维细胞CTGF mRNA表达的变化；用流式细胞仪观察羊膜对IL-1诱导的角膜成纤维细胞凋亡的影响。结果在羊膜基质面培养的角膜成纤维细胞，其CTGF／GAPDH像素比值较对照组低，与对照组比较有明显统计学差异（P〈0．05）；羊膜能降低IL-1诱导的角膜成纤维细胞凋亡率，与对照组比较有明显统计学差异（P〈0．01）。结论羊膜不仅抑制体外培养的角膜成纤维细胞CTGF mRNA的表达，而且能抑制角膜成纤维细胞的凋亡，可能部分解释羊膜减轻角膜基质损伤修复反应和抗眼表瘢痕形成的机制。     

Efficacy of rhNGF-loaded amniotic membrane transplantation for rabbit corneal epithelial and nerve regeneration

AIM: To evaluate the efficacy of recombinant human nerve growth factor-loaded amniotic membrane (rhNGF-AM) on corneal epithelial and nerve regeneration in rabbit model. METHODS: Freshly prepared human amniotic membrane (AM) were immersed into PBS buffer containing 100 or 500 μg/mL rhNGF for 15, 30, and 60min at 4℃. The in vitro release kinetics of rhNGF was measured with ELISA. For in vivo evaluation, the AM were immersed with 500 μg/mL rhNGF for 30min. Fifty-seven rabbits were selected to establish corneal epithelial defect model. In addition to the 19 rabbits in control group, 38 rabbits received AM transplantation with or without rhNGF after the removal of central epithelium. Corneal epithelial defect area, sub-epithelial nerve fiber density, corneal sensitivity, rhNGF contents in resident AM and corneas were measured after the surgery. RESULTS: rhNGF was sustained release from the AM within 14d in vitro, with the positive correlation with initial immersion concentration. The immersion of AM in 500 μg/mL rhNGF for 30min achieved the most stable release within 14d. After transplantation in rabbit cornea, a high concentration of rhNGF in resident rhNGF-AM and cornea was maintained within 8d. Corneal epithelial healing, nerve fiber regeneration and the recovery of corneal sensitivity were significantly accelerated after the rhNGF-AM transplantation when compared to simple AM transplantation (all P<0.05). CONCLUSION: Simple immersion of AM achieves the sustained release of rhNGF, and promotes corneal epithelial wound healing and nerve regeneration, as well as the recovery of corneal sensitivity in rabbit.     

羊膜移植术治疗持续性角膜上皮缺损的疗效分析

目的:探讨羊膜移植治疗持续性角膜上皮缺损的临床效果。方法:15例因各种原因引起的角膜上皮缺损进行了羊膜移植术,术后经裂隙灯及荧光素染色,随访18mo。结果:患者15例进行了羊膜移植术后,3～4wk角膜上皮缺损愈合,角膜上皮表面光整,10例视力不同程度上升。结论:羊膜移植术是治疗角膜上皮缺损的一种有效方法。     

人羊膜匀浆上清液对兔角膜上皮细胞中bFGF表达的影响

目的:观察不同浓度人羊膜匀浆上清液对体外培养的兔角膜上皮细胞碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)表达的影响,探讨人羊膜匀浆上清液在促进角膜上皮损伤修复中的作用。方法:将兔角膜上皮细胞离体培养并传代,然后分组。实验组分别在含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液中分别加入终浓度为40,80,160μg/mL 的人羊膜匀浆上清液,对照组仅用100mL/L胎牛血清的DMEM培养液。分别在培养24,48和96h后,采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法观察人羊膜匀浆上清液对兔角膜上皮细胞增殖的影响。同时,采用RT-PCR技术检测三个不同等级浓度对兔角膜上皮细胞bFGF-mRNA表达的影响。结果:培养24h后,与对照组（0.087±0.013）比较,加入终浓度为40,80,160μg/mL人羊膜匀浆上清液的实验组角膜上皮细胞增殖数量（分别为0.185±0.010,0.318±0015,0.501±0.014）明显增加,差异具有显著性(P<0.05);同时,随着作用时间的延长,差异愈加明显;加入40μg/mL和80μg/mL浓度羊膜匀浆上清液组兔角膜的bFGF-mRNA（分别为0.750±0.007,0.785±0.006）和空白对照组（0.708±0.013）比较,差异无显著性意义（P>0.05）,但160μg/mL浓度羊膜匀浆上清液组（1.013±0.120）与其它两组及对照组（0.708±0.013）比较,差异均具有显著性（P<0.05）。结论:人羊膜匀浆上清液具有促进兔角膜上皮细胞增殖的作用,并随着人羊膜匀浆上清液所含蛋白浓度的增加,其促进作用增强;人羊膜匀浆上清液具有促进体外培养的兔角膜上皮细胞bFGF-mRNA表达的作用,但与羊膜匀浆上清液的浓度有关。     

人羊膜作为载体体外培养兔角膜上皮细胞移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的观察培养生长于人羊膜的兔角膜上皮细胞使其扩增并移植治疗角膜碱烧伤的效果。为培养角膜上皮细胞移植技术及应用于临床实践提供最佳的理论和实验依据。方法新西兰白兔30只（30眼）,随机分为3组（n=10）,右眼制成碱烧伤模型。A组：角膜上皮细胞羊膜移植组;B组单纯羊膜移植组;C组为对照组（碱烧伤后不作任何移植）。术后观察角膜透明度、角膜新生血管及上皮修复情况,裂隙灯显微镜照相记录。3组均于术后1周、2周、1个月及3个月时各取1眼角膜标本行病理组织检查。结果A组除1眼移植片在第7天脱落外,所有移植片在术后3d水肿消退,角膜逐渐透明。B组移植片持续水肿,眼前段炎性反应稍重,但较碱烧伤对照组轻。C组角结膜高度水肿浑浊,烧伤后观察3个月未发现角膜恢复透明现象。病理组织检查显示：A组角膜及周边上皮细胞为多层结构,角膜新生血管消失,基质的炎性细胞浸润减退;B组覆盖上皮细胞表现为完整上皮细胞型,C组角膜浑浊,新生血管及肉芽组织形成。结论人羊膜作载体体外培养兔角膜上皮细胞移植重建角膜基底膜和角膜上皮结构治疗兔碱烧伤后的角结膜损伤是一种合理有效的方法。     

新鲜羊膜移植治疗角膜溃疡的临床分析

目的探讨新鲜羊膜移植在治疗角膜溃疡中的作用。方法真菌性角膜溃疡5例（5眼），细菌性角膜溃疡9例（9眼），病毒性角膜溃疡4例（4眼），蚕蚀性角膜溃疡2例（2眼），化学烧伤性角膜溃疡6例（8眼），热烫伤性角膜溃疡7例（10眼）。均行新鲜羊膜移植术，相应药物治疗。结果随访6～18月。感染性角膜溃疡17眼愈合，视力均有提高，其中1眼病毒性角膜溃疡愈合后形成角膜瘢痕，视力降低，3眼真菌性角膜溃疡多次新鲜羊膜移植后未愈合，最终行角膜移植；化学性和热烫伤性角膜溃疡愈合时间较长，视力部分恢复，其中4眼病情较重行羊膜移植失败，最后睑裂暂时性缝合1眼，3眼行角膜移植术。结论羊膜移植术是治疗角膜溃疡疗效较好且经济方便的方法之一。对真菌性角膜溃疡治疗效果一般，尚需角膜移植和抗真菌治疗等方法。     

人羊膜匀浆上清液抑制兔角膜新生血管的研究

目的观察人羊膜匀浆上清液对家兔角膜新生血管（CNV）的抑制作用。方法63只新西兰白兔随机选取3只作为正常对照组,余60只制作双眼碱烧伤模型,随机分为4个组：A组为碱烧伤对照组滴用PBS液,B、C、D组为实验组分别滴用50、200、400μg／mL的羊膜匀浆上清液。术后1、5、7、14、28d每组分别随机处死3只兔子,行组织病理学检查,测量微血管数量、多形核白细胞（PMNL）含量、血管内皮生长因子（VEGF）的表达量。结果碱烧伤1、5、7、14、28d各时间点CNV的生长面积、微血管计数、PMNL浸润、VEGF的表达4个组差异均有统计学意义（P〈0．01）,其中D组均数最小。VEGF、PMNL、微血管计数三者呈正相关（P〈0．01）。结论羊膜匀浆上清液有减轻角膜血管化的作用,呈质量浓度依赖性,质量浓度达到400μg／mL时抑制作用显著增强。